Détection de la mitophagie chez Caenorhabditis elegans et des cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites
Summary
L’exploration de la mitophagie par microscopie électronique, capteurs génétiques et immunofluorescence nécessite un équipement coûteux, du personnel qualifié et un investissement en temps important. Ici, nous démontrons l’efficacité d’un kit de colorant de fluorescence commercial pour quantifier le processus de mitophagie à la fois chez Caenorhabditis elegans et dans une lignée cellulaire de cancer du foie.
Abstract
Les mitochondries sont essentielles à diverses fonctions biologiques, notamment la production d’énergie, le métabolisme des lipides, l’homéostasie du calcium, la biosynthèse de l’hème, la mort cellulaire régulée et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les ROS sont vitales pour les processus biologiques clés. Cependant, lorsqu’ils ne sont pas contrôlés, ils peuvent entraîner des lésions oxydatives, y compris des dommages mitochondriaux. Les mitochondries endommagées libèrent plus de ROS, intensifiant ainsi les lésions cellulaires et l’état de la maladie. Un processus homéostatique appelé autophagie mitochondriale (mitophagie) élimine sélectivement les mitochondries endommagées, qui sont ensuite remplacées par de nouvelles. Il existe plusieurs voies de mitophagie, le critère d’évaluation commun étant la dégradation des mitochondries endommagées dans les lysosomes.
Plusieurs méthodologies, y compris les capteurs génétiques, l’immunofluorescence des anticorps et la microscopie électronique, utilisent ce paramètre pour quantifier la mitophagie. Chaque méthode d’examen de la mitophagie a ses avantages, tels que le ciblage tissulaire/cellulaire spécifique (avec des capteurs génétiques) et un grand détail (avec la microscopie électronique). Cependant, ces méthodes nécessitent souvent des ressources coûteuses, du personnel formé et un long temps de préparation avant l’expérience réelle, par exemple pour créer des animaux transgéniques. Ici, nous présentons une alternative rentable pour mesurer la mitophagie en utilisant des colorants fluorescents disponibles dans le commerce ciblant les mitochondries et les lysosomes. Cette méthode mesure efficacement la mitophagie chez le nématode Caenorhabditis elegans et les cellules hépatiques humaines, ce qui indique son efficacité potentielle dans d’autres systèmes modèles.
Introduction
Les mitochondries sont essentielles pour tous les animaux aérobies, y compris les humains. Ils convertissent l’énergie chimique des biomolécules en adénosine triphosphate (ATP) via la phosphorylation oxydative1, synthétisent l’hème2, dégradent les acides gras par oxydationβ 3, régulent l’homéostasie du calcium4 et du fer5 , contrôlent la mort cellulaire par apoptose6 et génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui jouent un rôle vital dans l’homéostasie redox7. Deux processus complémentaires et opposés maintiennent l’intégrité et le bon fonctionnement des mitochondries : la synthèse de nouveaux composants mitochondriaux (biogenèse) et l’élimination sélective des composants endommagés par l’autophagie mitochondriale (c.-à-d. mitophagie)8.
Plusieurs voies de mitophagie sont médiées par des enzymes, telles que PINK1 / Parkin, et des récepteurs, y compris FUNDC1, FKBP8 et BNIP / NIX 9,10. Notamment, la dégradation sélective des composants mitochondriaux peut se produire indépendamment de la machinerie autophagosome (c’est-à-dire par des vésicules dérivées des mitochondries)11. Cependant, les paramètres des différentes voies de mitophagie sélective sont similaires (c.-à-d. dégradation mitochondriale par les enzymes lysosomales)12,13. Pour cette raison, diverses méthodes d’identification et de mesure de la mitophagie reposent sur la colocalisation des marqueurs mitochondriaux et lysosomales 14,15,16,17 et la diminution des niveaux de protéines mitochondriales / ADN mitochondrial 18.
