Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Påvisning af mitofagi, i Caenorhabditis elegans og pattedyrceller ved anvendelse af organelspecifikke farvestoffer

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65337
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Udforskning af mitofagi, gennem elektronmikroskopi, genetiske sensorer og immunofluorescens kræver dyrt udstyr, kvalificeret personale og en betydelig tidsinvestering. Her demonstrerer vi effektiviteten af et kommercielt fluorescensfarvesæt til kvantificering af mitofagiprocessen i både Caenorhabditis elegans og en leverkræftcellelinje.

Abstract

Mitokondrier er afgørende for forskellige biologiske funktioner, herunder energiproduktion, lipidmetabolisme, calciumhomeostase, hæmbiosyntese, reguleret celledød og generering af reaktive iltarter (ROS). ROS er afgørende for vigtige biologiske processer. Men når de ikke kontrolleres, kan de føre til oxidativ skade, herunder mitokondrieskader. Beskadigede mitokondrier frigiver mere ROS og derved intensiverer cellulær skade og sygdomstilstanden. En homeostatisk proces ved navn mitokondriel autofagi (mitofagi) fjerner selektivt beskadigede mitokondrier, som derefter erstattes af nye. Der er flere mitofagiveje, hvor det fælles endepunkt er nedbrydningen af de beskadigede mitokondrier i lysosomer.

Flere metoder, herunder genetiske sensorer, antistofimmunofluorescens og elektronmikroskopi, bruger dette endepunkt til at kvantificere mitofagi. Hver metode til undersøgelse af mitofagi, har sine fordele, såsom specifik væv / cellemålretning (med genetiske sensorer) og stor detalje (med elektronmikroskopi). Disse metoder kræver dog ofte dyre ressourcer, uddannet personale og en lang forberedelsestid før selve eksperimentet, såsom til at skabe transgene dyr. Her præsenterer vi et omkostningseffektivt alternativ til måling af mitofagi, ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende farvestoffer rettet mod mitokondrier og lysosomer. Denne metode måler effektivt mitofagien i nematoden Caenorhabditis elegans og humane leverceller, hvilket indikerer dens potentielle effektivitet i andre modelsystemer.

Introduction

Mitokondrier er afgørende for alle aerobe dyr, herunder mennesker. De omdanner biomolekylernes kemiske energi til adenosintrifosfat (ATP) via oxidativ phosphorylering1, syntetiserer hæm2, nedbryder fedtsyrer gennem β oxidation3, regulerer calcium4 og jern5 homeostase, kontrollerer celledød ved apoptose6 og genererer reaktive iltarter (ROS), som spiller en afgørende rolle i redoxhomeostase7. To komplementære og modsatte processer opretholder mitokondriernes integritet og korrekte funktion: syntesen af nye mitokondriekomponenter (biogenese) og selektiv fjernelse af beskadigede gennem mitokondriel autofagi (dvs. mitofagi)8.

Flere mitofagiveje medieres af enzymer, såsom PINK1 / Parkin, og receptorer, herunder FUNDC1, FKBP8 og BNIP / NIX 9,10. Navnlig kan selektiv nedbrydning af mitokondriekomponenter forekomme uafhængigt af autofagosommaskineriet (dvs. gennem mitokondrieafledte vesikler)11. Endepunkterne for de forskellige selektive mitofagiveje er imidlertid ens (dvs. mitokondriel nedbrydning af lysosomale enzymer)12,13. Af denne grund er forskellige metoder til identifikation og måling af mitofagi afhængige af colokalisering af mitokondrie og lysosomale markører 14,15,16,17 og nedsatte niveauer af mitokondrieproteiner / mitokondrie-DNA 18.

Nedenfor er en kortfattet beskrivelse af de eksisterende eksperimentelle metoder til måling af mitofagi, i dyreceller ved hjælp af fluorescensmikroskopi, med vægt på mitofagi-endepunktsfasen.

Mitofagi biosensorer
Mitokondriel nedbrydning forekommer i lysosomets sure miljø19. Derfor oplever mitokondriekomponenter, herunder proteiner, et skift fra en neutral til en sur pH ved mitofagiprocessens endepunkt. Dette mønster understøtter virkningsmekanismen for flere mitofagiske biosensorer, herunder mito-Rosella18 og tandem mCherry-GFP-FIS114. Disse sensorer indeholder et pH-følsomt grønt fluorescensprotein (GFP) og et pH-ufølsomt rødt fluorescensprotein (RFP). Derfor falder det grønne til røde fluorescensforhold betydeligt ved mitofagiens endepunkt på grund af slukningen af GFP-fluoroforen. De største begrænsninger ved disse sensorer er (1) mulig Förster-resonansenergioverførsel (FRET) mellem fluoroforerne; 2) differentiel modningshastighed for god landbrugspraksis og RFP (3) dissociation mellem GFP og RFP på grund af proteolytisk spaltning af polypeptidet, der forbinder dem; 4) overlapning mellem fluorescens og emission og (5) differentiel fluoroforlysstyrke og slukning15,16.

