Rilevazione della mitofagia in Caenorhabditis elegans e cellule di mammifero utilizzando coloranti organelli-specifici

Summary

Esplorare la mitofagia attraverso la microscopia elettronica, i sensori genetici e l’immunofluorescenza richiede attrezzature costose, personale qualificato e un investimento di tempo significativo. Qui, dimostriamo l’efficacia di un kit di coloranti a fluorescenza commerciale nel quantificare il processo mitofagico sia in Caenorhabditis elegans che in una linea cellulare di cancro al fegato.

Abstract

I mitocondri sono essenziali per varie funzioni biologiche, tra cui la produzione di energia, il metabolismo lipidico, l’omeostasi del calcio, la biosintesi dell’eme, la morte cellulare regolata e la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). I ROS sono vitali per i processi biologici chiave. Tuttavia, se incontrollati, possono portare a lesioni ossidative, incluso il danno mitocondriale. I mitocondri danneggiati rilasciano più ROS, intensificando così il danno cellulare e lo stato della malattia. Un processo omeostatico chiamato autofagia mitocondriale (mitofagia) rimuove selettivamente i mitocondri danneggiati, che vengono poi sostituiti da nuovi. Esistono molteplici percorsi mitofagici, con l’endpoint comune che è la rottura dei mitocondri danneggiati nei lisosomi.

Diverse metodologie, tra cui sensori genetici, immunofluorescenza anticorpale e microscopia elettronica, utilizzano questo endpoint per quantificare la mitofagia. Ogni metodo per esaminare la mitofagia ha i suoi vantaggi, come il targeting specifico di tessuti / cellule (con sensori genetici) e grande dettaglio (con microscopia elettronica). Tuttavia, questi metodi spesso richiedono risorse costose, personale addestrato e un lungo tempo di preparazione prima dell’esperimento vero e proprio, ad esempio per la creazione di animali transgenici. Qui, presentiamo un’alternativa economica per misurare la mitofagia utilizzando coloranti fluorescenti disponibili in commercio mirati ai mitocondri e ai lisosomi. Questo metodo misura efficacemente la mitofagia nel nematode Caenorhabditis elegans e nelle cellule epatiche umane, il che indica la sua potenziale efficienza in altri sistemi modello.

Introduction

I mitocondri sono essenziali per tutti gli animali aerobici, compresi gli esseri umani. Convertono l’energia chimica delle biomolecole in adenosina trifosfato (ATP) tramite fosforilazione ossidativa¹, sintetizzano l’eme², degradano gli acidi grassi attraverso l’ossidazione β³, regolano l’omeostasi del calcio⁴ e del ferro⁵ , controllano la morte cellulare mediante apoptosi⁶ e generano specie reattive dell’ossigeno (ROS), che svolgono un ruolo vitale nell’omeostasi redox⁷. Due processi complementari e opposti mantengono l’integrità e il corretto funzionamento dei mitocondri: la sintesi di nuovi componenti mitocondriali (biogenesi) e la rimozione selettiva di quelli danneggiati attraverso l’autofagia mitocondriale (cioè la mitofagia)⁸.

Diverse vie mitofagiche sono mediate da enzimi, come PINK1 / Parkin, e recettori, tra cui FUNDC1, FKBP8 e BNIP / NIX ^9,10. In particolare, la degradazione selettiva dei componenti mitocondriali può avvenire indipendentemente dal meccanismo autofagosomico (cioè attraverso vescicole derivate dai mitocondri)¹¹. Tuttavia, gli endpoint delle diverse vie mitofagiche selettive sono simili (cioè degradazione mitocondriale da parte degli enzimi lisosomiali)^12,13. Per questo motivo, vari metodi per identificare e misurare la mitofagia si basano sulla colocalizzazione dei marcatori mitocondriali e lisosomiali 14,15,16,17 e sulla diminuzione dei livelli di proteine mitocondriali/DNA mitocondriale ¹⁸.

Di seguito è riportata una breve descrizione delle metodologie sperimentali esistenti per misurare la mitofagia in cellule animali utilizzando la microscopia a fluorescenza, sottolineando la fase finale della mitofagia.

