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Biology

Détection de la mitophagie chez Caenorhabditis elegans et des cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65337
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

Summary

L’exploration de la mitophagie par microscopie électronique, capteurs génétiques et immunofluorescence nécessite un équipement coûteux, du personnel qualifié et un investissement en temps important. Ici, nous démontrons l’efficacité d’un kit de colorant de fluorescence commercial pour quantifier le processus de mitophagie à la fois chez Caenorhabditis elegans et dans une lignée cellulaire de cancer du foie.

Abstract

Les mitochondries sont essentielles à diverses fonctions biologiques, notamment la production d’énergie, le métabolisme des lipides, l’homéostasie du calcium, la biosynthèse de l’hème, la mort cellulaire régulée et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les ROS sont vitales pour les processus biologiques clés. Cependant, lorsqu’ils ne sont pas contrôlés, ils peuvent entraîner des lésions oxydatives, y compris des dommages mitochondriaux. Les mitochondries endommagées libèrent plus de ROS, intensifiant ainsi les lésions cellulaires et l’état de la maladie. Un processus homéostatique appelé autophagie mitochondriale (mitophagie) élimine sélectivement les mitochondries endommagées, qui sont ensuite remplacées par de nouvelles. Il existe plusieurs voies de mitophagie, le critère d’évaluation commun étant la dégradation des mitochondries endommagées dans les lysosomes.

Plusieurs méthodologies, y compris les capteurs génétiques, l’immunofluorescence des anticorps et la microscopie électronique, utilisent ce paramètre pour quantifier la mitophagie. Chaque méthode d’examen de la mitophagie a ses avantages, tels que le ciblage tissulaire/cellulaire spécifique (avec des capteurs génétiques) et un grand détail (avec la microscopie électronique). Cependant, ces méthodes nécessitent souvent des ressources coûteuses, du personnel formé et un long temps de préparation avant l’expérience réelle, par exemple pour créer des animaux transgéniques. Ici, nous présentons une alternative rentable pour mesurer la mitophagie en utilisant des colorants fluorescents disponibles dans le commerce ciblant les mitochondries et les lysosomes. Cette méthode mesure efficacement la mitophagie chez le nématode Caenorhabditis elegans et les cellules hépatiques humaines, ce qui indique son efficacité potentielle dans d’autres systèmes modèles.

Introduction

Les mitochondries sont essentielles pour tous les animaux aérobies, y compris les humains. Ils convertissent l’énergie chimique des biomolécules en adénosine triphosphate (ATP) via la phosphorylation oxydative1, synthétisent l’hème2, dégradent les acides gras par oxydationβ 3, régulent l’homéostasie du calcium4 et du fer5 , contrôlent la mort cellulaire par apoptose6 et génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui jouent un rôle vital dans l’homéostasie redox7. Deux processus complémentaires et opposés maintiennent l’intégrité et le bon fonctionnement des mitochondries : la synthèse de nouveaux composants mitochondriaux (biogenèse) et l’élimination sélective des composants endommagés par l’autophagie mitochondriale (c.-à-d. mitophagie)8.

Plusieurs voies de mitophagie sont médiées par des enzymes, telles que PINK1 / Parkin, et des récepteurs, y compris FUNDC1, FKBP8 et BNIP / NIX 9,10. Notamment, la dégradation sélective des composants mitochondriaux peut se produire indépendamment de la machinerie autophagosome (c’est-à-dire par des vésicules dérivées des mitochondries)11. Cependant, les paramètres des différentes voies de mitophagie sélective sont similaires (c.-à-d. dégradation mitochondriale par les enzymes lysosomales)12,13. Pour cette raison, diverses méthodes d’identification et de mesure de la mitophagie reposent sur la colocalisation des marqueurs mitochondriaux et lysosomales 14,15,16,17 et la diminution des niveaux de protéines mitochondriales / ADN mitochondrial 18.

Vous trouverez ci-dessous une description concise des méthodologies expérimentales existantes pour mesurer la mitophagie dans les cellules animales à l’aide de la microscopie à fluorescence, en mettant l’accent sur la phase finale de la mitophagie.

Biocapteurs de mitophagie
La dégradation mitochondriale se produit dans l’environnement acide du lysosome19. Par conséquent, les composants mitochondriaux, y compris les protéines, subissent un passage d’un pH neutre à un pH acide à la fin du processus de mitophagie. Ce schéma sous-tend le mécanisme d’action de plusieurs biocapteurs mitophagiques, dont mito-Rosella18 et tandem mCherry-GFP-FIS114. Ces capteurs contiennent une protéine de fluorescence verte (GFP) sensible au pH et une protéine de fluorescence rouge (RFP) insensible au pH. Par conséquent, à l’extrémité de la mitophagie, le rapport de fluorescence vert / rouge diminue considérablement en raison de la trempe du fluorophore GFP. Les principales limites de ces capteurs sont (1) le transfert possible d’énergie de résonance de Förster (FRET) entre les fluorophores; (2) le taux de maturation différentiel de la GFP et de la RFP; (3) dissociation entre la GFP et la RFP due au clivage protéolytique du polypeptide qui les relie ; 4) chevauchement fluorescence-émission; et (5) luminosité différentielle du fluorophore et trempe15,16.