En sensor, der overvinder nogle af disse begrænsninger, er Keima mitokondriesensor17. mt-Keima-sensoren (afledt af koralproteinet Keima) viser en enkelt emissionstop (620 nm). Imidlertid er dens excitationstoppe pH-følsomme. Som et resultat er der en overgang fra en grøn excitation (440 nm) til en rød (586 nm), når der skiftes fra en høj pH til en sur pH16,17. En nyere mitofagisensor, Mito-SRAI, har avanceret feltet ved at muliggøre målinger i faste biologiske prøver20. På trods af de mange fordele ved genetiske sensorer, såsom evnen til at udtrykke dem i specifikke væv / celler og målrette dem mod forskellige mitokondrierum, har de også begrænsninger. En begrænsning er, at de genetiske sensorer skal udtrykkes i celler eller dyr, hvilket kan være tidskrævende og ressourcekrævende.

Derudover kan ekspressionen af sensorerne i mitokondrierne selv påvirke mitokondriefunktionen. For eksempel udvider ekspression af mitokondriel GFP (mtGFP) i C. elegans orm kropsvægsmuskler mitokondrienetværket21. Denne fænotype afhænger af funktionen af den stressaktiverede transkriptionsfaktor ATFS-1, som spiller en væsentlig rolle i aktiveringen af ufoldet proteinrespons i mitokondrier (UPRmt)21. Selvom genetisk kodede mitokondrier / mitofagiske biosensorer er yderst nyttige til overvågning af mitokondrierhomeostase in vivo, kan de derfor påvirke selve processen, de er designet til at måle.

Mitokondrier/lysosomspecifikke antistoffer og farvestoffer
En anden strategi til test af mitokondrie/lysosom-colokalisering er at anvende antistoffer mod mitokondrie/lysosomale proteiner, såsom mitokondrie-ydermembranproteinet TOM20 og lysosomalassocieret membranprotein 1 (LAMP1)22. I de fleste tilfælde anvendes sekundære antistoffer, der konjugeres til en fluorofor, til at detektere fluorescenssignalet via mikroskopi. En anden strategi er at kombinere genetiske konstruktioner med mitokondrie/lysosomale farvestoffer, såsom at udtrykke en LAMP1::GFP-fusionskonstruktion i celler, mens de farves med et rødt mitokondriefarvestof (f.eks. Mitotracker Red)16. Disse metoder, selvom de er effektive, kræver specifikke antistoffer og involverer ofte arbejde med faste prøver eller generering af celler / transgene dyr, der udtrykker fluorescerende mærkede mitokondrier / lysosomer.

Her skitserer vi brugen af et kommercielt lysosom/mitokondrier/nukleart farvningssæt til vurdering af de mitofagiaktiverende egenskaber ved syntetisk diamin O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin), i det følgende benævnt VL-85023, i C. elegans orme og den humane kræftcellelinje Hep-3B (figur 1). Farvningssættet indeholder en blanding af lysosomale / mitokondrie / nukleare-målrettede farvestoffer, der specifikt pletter disse organeller23. Vi har tidligere brugt dette kit til at demonstrere mitofagiaktiviteten af 1,8 diaminooktan (i det følgende benævnt VL-004) i C. elegans23. Det er vigtigt, at vi validerede resultaterne af farvningssættet med mito-Rosella-biosensoren og qPCR-målingerne af mitokondriet: nukleært DNA-indhold23. Dette farvningssæt giver følgende fordele. For det første er der ikke behov for at generere transgene dyr eller celler, der udtrykker en mitokondriel biosensor. Derfor kan vi studere umodificerede vildtypedyr eller celler og dermed spare meget tid, penge og arbejde. Desuden kan ekspression af mitokondrie biosensorer som nævnt ændre mitokondriefunktionen. For det andet er sættet omkostningseffektivt, let at bruge og hurtigt. For det tredje, selvom vi demonstrerer metoden i C. elegans og humane celler, kan den modificeres til andre celletyper og organismer.

Når det er sagt, som enhver metode, har farvningssætprotokollen ulemper. For eksempel udføres inkubationen af ormene med reagenset i fravær af mad (vi har set, at selv døde bakterier signifikant reducerer farvningseffektiviteten). Selvom inkubationstiden er relativt kort, er det muligt, at selv i denne tidsramme kan homeostatiske reaktioner ændres, herunder mitofagi. Derudover kan bindingen af farvestofferne til ER / mitokondrie / nukleare proteiner og andre biomolekyler påvirke aktiviteterne af disse organeller. Desuden arbejder vi i modsætning til mitofagmåling med genetiske sensorer med orme og celler, der har gennemgået kemisk fiksering. Derfor er det umuligt at fortsætte med at overvåge de samme orme / celler på forskellige tidspunkter. Derfor anbefaler vi at kombinere forskellige metoder til at validere funktionen af mitofagi, i en bestemt fysiologisk proces. Nedenfor præsenterer vi nye data, der viser, at VL-850 inducerer robust mitofagi, i C. elegans-orme og Hep-3B-celler. Derfor understøtter disse data yderligere hypotesen om, at VL-850 forlænger levetiden for C. elegans og beskytter C. elegans mod oxidativ skade gennem induktion af sund mitofagi . Vi har brugt protonionoforcarbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazon (FCCP), som er en potent mitofagi-inducer24, som en positiv kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: For læsernes bekvemmelighed har vi opdelt protokollen i to dele: den ene fokuserer på protokollen til måling af mitofagi i C. elegans, og den anden fokuserer på protokollen til måling af mitofagia i leverceller. Listen over materialer findes i tabellen over materialer .