Vous trouverez ci-dessous une description concise des méthodologies expérimentales existantes pour mesurer la mitophagie dans les cellules animales à l’aide de la microscopie à fluorescence, en mettant l’accent sur la phase finale de la mitophagie.
Biocapteurs de mitophagie
La dégradation mitochondriale se produit dans l’environnement acide du lysosome19. Par conséquent, les composants mitochondriaux, y compris les protéines, subissent un passage d’un pH neutre à un pH acide à la fin du processus de mitophagie. Ce schéma sous-tend le mécanisme d’action de plusieurs biocapteurs mitophagiques, dont mito-Rosella18 et tandem mCherry-GFP-FIS114. Ces capteurs contiennent une protéine de fluorescence verte (GFP) sensible au pH et une protéine de fluorescence rouge (RFP) insensible au pH. Par conséquent, à l’extrémité de la mitophagie, le rapport de fluorescence vert / rouge diminue considérablement en raison de la trempe du fluorophore GFP. Les principales limites de ces capteurs sont (1) le transfert possible d’énergie de résonance de Förster (FRET) entre les fluorophores; (2) le taux de maturation différentiel de la GFP et de la RFP; (3) dissociation entre la GFP et la RFP due au clivage protéolytique du polypeptide qui les relie ; 4) chevauchement fluorescence-émission; et (5) luminosité différentielle du fluorophore et trempe15,16.
Un capteur qui surmonte certaines de ces limitations est le capteur mitochondrialKeima 17. Le capteur mt-Keima (dérivé de la protéine corallienne Keima) affiche un seul pic d’émission (620 nm). Cependant, ses pics d’excitation sont sensibles au pH. En conséquence, il y a une transition d’une excitation verte (440 nm) à une excitation rouge (586 nm) lors du passage d’un pH élevé à un pH acidede 16,17. Un capteur de mitophagie plus récent, Mito-SRAI, a fait progresser le domaine en permettant des mesures dans des échantillons biologiques fixes20. Cependant, malgré les nombreux avantages des capteurs génétiques, tels que la capacité de les exprimer dans des tissus / cellules spécifiques et de les cibler dans des compartiments mitochondriaux distincts, ils ont également des limites. L’une des limites est que les capteurs génétiques doivent être exprimés dans des cellules ou des animaux, ce qui peut prendre beaucoup de temps et de ressources.
De plus, l’expression des capteurs dans les mitochondries elles-mêmes peut influencer la fonction mitochondriale. Par exemple, l’expression de la GFP mitochondriale (mtGFP) dans les muscles de la paroi corporelle du ver C. elegans élargit le réseau mitochondrial21. Ce phénotype dépend de la fonction du facteur de transcription activé par le stress ATFS-1, qui joue un rôle essentiel dans l’activation de la réponse protéique dépliée dans les mitochondries (UPRmt)21. Par conséquent, bien que les biocapteurs mitochondries / mitophagie génétiquement codés soient extrêmement utiles pour surveiller l’homéostasie des mitochondries in vivo, ils peuvent affecter le processus même qu’ils sont conçus pour mesurer.
Mitochondries/anticorps et colorants spécifiques aux lysosomes
Une autre stratégie pour tester la colocalisation mitochondriale/lysosome consiste à utiliser des anticorps contre les protéines mitochondriales/lysosomales, telles que la protéine de la membrane externe mitochondriale TOM20 et la protéine membranaire associée au lysosomal 1 (LAMP1)22. Dans la plupart des cas, les anticorps secondaires conjugués à un fluorophore sont utilisés pour détecter le signal de fluorescence par microscopie. Une autre stratégie consiste à combiner des constructions génétiques avec des colorants mitochondriaux/lysosomaux, comme l’expression d’une construction de fusion LAMP1::GFP dans les cellules tout en les colorant avec un colorant mitochondrial rouge (par exemple, Mitotracker Red)16. Ces méthodologies, bien qu’efficaces, nécessitent des anticorps spécifiques et impliquent souvent de travailler avec des spécimens fixes ou de générer des cellules / animaux transgéniques exprimant des mitochondries / lysosomes marqués par fluorescence.