Un capteur qui surmonte certaines de ces limitations est le capteur mitochondrialKeima 17. Le capteur mt-Keima (dérivé de la protéine corallienne Keima) affiche un seul pic d’émission (620 nm). Cependant, ses pics d’excitation sont sensibles au pH. En conséquence, il y a une transition d’une excitation verte (440 nm) à une excitation rouge (586 nm) lors du passage d’un pH élevé à un pH acidede 16,17. Un capteur de mitophagie plus récent, Mito-SRAI, a fait progresser le domaine en permettant des mesures dans des échantillons biologiques fixes20. Cependant, malgré les nombreux avantages des capteurs génétiques, tels que la capacité de les exprimer dans des tissus / cellules spécifiques et de les cibler dans des compartiments mitochondriaux distincts, ils ont également des limites. L’une des limites est que les capteurs génétiques doivent être exprimés dans des cellules ou des animaux, ce qui peut prendre beaucoup de temps et de ressources.

De plus, l’expression des capteurs dans les mitochondries elles-mêmes peut influencer la fonction mitochondriale. Par exemple, l’expression de la GFP mitochondriale (mtGFP) dans les muscles de la paroi corporelle du ver C. elegans élargit le réseau mitochondrial21. Ce phénotype dépend de la fonction du facteur de transcription activé par le stress ATFS-1, qui joue un rôle essentiel dans l’activation de la réponse protéique dépliée dans les mitochondries (UPRmt)21. Par conséquent, bien que les biocapteurs mitochondries / mitophagie génétiquement codés soient extrêmement utiles pour surveiller l’homéostasie des mitochondries in vivo, ils peuvent affecter le processus même qu’ils sont conçus pour mesurer.

Mitochondries/anticorps et colorants spécifiques aux lysosomes
Une autre stratégie pour tester la colocalisation mitochondriale/lysosome consiste à utiliser des anticorps contre les protéines mitochondriales/lysosomales, telles que la protéine de la membrane externe mitochondriale TOM20 et la protéine membranaire associée au lysosomal 1 (LAMP1)22. Dans la plupart des cas, les anticorps secondaires conjugués à un fluorophore sont utilisés pour détecter le signal de fluorescence par microscopie. Une autre stratégie consiste à combiner des constructions génétiques avec des colorants mitochondriaux/lysosomaux, comme l’expression d’une construction de fusion LAMP1::GFP dans les cellules tout en les colorant avec un colorant mitochondrial rouge (par exemple, Mitotracker Red)16. Ces méthodologies, bien qu’efficaces, nécessitent des anticorps spécifiques et impliquent souvent de travailler avec des spécimens fixes ou de générer des cellules / animaux transgéniques exprimant des mitochondries / lysosomes marqués par fluorescence.

Nous décrivons ici l’utilisation d’un kit commercial de coloration lysosome/mitochondrie/nucléaire pour évaluer les propriétés activatrices de la mitophagie de la diamine synthétique O,O (octane-1,8-diyl)bis(hydroxylamine), ci-après appelée VL-85023, chez les vers C. elegans et la lignée cellulaire cancéreuse humaine Hep-3B (Figure 1). Le kit de coloration contient un mélange de colorants lysosomales / mitochondriaux / nucléaires ciblés qui colorent spécifiquement ces organites23. Nous avons déjà utilisé ce kit pour démontrer l’activité mitophagie du 1,8 diaminooctane (ci-après dénommé VL-004) chez C. elegans23. Il est important de noter que nous avons validé les résultats du kit de coloration avec le biocapteur mito-Rosella et les mesures qPCR du contenu mitochondrial:nucléaire23. Ce kit de coloration offre les avantages suivants. Tout d’abord, il n’est pas nécessaire de générer des animaux transgéniques ou des cellules exprimant un biocapteur mitochondrial. Par conséquent, nous pouvons étudier des animaux ou des cellules de type sauvage non modifiés et, ainsi, économiser beaucoup de temps, d’argent et de travail. De plus, comme mentionné, l’expression de biocapteurs mitochondriaux peut modifier la fonction mitochondriale. Deuxièmement, le kit est rentable, facile à utiliser et rapide. Troisièmement, bien que nous démontrions la méthode chez C. elegans et les cellules humaines, elle pourrait être modifiée pour d’autres types de cellules et d’organismes.

Cela dit, comme toute méthode, le protocole du kit de coloration présente des inconvénients. Par exemple, l’incubation des vers avec le réactif est effectuée en l’absence de nourriture (nous avons vu que même les bactéries mortes diminuent considérablement l’efficacité de la coloration). Bien que le temps d’incubation soit relativement court, il est possible que même dans ce laps de temps, les réponses homéostatiques puissent être modifiées, y compris la mitophagie. De plus, la liaison des colorants aux protéines ER/mitochondriales/nucléaires et à d’autres biomolécules peut affecter les activités de ces organites. De plus, contrairement à la mesure de la mitophagie avec des capteurs génétiques, nous travaillons avec des vers et des cellules qui ont subi une fixation chimique. Par conséquent, il est impossible de continuer à surveiller les mêmes vers/cellules à différents moments. Par conséquent, nous recommandons de combiner différentes méthodologies pour valider la fonction de la mitophagie dans un processus physiologique particulier. Ci-dessous, nous présentons de nouvelles données démontrant que VL-850 induit une mitophagie robuste chez les vers C. elegans et les cellules Hep-3B. Par conséquent, ces données soutiennent davantage l’hypothèse selon laquelle le VL-850 prolonge la durée de vie de C. elegans et protège C. elegans des dommages oxydatifs par l’induction d’une mitophagie saine . Nous avons utilisé le cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP) de l’ionophore protonique, qui est un puissant inducteur de mitophagie24, comme témoin positif.