1. C. elegans-protokollen

  1. Forberedelse af nematodevækstmediumpladerne (NGM) og Escherichia coli OP50-bakteriestammen
    BEMÆRK: Som et afklaringspunkt, mens vi fulgte standardprotokoller til fremstilling af NGM-pladerne og OP50-bakterielager25,26, erkender vi, at der kan være variationer i disse protokoller mellem forskellige laboratorier. Derfor har vi inkluderet de komplette protokoller for at sikre nøjagtig replikering af eksperimentet.
    1. Der fremstilles en 1 M kaliumphosphatbuffer, pH 6, ved at tilsætte ~150 ml 1 M K 2 HPO 4 til 500 ml 1 M KH2PO4 opløsning, indtil pH 6 er nået. Steriliser bufferen ved at føre den gennem et 0,22 μm vakuumfilter/opbevaringssystem.
    2. Lav 0,1 M calciumchlorid (CaCl2) og magnesiumsulfat (MgSO4), og steriliser dem med et 0,2 μm sprøjtefilter.
    3. Forbered 5 mg / ml kolesterol i absolut ethanol.
      BEMÆRK: Da kolesterolet fremstilles i ethanol, må du ikke filtrere det.
    4. Forbered NGM-agar ved at opløse 1,5 g natriumchlorid (NaCl), 1,25 g pepton og 8,5 g agar i 500 ml dobbeltdestilleret vand (DDW). Autoklave og lad det køle af til ~55 °C.
    5. Under sterile betingelser tilsættes 12,5 ml kaliumphosphatbuffer (pH 6), 0,5 ml 0,1 MCaCl2, 0,5 ml 0,1 MMgSO4 og 1 ml 5 mg / ml kolesterol. Bland godt efter hver tilsætning.
    6. Der tilsættes 4 ml smeltet NGM-agar til hver 35 mm plade. Lad opvasken stå natten over for at størkne ved stuetemperatur (RT, ~ 21 ° C).
    7. For at fremstille Luria-Bertani (LB) agarplader opløses 5 g NaCl, 5 g trypton, 2,5 g gærekstrakt og 7,5 g agar i 400 ml destilleret, deioniseret vand (DDW), juster opløsningens pH til 7,0, bring volumenet op til 500 ml med DDW og autoklave. Når opløsningen er afkølet til 55 °C, hældes 25 ml af blandingen i hver 90 mm petriskål, og pladerne tørres i 2 dage ved stuetemperatur. Derefter stribes OP50-bakterier ud på de tørrede LB-plader fra glycerollageret og inkuberes ved 37 °C natten over for at opnå enkeltkolonier.
    8. Forbered 2x gærtrypton (YT) ved at opløse 8 g trypton, 5 g gærekstrakt og 2,5 g natriumchlorid (NaCl) i 0,5 liter DDW. Juster pH til 7 og autoklave.
    9. Efter afkøling podes en OP50-bakteriekoloni fra den friskstribede LB-plade i 50 ml 2x YT-medium i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Der rystes ved 37 °C og 250 o/min til en optisk densitet (OD600) på ca. 0,6.
  2. Klargøring af køretøjet og forsøgsplader
    1. Der tilsættes 100 μL OP50-bakterier til midten af hver 35 mm NGM-agarplade. Tør natten over ved RT (stuetemperatur, 21 °C).
    2. Forbered 0,5 M VL-850 i DMSO, og fortynd til 10 mM VL-850 ved hjælp af M9-buffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl,pH 7 og 1 mM MgSO 4)26. Bekræft, at pH-værdien er 7,0 (hvis ikke, titrer den med 0,1 M HCI), og filtrer opløsningen med et 0,22 μm sprøjtefilter. Forbered køretøjet som beskrevet ovenfor, men uden stoffet (i dette tilfælde VL-850). Der fremstilles 50 mM FCCP i DMSO, fortyndes til 1 mM FCCP med M9-buffer, og opløsningen filtreres med et 0,22 μm sprøjtefilter.
    3. Tilføj 25 μL køretøj (negativ kontrol), FCCP (positiv kontrol; 5 μM) eller VL-850 (eksperimentel behandling; 62,5 μM) til separat podede NGM-plader på bakterieplænen.
    4. Dæk pladerne med aluminiumsfolie, og lad dem tørre ved RT (stuetemperatur, 21 °C). Brug pladerne efter ~16 timer.
  3. Opnåelse af synkroniseret ung voksen C. elegans hermafroditter
    1. Lav 1 L M9-buffer med 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 og 86 mM NaCl. Steriliser ved autoklavering, og lad det køle af. Efter afkøling tilsættes 1 ml 1 mMMgSO4 (0,22 μm filtersteriliseret).
    2. Bland 0,8 ml 2,5 N natriumhydroxid og 1 ml af en 5% opløsning af natriumhypochlorit med 2,2 ml DDW for at skabe en 4 ml alkalisk hypochloritopløsning (slutkoncentration på 0,5 N for natriumhydroxid og 1,25% for natriumhypochlorit).
    3. Saml ormene (gravide hermafroditter) i et 15 ml konisk rør ved at vaske NGM-pladerne med 1 ml M9-buffer 3x for at sikre, at alle mødrene er blevet samlet i røret.