Biosensori mitofagici
La degradazione mitocondriale si verifica all’interno dell’ambiente acido del lisosoma¹⁹. Pertanto, i componenti mitocondriali, comprese le proteine, sperimentano un passaggio da un pH neutro a uno acido all’estremità del processo mitofagia. Questo modello è alla base del meccanismo d’azione di diversi biosensori mitofagici, tra cui mito-Rosella¹⁸ e tandem mCherry-GFP-FIS1¹⁴. Questi sensori contengono una proteina di fluorescenza verde sensibile al pH (GFP) e una proteina di fluorescenza rossa (RFP) insensibile al pH. Pertanto, all’endpoint della mitofagia, il rapporto di fluorescenza verde-rosso diminuisce significativamente a causa dell’estinzione del fluoroforo GFP. I principali limiti di questi sensori sono (1) il possibile trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra i fluorofori; (2) il tasso di maturazione differenziale di GFP e RFP; (3) dissociazione tra GFP e RFP dovuta alla scissione proteolitica del polipeptide che le collega; (4) sovrapposizione fluorescenza-emissione; e (5) luminosità differenziale del fluoroforo e tempra^15,16.

Un sensore che supera alcune di queste limitazioni è il sensore mitocondriale Keima¹⁷. Il sensore mt-Keima (derivato dalla proteina corallina Keima) visualizza un singolo picco di emissione (620 nm). Tuttavia, i suoi picchi di eccitazione sono sensibili al pH. Di conseguenza, si passa da un’eccitazione verde (440 nm) a una rossa (586 nm) quando si passa da un pH elevato a un pH acido^16,17. Un sensore di mitofagia più recente, Mito-SRAI, ha fatto progredire il campo consentendo misurazioni in campioni biologici fissi²⁰. Tuttavia, nonostante i numerosi vantaggi dei sensori genetici, come la capacità di esprimerli in specifici tessuti / cellule e indirizzarli a compartimenti mitocondriali distinti, hanno anche dei limiti. Una limitazione è che i sensori genetici devono essere espressi nelle cellule o negli animali, il che può richiedere molto tempo e risorse.

Inoltre, l’espressione dei sensori all’interno dei mitocondri stessi può influenzare la funzione mitocondriale. Ad esempio, esprimere la GFP mitocondriale (mtGFP) nei muscoli della parete del corpo del verme C. elegans espande la rete mitocondriale²¹. Questo fenotipo dipende dalla funzione del fattore di trascrizione attivato dallo stress ATFS-1, che svolge un ruolo essenziale nell’attivazione della risposta proteica dispiegata nei mitocondri (UPR^mt)²¹. Pertanto, sebbene i biosensori di mitocondri / mitofagia geneticamente codificati siano estremamente utili per monitorare l’omeostasi dei mitocondri in vivo, possono influenzare il processo stesso che sono progettati per misurare.

Mitocondri/anticorpi e coloranti specifici del lisosoma
Un’altra strategia per testare la colocalizzazione mitocondriale/lisosoma è quella di utilizzare anticorpi contro le proteine mitocondriali/lisosomiali, come la proteina della membrana esterna mitocondriale TOM20 e la proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP1)²². Nella maggior parte dei casi, gli anticorpi secondari coniugati a un fluoroforo vengono utilizzati per rilevare il segnale di fluorescenza tramite microscopia. Un’altra strategia è quella di combinare costrutti genetici con coloranti mitocondriali/lisosomiali, come esprimere un costrutto di fusione LAMP1::GFP nelle cellule mentre le colora con un colorante mitocondriale rosso (ad esempio, Mitotracker Red)¹⁶. Queste metodologie, sebbene efficaci, richiedono anticorpi specifici e spesso implicano il lavoro con campioni fissi o la generazione di cellule / animali transgenici che esprimono mitocondri / lisosomi marcati in modo fluorescente.