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Protocol

NOTE: Pour la commodité des lecteurs, nous avons divisé le protocole en deux parties: l’une se concentre sur le protocole de mesure de la mitophagie chez C. elegans, et l’autre se concentre sur le protocole de mesure de la mitophagie dans les cellules hépatiques. La liste des matériaux se trouve dans le tableau des matériaux fourni.

1. Le protocole C. elegans

  1. Préparation des plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM) et du stock bactérien OP50 d’Escherichia coli
    NOTE: À titre de clarification, bien que nous ayons suivi les protocoles standard pour la préparation des plaques NGM et du stock bactérien OP5025,26, nous reconnaissons qu’il peut y avoir des variations dans ces protocoles entre différents laboratoires. Par conséquent, nous avons inclus les protocoles complets pour assurer une reproduction précise de l’expérience.
    1. Faire un tampon de phosphate de potassium de 1 M, pH 6, en ajoutant ~150 mL de solution de 1 M K 2 HPO 4à 500 mL de solution de 1 M KH2PO4 jusqu’à ce que le pH 6 soit atteint. Stérilisez le tampon en le faisant passer dans un filtre/système de stockage sous vide de 0,22 μm.
    2. Faire 0,1 M de chlorure de calcium (CaCl2) et de sulfate de magnésium (MgSO4), et les stériliser avec un filtre à seringue de 0,2 μm.
    3. Préparer 5 mg/mL de cholestérol dans de l’éthanol absolu.
      REMARQUE: Puisque le cholestérol est préparé dans de l’éthanol, ne le filtrez pas.
    4. Préparer la gélose NGM en dissolvant 1,5 g de chlorure de sodium (NaCl), 1,25 g de peptone et 8,5 g de gélose dans 500 mL d’eau bidistillée (DDW). Autoclave et laisser refroidir à ~55 °C.
    5. Dans des conditions stériles, ajouter 12,5 mL de tampon phosphate de potassium (pH 6), 0,5 mL de 0,1 M CaCl2, 0,5 mL de 0,1 M MgSO4 et 1 mL de 5 mg/mL de cholestérol. Bien mélanger après chaque ajout.
    6. Ajouter 4 mL de gélose NGM fondue à chaque plaque de 35 mm. Laisser la vaisselle solidifier pendant la nuit à température ambiante (RT, ~21 °C).
    7. Pour faire des plaques de gélose Luria-Bertani (LB), dissoudre 5 g de NaCl, 5 g de tryptone, 2,5 g d’extrait de levure et 7,5 g de gélose dans 400 mL d’eau distillée désionisée (DDW), ajuster le pH de la solution à 7,0, porter le volume à 500 mL avec DDW et autoclaver. Une fois la solution refroidie à 55 °C, verser 25 ml du mélange dans chaque boîte de Pétri de 90 mm et laisser sécher les plaques pendant 2 jours à température ambiante. Ensuite, étalez les bactéries OP50 sur les plaques LB séchées du stock de glycérol et incuber à 37 ° C pendant la nuit pour obtenir des colonies uniques.
    8. Préparer 2x tryptone de levure (YT) en dissolvant 8 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 2,5 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 0,5 L de DDW. Ajuster le pH à 7 et autoclaver.
    9. Après refroidissement, inoculer une colonie de bactéries OP50 de la plaque LB fraîchement striée dans 50 ml de milieu YT 2x dans une fiole d’erlenmeyer de 250 ml. Agiter à 37 °C et 250 tr/min jusqu’à obtention d’une densité optique (OD600) d’environ 0,6.
  2. Préparation du véhicule et des plaques expérimentales
    1. Ajouter 100 μL de bactéries OP50 au centre de chaque plaque de gélose NGM de 35 mm. Sécher toute la nuit à TA (température ambiante, 21 °C).
    2. Préparer 0,5 M VL-850 dans du DMSO et diluer à 10 mM VL-850 à l’aide d’un tampon M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42mMNa 2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 et 1 mM MgSO 4)26. Confirmer que le pH est de 7,0 (sinon, titrer avec 0,1 M HCl) et filtrer la solution avec un filtre à seringue de 0,22 μm. Préparez le véhicule comme décrit ci-dessus, mais sans le médicament (dans ce cas, VL-850). Fabriquer 50 mM de FCCP dans du DMSO, diluer à 1 mM de FCCP avec un tampon M9 et stériliser la solution avec un filtre à seringue de 0,22 μm.
    3. Ajouter 25 μL de véhicule (témoin négatif), FCCP (témoin positif; 5 μM) ou VL-850 (traitement expérimental; 62,5 μM) sur des plaques de NGM ensemencées séparément sur la pelouse bactérienne.
    4. Couvrir les plaques de papier d’aluminium et les laisser sécher à TA (température ambiante, 21 °C). Utilisez les plaques après ~16 h.
  3. Obtention synchronisée de C . elegans hermaphrodites chez les jeunes adultes
    1. Faire 1 L de tampon M9 avec 22 mM KH 2 PO 4, 42 mMNa 2HPO4, et 86 mM NaCl. Stériliser à l’autoclave et laisser refroidir. Une fois refroidi, ajouter 1 mL de 1 mM de MgSO4 (0,22 μm stérilisé par filtre).