    4. Ormene sedimenteres ved centrifugering ved 500 × g i 1 min., og supernatanten kasseres, indtil der er et volumen på 1 ml tilbage.
    5. Tilsæt 1 ml alkalisk hypochloritopløsning, og bland ved at vende røret 5x. Hvirvel forsigtigt røret i 3 minutter for at hjælpe frigivelsen af æg, og observer tilstanden af orme under et dissekerende stereoskop.
    6. Når ca. 50% af ormene er brudt, tilsættes 5 ml M9-buffer og sedimenteres æggene straks ved centrifugering i 1 min ved 500 × g.
    7. Supernatanten fjernes forsigtigt uden at forstyrre pelletsen. Tilsæt 5 ml M9-buffer, og gentag vaskeproceduren 2x.
    8. Supernatanten fjernes, indtil der er 2 ml tilbage, og røret roteres (360° rotation) ved 20 rpm i ~16 timer (RT, 21 °C) for at opnå synkroniserede L1-larver. Fra dette rør skal du tage en dråbe på 5 μL på et glasglas, tælle antallet af larver under et stereoskop, gentage dette trin 3x, tage et gennemsnit af de tre tællinger og estimere antallet af orme pr. Mikroliter (μL). Baseret på disse beregninger tilsættes ~ 200 larver pr. NGM-plade podet med OP50-bakterier.
    9. Dyrk L1-larverne ved 21 °C i ~48 timer indtil det unge voksenstadium.
  4. Narkotikabehandling og mikroskopi procedure
    1. Sæt 100 orme på hver af forsøgs- eller kontrolpladerne. Sørg for, at de negative, positive og eksperimentelle plader indeholder køretøjet, henholdsvis 5 μM FCCP og 62,5 μM VL-850. Der inkuberes ved 21 °C i 6 timer.
    2. Brug 1 ml M9-buffer til at vaske ormene fra hver plade i et 1,7 ml mikrocentrifugerør. Drej røret kort (~3 s) i en minicentrifuge. Derefter kasseres supernatanten ved forsigtigt pipettering af M9-bufferen uden at forstyrre ormpelletten. Gentag dette vasketrin 2x, og fjern derefter forsigtigt supernatanten uden at forstyrre ormpelleten.
    3. Der tilsættes 200 μL M9-buffer, som indeholder 0,1 % v/v Poloxamer 188, 0,1 % v/v Pluronic F127 og 2 μL af farvningssættets reagens, til ormepelletsen. Lad blandingen rotere ved 20 rpm (360 ° rotation) i 1 time ved RT (stuetemperatur, 21 ° C). For at beskytte farvestofferne mod lys skal du dække rørene med aluminiumsfolie.
    4. Drej ormene forsigtigt som beskrevet i trin 1.3.4. Fjern derefter farvningsopløsningen uden at forstyrre ormpelleten. Derefter vaskes ormene som beskrevet i trin 1.3.2 og overføres til en podet NGM-agarplade, der indeholder den passende behandling - for eksempel overføres orme behandlet med FCCP til en plade, der indeholder FCCP. Dæk pladerne med aluminiumsfolie, fordi farvningsreagenset er lysfølsomt.
      BEMÆRK: Vi overførte ormene til dyrkningsplader indeholdende bakterier og det tilsvarende behandlingsmiddel for at minimere baggrundsstøj på grund af overskydende farvestof. For eksempel blev orme behandlet med FCCP overført til FCCP-supplerede plader og så videre.
    5. Ormene vaskes af pladerne i friske mikrocentrifugerør med 1 ml M9-buffer; vask ormene på samme måde 2x. Fastgør derefter ormene med 1% formaldehyd på is i 30 minutter, og vask ormene med 1 ml M9-buffer 3x for at fjerne resterende formaldehyd. Efter vaskningen drejes ormene ned til en pille, og den maksimale mængde supernatant suges op, idet ormepillen holdes intakt i 10 μL M9.
    6. For at forberede 2,5% agarose vejes 0,125 g agarose i et 10 ml borosilikatglas reagensglas, tilsættes 5 ml M9-buffer og opløses agaroseen ved forsigtigt opvarmning af røret med en bunsenbrænder. Den smeltede agarose overføres til et tørt bad, der er indstillet til 75 °C, og med en spids på 1 ml anbringes 100 μL af den smeltede agarose på et dækglas til Deckgläsermikroskopet (24 mm x 60 mm). Sæt straks et andet dias vinkelret på agarosedråben og danner en krydsform. Vent ~ 2 minutter, og adskil forsigtigt diasene ved (forsigtigt) at skubbe det øverste dækglas, så agarosepuden efterlades på bunddækslet.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, mens du opvarmer agarose i røret, og sørg for, at røret holdes væk fra kroppen. Skær kanten af 1 ml spidsen for at minimere koagulering af agarose.