Qui, delineiamo l’utilizzo di un kit commerciale di colorazione lisosoma / mitocondri / nucleare per valutare le proprietà attivanti la mitofagia della diammina sintetica O,O (ottano-1,8-diil)bis (idrossilammina), di seguito denominata VL-850²³, nei vermi C. elegans e nella linea cellulare tumorale umana Hep-3B (Figura 1). Il kit di colorazione contiene una miscela di coloranti lisosomiali/mitocondriali/a bersaglio nucleare che colorano specificamente questi organelli²³. In precedenza abbiamo utilizzato questo kit per dimostrare l’attività mitofagica di 1,8 diaminoottano (di seguito denominato VL-004) in C. elegans²³. È importante sottolineare che abbiamo convalidato i risultati del kit di colorazione con il biosensore mito-Rosella e le misurazioni qPCR del contenuto di DNA mitocondriale:nucleare²³. Questo kit di colorazione offre i seguenti vantaggi. In primo luogo, non è necessario generare animali transgenici o cellule che esprimono un biosensore mitocondriale. Pertanto, possiamo studiare animali o cellule selvatiche non modificati e, quindi, risparmiare molto tempo, denaro e lavoro. Inoltre, come detto, l’espressione di biosensori mitocondriali può modificare la funzione mitocondriale. In secondo luogo, il kit è economico, facile da usare e veloce. In terzo luogo, sebbene dimostriamo il metodo in C. elegans e cellule umane, potrebbe essere modificato per altri tipi di cellule e organismi.

Detto questo, come ogni metodo, il protocollo del kit di colorazione presenta degli svantaggi. Ad esempio, l’incubazione dei vermi con il reagente viene effettuata in assenza di cibo (abbiamo visto che anche i batteri morti riducono significativamente l’efficienza di colorazione). Sebbene il tempo di incubazione sia relativamente breve, è possibile che anche in questo lasso di tempo, le risposte omeostatiche possano essere alterate, compresa la mitofagia. Inoltre, il legame dei coloranti alle proteine ER/mitocondriali/nucleari e ad altre biomolecole può influenzare le attività di questi organelli. Inoltre, a differenza della misurazione della mitofagia con sensori genetici, lavoriamo con vermi e cellule che hanno subito una fissazione chimica. Pertanto, è impossibile continuare a monitorare gli stessi worm / cellule in momenti diversi. Quindi, raccomandiamo di combinare diverse metodologie per convalidare la funzione della mitofagia in un particolare processo fisiologico. Di seguito, presentiamo nuovi dati che dimostrano che VL-850 induce una robusta mitofagia nei vermi C. elegans e nelle cellule Hep-3B. Pertanto, questi dati supportano ulteriormente l’ipotesi che VL-850 prolunghi la durata della vita di C. elegans e protegga C. elegans dal danno ossidativo attraverso l’induzione di una mitofagia sana . Abbiamo usato il protone ionoforo carbonil cianuro 4-(trifluorometossi)fenilidrazone (FCCP), che è un potente induttore della mitofagia²⁴, come controllo positivo.

Protocol

NOTA: Per comodità dei lettori, abbiamo diviso il protocollo in due parti: una si concentra sul protocollo per misurare la mitofagia in C. elegans e l’altra si concentra sul protocollo per misurare la mitofagia nelle cellule del fegato. L’elenco dei materiali può essere trovato nella tabella dei materiali fornita. 1. Il protocollo di C. elegans Preparazione delle piastre del terreno di crescita dei nematodi (NGM) e dello stock bat…

Representative Results

Induzione di una robusta risposta mitofagica sia nei vermi C. elegans che nelle cellule Hep-3B con VL-850VL-850 protegge i vermi C. elegans e i cheratinociti umani (cellule HaCaT) dallo stress ossidativo23. Per esplorare ulteriormente il suo meccanismo d’azione, abbiamo esaminato se VL-850 induce mitofagia in C. elegans e altre cellule umane. Per testare questo, abbiamo esposto i vermi C. elegans (giovani adulti, 3 giorni dopo L1) a 62,5 μM…

Discussion

Molteplici vie mitofagiche coinvolgono varie proteine e biomolecole (ad esempio, cardiolipina²⁹). Tuttavia, l’endpoint di queste vie è simile: la degradazione dei mitocondri da parte degli enzimi lisosomiali^12,13. In effetti, diversi metodi utilizzano questo endpoint per quantificare la mitofagia. Tuttavia, alcuni metodi, come la microscopia elettronica, richiedono l’accesso ad attrezzature costose, esperti addestrati e un tempo di prepar…

Materials

Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600