    2. Mélanger 0,8 mL d’hydroxyde de sodium 2,5 N et 1 mL d’une solution à 5 % d’hypochlorite de sodium avec 2,2 mL de DDW pour créer une solution d’hypochlorite alcalin à 4 mL (concentration finale de 0,5 N pour l’hydroxyde de sodium et de 1,25 % pour l’hypochlorite de sodium).
    3. Recueillir les vers (hermaphrodites gravides) dans un tube conique de 15 ml en lavant les plaques NGM avec 1 mL de tampon M9 3x pour s’assurer que toutes les mères ont été recueillies dans le tube.
    4. Sédimenter les vers par centrifugation à 500 × g pendant 1 min et jeter le surnageant jusqu’à ce qu’il reste un volume de 1 mL.
    5. Ajouter 1 mL de solution alcaline d’hypochlorite et mélanger en retournant le tube 5x. Tourbillonner doucement le tube pendant 3 minutes pour aider à la libération des œufs et observer l’état des vers sous un stéréoscope disséquant.
    6. Lorsqu’environ 50 % des vers sont brisés, ajouter 5 mL de tampon M9 et sédimenter immédiatement les œufs par centrifugation pendant 1 min à 500 × g.
    7. Retirez le surnageant avec précaution sans déranger la pastille. Ajouter 5 ml de tampon M9 et répéter la procédure de lavage 2x.
    8. Retirer le surnageant jusqu’à ce qu’il reste 2 mL et faire pivoter le tube (rotation de 360°) à 20 rpm pendant ~16 h (TR, 21 °C) pour obtenir des larves L1 synchronisées. À partir de ce tube, prenez une goutte de 5 μL sur une lame de verre, comptez le nombre de larves sous un stéréoscope, répétez cette étape 3x, prenez une moyenne des trois comptages et estimez le nombre de vers par microlitre (μL). Sur la base de ces calculs, ajouter ~200 larves par plaque NGM ensemencée avec des bactéries OP50.
    9. Cultiver les larves L1 à 21 °C pendant ~48 h jusqu’au stade de jeune adulte.
  4. Traitement médicamenteux et procédure de microscopie
    1. Mettez 100 vers sur chacune des plaques expérimentales ou témoins. Assurez-vous que les plaques négative, positive et expérimentale contiennent le véhicule, 5 μM FCCP et 62,5 μM VL-850, respectivement. Incuber à 21 °C pendant 6 h.
    2. Utilisez 1 mL de tampon M9 pour laver les vers de chaque plaque dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL. Faites tourner le tube brièvement (~3 s) dans une minicentrifugeuse. Ensuite, jetez le surnageant en pipetant doucement le tampon M9 sans déranger la pastille de vers. Répétez cette étape de lavage 2x, puis retirez doucement le surnageant sans déranger la pastille de vers.
    3. Ajouter 200 μL de tampon M9, qui contient 0,1 % v/v de Poloxamer 188, 0,1 % v/v de Pluronic F127 et 2 μL du réactif du kit de coloration, à la pastille de ver. Laisser tourner le mélange à 20 rpm (rotation à 360°) pendant 1 h à TA (température ambiante, 21 °C). Pour protéger les colorants de la lumière, couvrez les tubes avec du papier d’aluminium.
    4. Faites tourner les vers doucement, comme décrit à l’étape 1.3.4. Ensuite, retirez la solution de coloration sans déranger la pastille de vers. Ensuite, lavez les vers comme décrit à l’étape 1.3.2 et transférez-les dans une plaque de NGM-agar ensemencée contenant le traitement approprié - par exemple, les vers traités avec FCCP sont transférés dans une plaque contenant FCCP. Couvrez les plaques avec du papier d’aluminium, car le réactif de coloration est sensible à la lumière.
      REMARQUE: Nous avons transféré les vers dans des plaques de culture contenant des bactéries et l’agent de traitement correspondant pour minimiser le bruit de fond dû à l’excès de colorant. Par exemple, les vers traités avec FCCP ont été transférés dans des plaques supplémentées en FCCP, et ainsi de suite.
    5. Laver les vers des plaques dans des tubes microcentrifugeux frais à l’aide de 1 mL de tampon M9; Lavez les vers de la même manière 2x. Ensuite, fixez les vers avec 1% de formaldéhyde sur de la glace pendant 30 minutes et lavez les vers avec 1 ml de tampon M9 3x pour éliminer le formaldéhyde résiduel. Après le lavage, faire tourner les vers jusqu’à une pastille et aspirer la quantité maximale de surnageant, en gardant la pastille de ver intacte dans 10 μL de M9.
    6. Pour préparer de l’agarose à 2,5 %, peser 0,125 g d’agarose dans un tube à essai en verre borosilicaté de 10 mL, ajouter 5 mL de tampon M9 et dissoudre l’agarose en chauffant doucement le tube avec un brûleur Bunsen. Transférer l’agarose fondue dans un bain sec réglé à 75 °C et, à l’aide d’un embout de 1 mL, mettre 100 μL d’agarose fondue sur un verre de couverture de microscope Deckgläser (24 mm x 60 mm). Immédiatement, placez une autre lame perpendiculairement sur la goutte d’agarose, formant une forme de croix. Attendez ~2 min, et séparez doucement les lames en poussant (doucement) le verre du couvercle supérieur, laissant ainsi le tampon d’agarose sur la glissière du couvercle inférieur.
      REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous chauffez l’agarose dans le tube et assurez-vous que le tube est tenu loin du corps. Coupez le bord de l’embout de 1 mL pour minimiser la coagulation de l’agarose.
    7. Transférer les vers sur le tampon d’agarose à l’aide d’une pipette en verre Pasteur (c.-à-d. la quantité totale dans le tube, ~10 μL). Retirez l’excès de liquide avec une mèche faite d’une lingette de laboratoire, puis couvrez les vers avec une lame de couverture plus petite (24 mm x 40 mm). Appliquez du vernis à ongles transparent sur la périphérie de la plus petite lame de couverture pour éviter l’évaporation. Placez la diapositive dans une boîte sombre pour la protéger de la lumière.
    8. Utilisez un microscope confocal pour imager les vers dans les 24 heures aux longueurs d’onde appropriées (voir ci-dessous) à l’aide d’une lentille grossissante 60x.
      1. Placez la lame sur la platine du microscope.
      2. Ouvrez le logiciel d’imagerie et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la zone grise du logiciel. Acquisition ouverte | Ti2 Pad complet | Acquisition ND | LUT en cliquant sur les options de la fenêtre contextuelle qui apparaît à la suite du clic droit.
      3. Sous Ti2 Full Pad, sélectionnez 60x.
      4. Sous Acquisition, sélectionnez Oculaire DIA et mettez les vers au point à l’aide du bouton de mise au point fine du microscope. Sous Acquisition, sélectionnez Disque en rotation, puis choisissez l’option 16 bits - Pas de rangement. Pour chaque filtre à fluorescence, réglez le temps d’exposition sur 500 ms et 20 ms pour le fond clair. Une fois ces paramètres définis, sélectionnez Exécuter maintenant et attendez que l’image de sortie soit générée en tant que fichier ND2.
        REMARQUE: Le temps d’exposition doit être déterminé expérimentalement, car différentes configurations d’imagerie ont des caractéristiques différentes. Utilisez des tables de correspondance (LUT) pour examiner l’intensité de fluorescence pour chaque longueur d’onde.
  5. Analyse d’images
    1. Ouvrez les images confocales (ici, les fichiers Nikon ND2) dans ImageJ27 avec le plugin de colocalisation. Chaque fichier ND contient des plans d’image pris à trois longueurs d’onde (en utilisant les filtres DAPI, GFP/FITC [vert] et Texas Red [rouge]) et de la lumière visible. Pour accéder à ces images, ouvrez le fichier ND sur le serveur ImageJ et sélectionnez Fractionner les images dans la boîte de dialogue. Travaillez avec des images en fond clair (BF), de canal vert et de canal rouge.
    2. Générez des doublons de ces images pour garder l’image originale intacte en cliquant sur Image | Dupliquez ou utilisez le raccourci clavier Maj + D.
    3. Pour réduire l’arrière-plan, générez un autre doublon de l’image, comme mentionné ci-dessus. Soustrayez l’arrière-plan avec un rayon de roulement de 100 et sélectionnez l’option Créer un arrière-plan (ne pas soustraire) pour générer une image avec l’arrière-plan de l’image donnée. Ensuite, allez à Processus | Calculatrice d’images et soustrayez la première image dupliquée de la seconde image dupliquée. Utilisez les images résultantes pour l’analyse de colocalisation.
    4. Pour utiliser le plugin de colocalisation, convertissez les images du canal vert et du canal rouge en 8 bits. Pour ce faire, cliquez sur Image | Type | 8 bits.
    5. Cliquez sur Plugins | Colocalisation. Pour mesurer la colocalisation des mitochondries et des signaux lysosomes à l’aide du plugin de colocalisation (voir ci-dessus), utilisez les paramètres suivants : Rapport = 75%, Seuil canal rouge = 80,0, Seuil canal vert = 50,0. La sortie est une image binaire 8 bits contenant des puncta colocalisées et une combinaison des trois images 8 bits (verte, rouge et l’image colocalisée) dans une image RVB.
    6. Concentrez-vous sur la puncta dans le muscle de la tête de la paroi corporelle des vers en sélectionnant manuellement cette zone et en créant un masque en cliquant sur Modifier | Sélection | Créer un masque, qui sélectionne la région d’intérêt (Figure 2A, B). Enlever sélectivement d’autres entités colorées (p. ex., les muscles pharyngés) pour analyser la région musculaire de la tête et de la paroi corporelle.
    7. Pour sélectionner les particules dans la région d’intérêt (ROI), sélectionnez les images 8 bits colocalisées et masquez à l’aide du calculateur d’images. Ensuite, utilisez l’opération AND (Figure 3A) pour sélectionner la poncta dans le ROI. Cela génère une image avec puncta dans le ROI (Figure 3B).
    8. Pour analyser la zone des mitochondries et des lysosomes colocalisés, sélectionnez Analyser | Analyser les particules et mesurer la somme de la poncta entre 0,1625 μm 2 et 4 μm2.