    7. Overfør ormene til agarosepuden med en Pasteur-glaspipette (dvs. hele mængden i røret, ~ 10 μL). Fjern overskydende væske med en væge lavet af en laboratorieserviet, og dæk derefter ormene med et mindre dækglas (24 mm x 40 mm). Påfør gennemsigtig neglelak i periferien af det mindre dæksel for at forhindre fordampning. Sæt diaset i en mørk kasse for at beskytte den mod lys.
    8. Brug et konfokalmikroskop til at afbilde ormene inden for 24 timer ved de passende bølgelængder (se nedenfor) ved hjælp af en 60x forstørrelseslinse.
      1. Placer diaset på mikroskopets scene.
      2. Åbn billedbehandlingssoftwaren, og højreklik på softwarens grå område. Åben erhvervelse | Ti2 fuld pad | ND Opkøb | LUT'er ved at klikke på indstillingerne i pop op-vinduet, der vises som et resultat af højreklikket.
      3. Under Ti2 Full Pad, vælg 60x.
      4. Under Erhvervelse skal du vælge Okular DIA og bringe ormene i fokus ved hjælp af mikroskopets finfokusknap. Under Anskaffelse skal du vælge Roterende disk og vælge indstillingen 16-bit - Ingen binning. For hvert fluorescensfilter skal du indstille eksponeringstiden til 500 ms og 20 ms for Brightfield. Når disse parametre er indstillet, skal du vælge Kør nu og vente på, at outputbilledet genereres som en ND2-fil.
        BEMÆRK: Eksponeringstiden skal bestemmes eksperimentelt, da forskellige billeddannelsesopsætninger har forskellige egenskaber. Brug opslagstabeller (LUT'er) til at undersøge fluorescensintensiteten for hver bølgelængde.
  5. Billedanalyse
    1. Åbn de konfokale billeder (her Nikon ND2-filer) i ImageJ27 med colokaliseringspluginet. Hver ND fil indeholder billedplaner taget ved tre bølgelængder (ved hjælp af DAPI, GFP / FITC [grøn], og Texas Red [rød] filtre) og synligt lys. For at få adgang til disse billeder skal du åbne ND-filen på ImageJ-serveren og vælge Opdel billeder i dialogboksen. Arbejd med brightfield (BF), grøn kanal og røde kanalbilleder.
    2. Generer dubletter af disse billeder for at holde det originale billede uberørt ved at klikke på Billede | Dupliker eller brug tastaturgenvejen Skift + D.
    3. For at reducere baggrunden skal du generere en anden kopi af billedet, som nævnt ovenfor. Træk baggrunden fra med en rullende radius på 100, og vælg indstillingen Opret baggrund (træk ikke fra) for at generere et billede med baggrunden for det givne billede. Gå derefter til Proces | Billedberegner, og træk det første duplikerede billede fra det andet duplikerede billede. Brug de resulterende billeder til colokaliseringsanalysen.
    4. Hvis du vil bruge colokaliseringsplugin'et, skal du konvertere den grønne kanal og de røde kanalbilleder til 8-bit. For at gøre dette skal du klikke på Billede | Type | 8 bit.
    5. Klik på Plugins | Samlokalisering. For at måle colokaliseringen af mitokondrier og lysosomsignaler ved hjælp af colokaliseringspluginet (se ovenfor) skal du bruge følgende parametre: Ratio = 75%, Threshold rød kanal = 80,0, Tærskel grøn kanal = 50,0. Outputtet er et 8-bit binært billede, der indeholder colokaliseret punkteret og en kombination af de tre 8-bit billeder (grøn, rød og det colokaliserede billede) i et RGB-billede.
    6. Fokuser på puncta i ormens hovedkropsvægsmuskel ved manuelt at vælge dette område og oprette en maske ved at klikke på Rediger | Udvælgelse | Opret maske, som vælger det interesseområde (figur 2A, B). Fjern selektivt andre farvede enheder (f.eks. Svælgmusklerne) for at analysere hovedkroppens muskelregion.
    7. For at vælge partiklerne i interesseområdet (ROI) skal du vælge de samlokaliserede 8-bit og maskebilleder ved hjælp af billedberegneren. Brug derefter handlingen AND (figur 3A) til at vælge punkteringen i investeringsafkastet. Dette genererer et billede med punktering i ROI (figur 3B).
    8. Hvis du vil analysere området for de colokaliserede mitokondrier og lysosomer, skal du vælge Analysér | Analyser partikler, og mål summen af puncta mellem 0,1625 μm 2 og 4 μm2.