Nous décrivons ici l’utilisation d’un kit commercial de coloration lysosome/mitochondrie/nucléaire pour évaluer les propriétés activatrices de la mitophagie de la diamine synthétique O,O (octane-1,8-diyl)bis(hydroxylamine), ci-après appelée VL-85023, chez les vers C. elegans et la lignée cellulaire cancéreuse humaine Hep-3B (Figure 1). Le kit de coloration contient un mélange de colorants lysosomales / mitochondriaux / nucléaires ciblés qui colorent spécifiquement ces organites23. Nous avons déjà utilisé ce kit pour démontrer l’activité mitophagie du 1,8 diaminooctane (ci-après dénommé VL-004) chez C. elegans23. Il est important de noter que nous avons validé les résultats du kit de coloration avec le biocapteur mito-Rosella et les mesures qPCR du contenu mitochondrial:nucléaire23. Ce kit de coloration offre les avantages suivants. Tout d’abord, il n’est pas nécessaire de générer des animaux transgéniques ou des cellules exprimant un biocapteur mitochondrial. Par conséquent, nous pouvons étudier des animaux ou des cellules de type sauvage non modifiés et, ainsi, économiser beaucoup de temps, d’argent et de travail. De plus, comme mentionné, l’expression de biocapteurs mitochondriaux peut modifier la fonction mitochondriale. Deuxièmement, le kit est rentable, facile à utiliser et rapide. Troisièmement, bien que nous démontrions la méthode chez C. elegans et les cellules humaines, elle pourrait être modifiée pour d’autres types de cellules et d’organismes.
Cela dit, comme toute méthode, le protocole du kit de coloration présente des inconvénients. Par exemple, l’incubation des vers avec le réactif est effectuée en l’absence de nourriture (nous avons vu que même les bactéries mortes diminuent considérablement l’efficacité de la coloration). Bien que le temps d’incubation soit relativement court, il est possible que même dans ce laps de temps, les réponses homéostatiques puissent être modifiées, y compris la mitophagie. De plus, la liaison des colorants aux protéines ER/mitochondriales/nucléaires et à d’autres biomolécules peut affecter les activités de ces organites. De plus, contrairement à la mesure de la mitophagie avec des capteurs génétiques, nous travaillons avec des vers et des cellules qui ont subi une fixation chimique. Par conséquent, il est impossible de continuer à surveiller les mêmes vers/cellules à différents moments. Par conséquent, nous recommandons de combiner différentes méthodologies pour valider la fonction de la mitophagie dans un processus physiologique particulier. Ci-dessous, nous présentons de nouvelles données démontrant que VL-850 induit une mitophagie robuste chez les vers C. elegans et les cellules Hep-3B. Par conséquent, ces données soutiennent davantage l’hypothèse selon laquelle le VL-850 prolonge la durée de vie de C. elegans et protège C. elegans des dommages oxydatifs par l’induction d’une mitophagie saine . Nous avons utilisé le cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) de l’ionophore protonique, qui est un puissant inducteur de mitophagie24, comme témoin positif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les voies de mitophagie multiples impliquent diverses protéines et biomolécules (par exemple, cardiolipine29). Cependant, le point final de ces voies est similaire – la dégradation des mitochondries par les enzymes lysosomales12,13. En effet, plusieurs méthodes utilisent ce paramètre pour quantifier la mitophagie. Cependant, certaines méthodes, telles que la microscopie électronique, nécessitent l’accès à un équipement coûteu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Gross pour la lecture critique du manuscrit et leurs commentaires et conseils. Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), qui est financé par le National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), pour avoir fourni certaines des souches. Cette recherche a été financée par une subvention de Vitalunga Ltd et de la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 989/19). La figure abstraite graphique (Figure 1) a été générée avec BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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