2. Le protocole des cellules cancéreuses Hep-3B

  1. Préparation de la solution mère de médicament
    1. Préparez le VL-850 100 mM dans le DMSO. Diluez-la à 5 mM avec un tampon HEPES 0,5 M, pH 7,3, et stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm. Ensuite, préparez le véhicule comme décrit précédemment, mais sans le médicament (dans ce cas, VL-850).
  2. Culture de cellules Hep-3B pour l’expérience, le traitement médicamenteux et la procédure de microscopie
    1. Cultiver des cellules Hep-3B dans des plaques de culture tissulaire de 10 cm contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 2 % de L-glutamine et 1 % de tétracycline (ci-après appelé DMEM complet). Incuber les cellules à 37 °C et 5% de CO2.
    2. Choisissez une plaque de cellules Hep-3B présentant une confluence cellulaire de 70 % à 80 % (phase de croissance logarithmique), retirez le milieu et lavez la plaque avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée. Retirer le PBS et incuber les cellules avec 1 mL de trypsine 0,25% préchauffée/0,02% EDTA pendant ~3 min à 37 °C; Observez les cellules sous un microscope de culture tissulaire (10x). Arrêter la digestion de la trypsine lorsque les cellules deviennent rondes et commencer à se dissocier de la plaque en ajoutant 5 mL de DMEM complet. Centrifuger les cellules à 1 000 × g pendant 5 minutes, retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 5 mL de DMEM complet.
    3. Déterminez la concentration cellulaire. Mélanger 50 μL de la suspension cellulaire avec 50 μL de bleu de trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou à l’aide d’un hémocytomètre 5x, et prenez une moyenne de ces comptes pour assurer l’exactitude des comptes.
    4. Ensemencer 42 000 cellules Hep3G dans chaque lame-μ 8 puits dans 400 μL de DMEM complet (tel que décrit ci-dessus). Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5% de CO2.
    5. Après 24 h à ~80%-85% de confluence, retirer 250 μL de milieu de chacun des puits et ajouter 50 μL de milieu avec le traitement ou le véhicule approprié. Pour suivre ce protocole, traitez les cellules avec 100 μM VL-850, 5 μM FCCP et un véhicule comme témoin.
    6. Après l’incubation de 6 h avec les composés, ajouter 50 μL de milieu à chaque puits contenant le réactif de coloration (0,5 μL de colorant pour 250 μL dans chaque puits). Incuber les cellules avec le colorant pendant 30 min à 37 °C et 5% de CO2.
      REMARQUE: Comme le réactif de coloration est sensible à la lumière, minimiser l’exposition à la lumière en recouvrant les échantillons de papier d’aluminium et en travaillant dans un environnement faiblement éclairé (si possible).
    7. À l’aide d’une pipette de 200 μL, retirez doucement tout le milieu (250 μL) de chaque puits, puis lavez les cellules avec 200 μL de PBS préchauffé.
    8. Fixer les cellules avec 200 μL de solution de fixation contenant 4% de formaldéhyde et 2,5% de glutaraldéhyde préparé dans du PBS pendant 15 min à TA.
    9. Décanter la solution fixatrice et laver brièvement avec 200 μL de PBS.
    10. Ajouter 200 μL de PBS, garder les cellules couvertes et protégées de la lumière à 4 °C et imager dans les 24 heures.
      REMARQUE: Nous avons utilisé le microscope confocal à disque rotatif dans quatre canaux, y compris DIC, TRITC, FITC et DAPI, comme à l’étape 1.4.8. Nous avons imagé ~300 cellules par traitement.
  3. Analyse d’images
    1. Effectuez les étapes 1.5.1-1.5.5. Pour obtenir le retour sur investissement des cellules, générez une image qui met en évidence la zone des cellules. Pour cela, choisissez une image de points colocalisés (RVB) (Figure 4A). Pour sélectionner toute la zone de cellule, sélectionnez Processus | Binaire | Créer un masque pour obtenir une image binaire (Figure 4B). Pour analyser la zone de la cellule, sélectionnez Analyser | Analysez les particules et mesurez toutes les particules de l’image de 0 à l’infini, ce qui est le paramètre par défaut pour Analyser les particules.
    2. Pour analyser la zone des mitochondries et des lysosomes colocalisés, sélectionnez une image 8 bits colocalisée, convertissez-la en binaire en sélectionnant Traiter | Binaire | Rendre binaire, sélectionnez Analyser | Analyser les particules et mesurer la somme des puncta entre 0,1625μm2 et 4 μm2. Pour mesurer la puncta colocalisée, divisez la surface des mitochondries et des lysosomes colocalisés par la surface cellulaire totale.