2. Hep-3B-kræftcelleprotokollen

  1. Forberedelse af lægemiddelstamopløsningen
    1. Forbered 100 mM VL-850 i DMSO. Fortynd det til 5 mM med 0,5 M HEPES-buffer, pH 7,3, og steriliser opløsningen ved hjælp af et 0,22 μm sprøjtefilter. Forbered derefter køretøjet som beskrevet før, men uden stoffet (i dette tilfælde VL-850).
  2. Dyrkning af Hep-3B-celler til eksperimentet, lægemiddelbehandling og mikroskopiprocedure
    1. Dyrk Hep-3B-celler i 10 cm vævskulturplader indeholdende Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 2% L-glutamin og 1% tetracyklin (i det følgende benævnt komplet DMEM). Cellerne inkuberes ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Vælg en plade af Hep-3B-celler, der viser 70% -80% cellesammenløb (logaritmisk vækstfase), fjern mediet, og vask pladen med 5 ml forvarmet fosfatbufret saltvand (PBS). Fjern PBS, og inkuber cellerne med 1 ml forvarmet 0,25% trypsin / 0,02% EDTA i ~ 3 minutter ved 37 ° C; observere cellerne under et vævskulturmikroskop (10x). Stop trypsin fordøjelsen, når cellerne bliver runde og begynde dissociering fra pladen ved at tilføje 5 ml komplet DMEM. Cellerne centrifugeres ved 1.000 × g i 5 minutter, supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 5 ml komplet DMEM.
    3. Bestem cellekoncentrationen. 50 μL af cellesuspensionen blandes med 50 μL trypanblåt. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller eller ved hjælp af et hæmocytometer 5x, og tag et gennemsnit af disse tællinger for at sikre nøjagtigheden af tællingerne.
    4. Seed 42.000 Hep3G-celler i hver 8-brønds μ-slide i 400 μL komplet DMEM (som beskrevet ovenfor). Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
    5. Efter 24 timer ved ~80%-85% sammenløb fjernes 250 μL medium fra hver af hullerne, og der tilsættes 50 μL medium med den passende behandling eller det passende køretøj. For at følge denne protokol skal du behandle cellerne med 100 μM VL-850, 5 μM FCCP og et køretøj som kontrol.
    6. Efter 6 timers inkubation med forbindelserne tilsættes 50 μL medium til hvert hul indeholdende farvningsreagenset (0,5 μL farvestof til 250 μL i hvert hul). Cellerne inkuberes med farvestoffet i 30 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
      BEMÆRK: Da farvningsreagenset er lysfølsomt, skal du minimere eksponeringen for lys ved at dække prøverne med aluminiumsfolie og arbejde i et svagt lysmiljø (hvis det er muligt).
    7. Brug en 200 μL pipette til forsigtigt at fjerne alt mediet (250 μL) fra hvert hul, og vask derefter cellerne med 200 μL forvarmet PBS.
    8. Cellerne fikseres med 200 μL fikseringsopløsning indeholdende 4% formaldehyd og 2,5% glutaraldehyd fremstillet i PBS i 15 minutter ved RT.
    9. Den fikserende opløsning dekanteres, og vaskes kort med 200 μL PBS.
    10. Der tilsættes 200 μL PBS, cellerne holdes tildækket og beskyttet mod lys ved 4 °C, og billedet afbildes inden for 24 timer.
      BEMÆRK: Vi brugte det roterende diskkonfokale mikroskop i fire kanaler, herunder DIC, TRITC, FITC og DAPI, som i trin 1.4.8. Vi afbildede ~ 300 celler pr. Behandling.
  3. Billedanalyse
    1. Udfør trin 1.5.1-1.5.5. For at opnå cellernes ROI skal du generere et billede, der fremhæver celleområdet. Til dette skal du vælge et billede af colokaliserede punkter (RGB) (figur 4A). Hvis du vil markere hele celleområdet, skal du vælge Proces | Binær | Opret maske for at få et binært billede (figur 4B). Hvis du vil analysere området i cellen, skal du vælge Analysér | Analysér partikler, og mål alle partiklerne i billedet fra 0 til uendelig, hvilket er standardindstillingen for Analysér partikler.
    2. Hvis du vil analysere området med de colokaliserede mitokondrier og lysosomer, skal du vælge et colokaliseret 8-bit billede, konvertere det til binært ved at vælge Vælg Proces | Binær | Lav binær, vælg Analysér | Analyser partikler, og mål summen af puncta mellem 0,1625 μm 2 og 4 μm2. For at måle den colokaliserede puncta, divider arealet af de colokaliserede mitokondrier og lysosomer med det samlede celleareal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Induktion af et robust mitofagirespons i både C. elegans-orme og Hep-3B-celler med VL-850
VL-850 beskytter C. elegans orme og humane keratinocytter (HaCaT-celler) mod oxidativ stress23. For yderligere at undersøge dets virkningsmekanisme undersøgte vi, om VL-850 inducerer mitofagi , i C. elegans og andre humane celler. For at teste dette udsatte vi C. elegans orme (unge voksne, 3 dage efter L1) for 62,5 μM VL-850, 5 μM FCCP (positiv kontrol) og køretøj (negativ kontrol) i 6 timer. Som beskrevet ovenfor målte vi mitofagien ved hjælp af farvningsreagenset. Vi valgte at bruge 62,5 μM-koncentrationen til VL-850, fordi den beskytter ormene mod oxidativt stress og forlænger deres levetid betydeligt23. VL-850 inducerede robust mitofagi, i ormenes hovedkrop-vægmuskler (figur 5), hvilket indikerer, at det er en potent mitofagi-inducer. Det skal bemærkes, at mitofagstyrkestyrken af VL850 svarede til FCCP (figur 5).

Desuden udførte vi et lignende eksperiment med Hep-3B-celler; denne cellelinje stammer fra en 8-årig sort mand med primært hepatocellulært karcinom (HCC)28. I lighed med C. elegans-eksperimentet udsatte vi cellerne for 100 μM VL-850, 5 μM FCCP (positiv kontrol) og køretøj (negativ kontrol) i 6 timer og brugte farvningsreagenset til at kvantificere mitofagi. VL-850 og FCCP inducerede signifikant mitofagi, (i samme grad) i Hep-3B-cellerne (figur 6), hvilket yderligere understøtter vores hypotese om, at VL-850 er en potent mitofagi-inducer i både C. elegans og humane celler.

Figure 1
Figur 1: Mitofagmåling i C. elegans og Hep-3B celler. Skematisk tegning, der illustrerer brugen af farvningssættet til måling af mitofagi, i både C. elegans orme og leverkræftceller. Forkortelser: VL-850 = O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin); FCCP = carbonylcyanid 4-(trifluormethix)phenylhydrazon PBS = fosfatbufret saltvand NGM = nematode vækstmedium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Valg af hoved-krop-væg muskelregion af interesse i C. elegans. (A) Det relevante område vælges manuelt, og der genereres en maske. (B) Det resulterende maskebillede viser det vigtigste interesseområde. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af den colokaliserede punktik i en region af interesse for C. elegans. (A) For at vælge punktopstillingen i den pågældende region skal operationen "OG" vælges. (B) Det resulterende billede viser punkteringen i det pågældende område. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Markering af celler i et område af interesse . (A) Der genereres et billede af colokaliserede punkter (RGB) efter colokaliseringsfunktionen. (B) Et maskebillede, der repræsenterer hele celleområdet, hvor punkttegn skal undersøges. Forkortelse: RGB = rød, grøn og blå. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Induktion af robust mitofagi, i C. elegans af VL-850. (A) Pilespidserne viser colokalisering af mitokondrier og lysosomer som et eksempel på repræsentativ colokalisering. Indsatsen, som har en otte gange forstørrelse, er tilvejebragt for bedre visualisering. Skalastænger = 100 μm. (B) Kolokaliseringen blev kvantificeret med tre biologiske gentagelser og 30 orme pr. Behandling. Betydningen af resultaterne blev bestemt ved at sammenligne dem med køretøjets kontroller, og stjernerne angiver statistisk signifikans. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en uparret envejs ANOVA (Brown-Forsythe og Welch ANOVA test med Welchs korrektion), og en p-værdi på mindre end 0,0001 (****p < 0,0001) blev betragtet som statistisk signifikant. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazon. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: VL-850 inducerer signifikant mitofagi i Hep-3B-celler. (A) Pilespidserne viser colokaliseringen af mitokondrier og lysosomer for at repræsentere colokaliseringen, og en indsats er inkluderet for at demonstrere colokaliseringen ved otte gange forstørrelse. Skalastænger = 25 μm. (B) Kolokaliseringen blev kvantificeret med tre biologiske gentagelser og N ≥ 411 celler pr. Behandling (411 falder inden for det interval, der giver mulighed for statistisk signifikans og tillid til resultaterne). Statistisk signifikante forskelle blev vurderet sammenlignet med køretøjskontrollerne, og stjernerne indikerer signifikans. Dataene blev analyseret ved hjælp af en uparret envejs ANOVA (Brown-Forsythe og Welch ANOVA test med Welchs korrektion), og en p-værdi på mindre end 0,0001 (****p < 0,0001) blev betragtet som statistisk signifikant. Forkortelse: FCCP = carbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazon. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere mitofagiveje involverer forskellige proteiner og biomolekyler (f.eks. Cardiolipin29). Imidlertid er endepunktet for disse veje ens - nedbrydningen af mitokondrier med lysosomale enzymer12,13. Faktisk bruger flere metoder dette endepunkt til at kvantificere mitofagi. Nogle metoder, såsom elektronmikroskopi, kræver imidlertid adgang til dyrt udstyr, uddannede eksperter og en forlænget forberedelsestid til prøverne og analysen. På trods af fordelene ved at anvende mitofagiske biosensorer, som omfatter måling af mitofagi i specifikke væv/celler/subcellulære rum, kan ekspressionen af sådanne sensorer desuden ændre cellens fysiologi21. Derfor er der behov for en pålidelig, omkostningseffektiv og hurtig metode til at kvantificere mitofagi, uden behov for langvarig interferens med normal cellefysiologi.