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Representative Results

Induction d’une réponse de mitophagie robuste chez les vers C . elegans et les cellules Hep-3B avec VL-850
VL-850 protège les vers C. elegans et les kératinocytes humains (cellules HaCaT) du stress oxydatif23. Pour explorer davantage son mécanisme d’action, nous avons examiné si le VL-850 induit la mitophagie chez C. elegans et d’autres cellules humaines. Pour tester cela, nous avons exposé des vers C. elegans (jeunes adultes, 3 jours après L1) à 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (contrôle positif) et véhicule (témoin négatif) pendant 6 h. Comme décrit ci-dessus, nous avons mesuré la mitophagie à l’aide du réactif de coloration. Nous avons choisi d’utiliser la concentration de 62,5 μM pour VL-850 car elle protège les vers du stress oxydatif et prolonge considérablement leur durée de vie23. Le VL-850 a induit une mitophagie robuste dans les muscles de la tête et de la paroi des vers (Figure 5), indiquant qu’il s’agit d’un puissant inducteur de mitophagie. Il convient de noter que la puissance mitophagique du VL850 était similaire à celle du FCCP (figure 5).

De plus, nous avons effectué une expérience similaire avec des cellules Hep-3B; cette lignée cellulaire provient d’un homme noir de 8 ans atteint d’un carcinome hépatocellulaire primitif (CHC)28. Semblable à l’expérience de C. elegans , nous avons exposé les cellules à 100 μM VL-850, 5 μM FCCP (contrôle positif) et véhicule (témoin négatif) pendant 6 h et utilisé le réactif de coloration pour quantifier la mitophagie. VL-850 et FCCP ont induit une mitophagie significative (dans une mesure similaire) dans les cellules Hep-3B (Figure 6), soutenant davantage notre hypothèse selon laquelle VL-850 est un puissant inducteur de mitophagie dans les cellules de C. elegans et humaines.

Figure 1
Figure 1 : Mesure de la mitophagie dans les cellules C. elegans et Hep-3B. Dessin schématique illustrant l’utilisation du kit de coloration pour mesurer la mitophagie chez les vers C. elegans et les cellules cancéreuses du foie. Abréviations : VL-850 = O,O (octane-1,8-diyl)bis(hydroxylamine); FCCP = cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone; PBS = solution saline tamponnée au phosphate; NGM = milieu de croissance des nématodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Sélection de la région musculaire de la tête et de la paroi du corps d’intérêt chez C. elegans. (A) La région d’intérêt est sélectionnée manuellement et un masque est généré. (B) L’image de masque résultante affiche la principale région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Quantification de la puncta colocalisée dans une région d’intérêt chez C. elegans. (A) Pour sélectionner la puncta dans la région d’intérêt, l’opération « ET » doit être sélectionnée. (B) L’image résultante affiche la puncta dans la région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Sélection de cellules dans une région d’intérêt. (A) Une image de points colocalisés (RVB) est générée après la fonction de colocalisation. (B) Une image de masque qui représente toute la zone cellulaire dans laquelle les puncta doivent être étudiées. Abréviation : RVB = rouge, vert et bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Induction d’une mitophagie robuste chez C. elegans par VL-850. (A) Les pointes de flèches représentent la colocalisation des mitochondries et des lysosomes comme un exemple de colocalisation représentative. L’encart qui a un agrandissement octuple, est fourni pour une meilleure visualisation. Barres d’échelle = 100 μm. (B) La colocalisation a été quantifiée avec trois répétitions biologiques et 30 vers par traitement. La signification des résultats a été déterminée en les comparant aux commandes du véhicule, et les astérisques indiquent une signification statistique. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle non appariée (tests ANOVA de Brown-Forsythe et Welch avec correction de Welch), et une valeur p inférieure à 0,0001 (****p < 0,0001) a été considérée comme statistiquement significative. Abréviation : FCCP = cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Le VL-850 induit une mitophagie significative dans les cellules Hep-3B. (A) Les pointes de flèches montrent la colocalisation des mitochondries et des lysosomes pour représenter la colocalisation, et un encart est inclus pour démontrer la colocalisation à un élargissement octuple. Barres d’échelle = 25 μm. (B) La colocalisation a été quantifiée avec trois répétitions biologiques et N ≥ 411 cellules par traitement (411 se situe dans la plage qui permet une signification statistique et une confiance dans les résultats). Des différences statistiquement significatives ont été évaluées par rapport aux commandes du véhicule, et les astérisques indiquent l’importance. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle non appariée (tests ANOVA de Brown-Forsythe et Welch avec correction de Welch), et une valeur p inférieure à 0,0001 (****p < 0,0001) a été considérée comme statistiquement significative. Abréviation : FCCP = cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les voies de mitophagie multiples impliquent diverses protéines et biomolécules (par exemple, cardiolipine29). Cependant, le point final de ces voies est similaire - la dégradation des mitochondries par les enzymes lysosomales12,13. En effet, plusieurs méthodes utilisent ce paramètre pour quantifier la mitophagie. Cependant, certaines méthodes, telles que la microscopie électronique, nécessitent l’accès à un équipement coûteux, à des experts formés et à un temps de préparation prolongé pour les échantillons et l’analyse. En outre, malgré les avantages de l’utilisation de biocapteurs de mitophagie, qui comprennent la mesure de la mitophagie dans des tissus/cellules/compartiments subcellulaires spécifiques, l’expression de ces capteurs peut modifier la physiologie de la cellule21. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’une méthode fiable, rentable et rapide pour quantifier la mitophagie sans avoir besoin d’interférence à long terme avec la physiologie cellulaire normale.

Ici, nous décrivons une telle méthode, qui implique l’utilisation d’un mélange commercial abordable de cocktail mitochondries / lysosomes / colorants nucléaires. Nous avons récemment démontré son utilité dans la mesure de la mitophagie chez C. elegans et les kératinocytes humains immortalisés (cellules HaCaT)23. Les résultats du kit de coloration ont été validés avec deux biocapteurs, dont mito-Rosella (chez C. elegans) et cox8-mCherry-EGFP (dans les cellules humaines de neuroblastome SH-SY5Y), ainsi que des expériences qPCR qui ont quantifié le rapport entre le contenu de l’ADN mitochondrial et nucléaire et l’expression de plusieurs gènes de mitophagie/autophagie23.

Dans cette étude, nous avons élargi nos recherches pour explorer la puissance activatrice de la mitophagie du VL-850 dans les vers C. elegans et les cellules Hep-3B de l’adénocarcinome hépatique humain. Les résultats montrent que le VL-850 est un puissant inducteur de mitophagie (Figure 5 et Figure 6). Ces résultats confirment les observations précédentes selon lesquelles le VL-850 protège C. elegans du stress oxydatif et prolonge sa durée de vie, tout en induisant la mitophagie dans les cellules HaCat23.

Malgré l’utilité du kit de coloration, il présente certaines limites par rapport aux études sur C. elegans. Tout d’abord, du moins dans les conditions étudiées, nous n’avons pas observé de coloration des dendrites et des axones. Par conséquent, le protocole actuel n’est pas utile pour mesurer la mitophagie dans ces entités neuronales. Deuxièmement, l’autofluorescence intestinale peut interférer avec le signal de fluorescence verte du colorant mitochondrial. Par conséquent, des précautions doivent être prises lors de l’application de cette méthode pour les mesures de mitophagie dans l’intestin. Enfin, et en particulier dans le contexte des lignées cellulaires humaines / rongeurs, le colorant lysosome peut colorer les entités acides dans le noyau. Par conséquent, il est recommandé de titrer empiriquement la concentration de réactif de coloration / temps d’incubation pour chaque lignée cellulaire / composition de milieu.

De plus, comme suggéré ci-dessus, aucune méthode unique n’est suffisante pour démontrer la mitophagie. Par conséquent, nous recommandons la validation des résultats du réactif de coloration à l’aide de méthodes alternatives (par exemple, biocapteurs de mitophagie, qPCR, immunomarquage) et toujours inclure un contrôle de mitophagie positif (par exemple, FCCP). En conclusion, le cocktail de colorants réactifs colorants fournit une méthode fiable et rentable pour quantifier la mitophagie chez C. elegans et les cellules humaines. Compte tenu de la différence significative entre les cellules humaines et les cellules de C. elegans , nous prévoyons que cette méthode pourrait être facilement adaptée à d’autres systèmes animaux.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous remercions les membres du laboratoire Gross pour la lecture critique du manuscrit et leurs commentaires et conseils. Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center (CGC), qui est financé par le National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), pour avoir fourni certaines des souches. Cette recherche a été financée par une subvention de Vitalunga Ltd et de la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 989/19). La figure abstraite graphique (Figure 1) a été générée avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent or resource
Analytical balance Mettler-Toledo
Bacto Agar BD-Difco 214010
Bacto Peptone BD-Difco 211677
Bacto Tryptone BD-Difco 211705
Bacto Yeast extract BD-Difco 212750
Calcium chloride Sigma C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Chemicals
Cholestrol Thermo Fisher C/5360/48
DMEM high glucose Biological Industries 01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
FBS heat inactivated Invitrogen M7514
Gluteradehyde (25%) Sigma G5882
HEPES Buffer 1 M Biological Industries 03-025-1B
L-gluatamine Biological Industries 03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent Abcam ab139487
Magnesium Sulfate Sigma M7506
Nonidet P 40 Sigma 74385
Paraformalydehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15720
Poloxamer 188 Solution Sigma P5556
Potassium dihydrogen phosphate Millipore 1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride Bio-Lab 1903059100
Sodium Hydroxide Gadot 1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate Sigma 4273
Tetracycline hydrochloride Sigma 87128-25G
Trypsin-EDTA Biological Industries 03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter Millex GV SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates Corning 430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB15-500
35 mm Petri dishes Bar Naor BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm Lifegene LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm Marienfeld 101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass Pyrex 99445-13
iBiDi 8 well μ-slides iBiDi 80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm Bar Naor BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire World Precision Instruments PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF DeNovix CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400 Biosan BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software Nikon CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope Olympus SZ61
pH meter Mettler-Toledo MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator Labnet H5600

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References

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Biologie numéro 195 Mitophagie autophagie mitochondriale lysosome Caenorhabditis elegans cellules Hep-3B
Détection de la mitophagie chez <em>Caenorhabditis elegans</em> et des cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites
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Srivastava, V., Gross, E. Detection… More

Srivastava, V., Gross, E. Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes. J. Vis. Exp. (195), e65337, doi:10.3791/65337 (2023).

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