Her beskriver vi en sådan metode, som involverer brugen af en overkommelig kommerciel blanding af mitokondrier / lysosom/nuklear farvestofcocktail. Vi demonstrerede for nylig dets anvendelighed til måling af mitofagier i C. elegans og udødeliggjorte humane keratinocytter (HaCaT-celler)23. Resultaterne af farvningssættet blev valideret med to biosensorer, herunder mito-Rosella (i C. elegans) og cox8-mCherry-EGFP (i humane SH-SY5Y-neuroblastomceller) samt qPCR-eksperimenter, der kvantificerede forholdet mellem mitokondrie- og nukleært DNA-indhold og ekspressionen af flere mitofagi/autofagigener23.

I denne undersøgelse udvidede vi vores forskning til at udforske den mitofagi-aktiverende styrke af VL-850 i C. elegans orme og human lever adenocarcinom Hep-3B celler. Resultaterne viser, at VL-850 er en potent mitofagi-inducer (figur 5 og figur 6). Disse resultater understøtter yderligere de tidligere observationer af, at VL-850 beskytter C. elegans mod oxidativt stress og forlænger deres levetid samt inducerer mitofagier i HaCat-celler23.

På trods af farvningssættets anvendelighed har det nogle begrænsninger med hensyn til C. elegans-undersøgelser. For det første observerede vi i det mindste under de undersøgte betingelser ikke farvning af dendritter og axoner. Derfor er den nuværende protokol ikke nyttig til måling af mitofagi, i disse neuronale enheder. For det andet kan intestinal autofluorescens forstyrre mitokondriefarvestoffets grønne fluorescenssignal. Derfor bør der udvises forsigtighed ved anvendelse af denne metode til mitofagimålinger i tarmen. Endelig, og især i forbindelse med menneskelige / gnavercellelinjer, kan lysosomfarvestoffet plette sure enheder i kernen. Derfor anbefales det empirisk at titrere farvningsreagenskoncentrationen/inkubationstiden empirisk for hver cellelinje/mediumsammensætning.

Desuden er ingen enkelt metode som foreslået ovenfor tilstrækkelig til at demonstrere mitofagi. Derfor anbefaler vi validering af farvningsreagensresultaterne ved hjælp af alternative metoder (f.eks. Mitofagbiosensorer, qPCR, immunfarvning) og inkluderer altid en positiv mitofagikontrol (f.eks. FCCP). Afslutningsvis giver farvningsreagensfarvestofcocktailen en pålidelig og omkostningseffektiv metode til kvantificering af mitofagien i C. elegans og humane celler. I betragtning af den betydelige forskel mellem humane celler og C. elegans-celler forventer vi, at denne metode let kan tilpasses andre dyresystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af Gross-laboratoriet for den kritiske læsning af manuskriptet og deres kommentarer og råd. Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), for at levere nogle af stammerne. Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Vitalunga Ltd og Israel Science Foundation (bevilling nr. 989/19). Den grafiske abstrakte figur (figur 1) blev genereret med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent or resource
Analytical balance Mettler-Toledo
Bacto Agar BD-Difco 214010
Bacto Peptone BD-Difco 211677
Bacto Tryptone BD-Difco 211705
Bacto Yeast extract BD-Difco 212750
Calcium chloride Sigma C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Chemicals
Cholestrol Thermo Fisher C/5360/48
DMEM high glucose Biological Industries 01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
FBS heat inactivated Invitrogen M7514
Gluteradehyde (25%) Sigma G5882
HEPES Buffer 1 M Biological Industries 03-025-1B
L-gluatamine Biological Industries 03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent Abcam ab139487
Magnesium Sulfate Sigma M7506
Nonidet P 40 Sigma 74385
Paraformalydehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15720
Poloxamer 188 Solution Sigma P5556
Potassium dihydrogen phosphate Millipore 1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride Bio-Lab 1903059100
Sodium Hydroxide Gadot 1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate Sigma 4273
Tetracycline hydrochloride Sigma 87128-25G
Trypsin-EDTA Biological Industries 03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter Millex GV SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates Corning 430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB15-500
35 mm Petri dishes Bar Naor BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm Lifegene LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm Marienfeld 101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass Pyrex 99445-13
iBiDi 8 well μ-slides iBiDi 80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm Bar Naor BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire World Precision Instruments PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF DeNovix CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400 Biosan BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software Nikon CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope Olympus SZ61
pH meter Mettler-Toledo MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator Labnet H5600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  26. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Tags

Biologi udgave 195 Mitofagi mitokondriel autofagi lysosom Caenorhabditis elegans Hep-3B celler
Påvisning af mitofagi, i <em>Caenorhabditis elegans</em> og pattedyrceller ved anvendelse af organelspecifikke farvestoffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srivastava, V., Gross, E. Detection… More

Srivastava, V., Gross, E. Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes. J. Vis. Exp. (195), e65337, doi:10.3791/65337 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter