Påvisning af mitofagi, i Caenorhabditis elegans og pattedyrceller ved anvendelse af organelspecifikke farvestoffer
Summary
Udforskning af mitofagi, gennem elektronmikroskopi, genetiske sensorer og immunofluorescens kræver dyrt udstyr, kvalificeret personale og en betydelig tidsinvestering. Her demonstrerer vi effektiviteten af et kommercielt fluorescensfarvesæt til kvantificering af mitofagiprocessen i både Caenorhabditis elegans og en leverkræftcellelinje.
Abstract
Mitokondrier er afgørende for forskellige biologiske funktioner, herunder energiproduktion, lipidmetabolisme, calciumhomeostase, hæmbiosyntese, reguleret celledød og generering af reaktive iltarter (ROS). ROS er afgørende for vigtige biologiske processer. Men når de ikke kontrolleres, kan de føre til oxidativ skade, herunder mitokondrieskader. Beskadigede mitokondrier frigiver mere ROS og derved intensiverer cellulær skade og sygdomstilstanden. En homeostatisk proces ved navn mitokondriel autofagi (mitofagi) fjerner selektivt beskadigede mitokondrier, som derefter erstattes af nye. Der er flere mitofagiveje, hvor det fælles endepunkt er nedbrydningen af de beskadigede mitokondrier i lysosomer.
Flere metoder, herunder genetiske sensorer, antistofimmunofluorescens og elektronmikroskopi, bruger dette endepunkt til at kvantificere mitofagi. Hver metode til undersøgelse af mitofagi, har sine fordele, såsom specifik væv / cellemålretning (med genetiske sensorer) og stor detalje (med elektronmikroskopi). Disse metoder kræver dog ofte dyre ressourcer, uddannet personale og en lang forberedelsestid før selve eksperimentet, såsom til at skabe transgene dyr. Her præsenterer vi et omkostningseffektivt alternativ til måling af mitofagi, ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende farvestoffer rettet mod mitokondrier og lysosomer. Denne metode måler effektivt mitofagien i nematoden Caenorhabditis elegans og humane leverceller, hvilket indikerer dens potentielle effektivitet i andre modelsystemer.
Introduction
Mitokondrier er afgørende for alle aerobe dyr, herunder mennesker. De omdanner biomolekylernes kemiske energi til adenosintrifosfat (ATP) via oxidativ phosphorylering1, syntetiserer hæm2, nedbryder fedtsyrer gennem β oxidation3, regulerer calcium4 og jern5 homeostase, kontrollerer celledød ved apoptose6 og genererer reaktive iltarter (ROS), som spiller en afgørende rolle i redoxhomeostase7. To komplementære og modsatte processer opretholder mitokondriernes integritet og korrekte funktion: syntesen af nye mitokondriekomponenter (biogenese) og selektiv fjernelse af beskadigede gennem mitokondriel autofagi (dvs. mitofagi)8.
Flere mitofagiveje medieres af enzymer, såsom PINK1 / Parkin, og receptorer, herunder FUNDC1, FKBP8 og BNIP / NIX 9,10. Navnlig kan selektiv nedbrydning af mitokondriekomponenter forekomme uafhængigt af autofagosommaskineriet (dvs. gennem mitokondrieafledte vesikler)11. Endepunkterne for de forskellige selektive mitofagiveje er imidlertid ens (dvs. mitokondriel nedbrydning af lysosomale enzymer)12,13. Af denne grund er forskellige metoder til identifikation og måling af mitofagi afhængige af colokalisering af mitokondrie og lysosomale markører 14,15,16,17 og nedsatte niveauer af mitokondrieproteiner / mitokondrie-DNA 18.
Nedenfor er en kortfattet beskrivelse af de eksisterende eksperimentelle metoder til måling af mitofagi, i dyreceller ved hjælp af fluorescensmikroskopi, med vægt på mitofagi-endepunktsfasen.
Mitofagi biosensorer
Mitokondriel nedbrydning forekommer i lysosomets sure miljø19. Derfor oplever mitokondriekomponenter, herunder proteiner, et skift fra en neutral til en sur pH ved mitofagiprocessens endepunkt. Dette mønster understøtter virkningsmekanismen for flere mitofagiske biosensorer, herunder mito-Rosella18 og tandem mCherry-GFP-FIS114. Disse sensorer indeholder et pH-følsomt grønt fluorescensprotein (GFP) og et pH-ufølsomt rødt fluorescensprotein (RFP). Derfor falder det grønne til røde fluorescensforhold betydeligt ved mitofagiens endepunkt på grund af slukningen af GFP-fluoroforen. De største begrænsninger ved disse sensorer er (1) mulig Förster-resonansenergioverførsel (FRET) mellem fluoroforerne; 2) differentiel modningshastighed for god landbrugspraksis og RFP (3) dissociation mellem GFP og RFP på grund af proteolytisk spaltning af polypeptidet, der forbinder dem; 4) overlapning mellem fluorescens og emission og (5) differentiel fluoroforlysstyrke og slukning15,16.
En sensor, der overvinder nogle af disse begrænsninger, er Keima mitokondriesensor17. mt-Keima-sensoren (afledt af koralproteinet Keima) viser en enkelt emissionstop (620 nm). Imidlertid er dens excitationstoppe pH-følsomme. Som et resultat er der en overgang fra en grøn excitation (440 nm) til en rød (586 nm), når der skiftes fra en høj pH til en sur pH16,17. En nyere mitofagisensor, Mito-SRAI, har avanceret feltet ved at muliggøre målinger i faste biologiske prøver20. På trods af de mange fordele ved genetiske sensorer, såsom evnen til at udtrykke dem i specifikke væv / celler og målrette dem mod forskellige mitokondrierum, har de også begrænsninger. En begrænsning er, at de genetiske sensorer skal udtrykkes i celler eller dyr, hvilket kan være tidskrævende og ressourcekrævende.
Derudover kan ekspressionen af sensorerne i mitokondrierne selv påvirke mitokondriefunktionen. For eksempel udvider ekspression af mitokondriel GFP (mtGFP) i C. elegans orm kropsvægsmuskler mitokondrienetværket21. Denne fænotype afhænger af funktionen af den stressaktiverede transkriptionsfaktor ATFS-1, som spiller en væsentlig rolle i aktiveringen af ufoldet proteinrespons i mitokondrier (UPRmt)21. Selvom genetisk kodede mitokondrier / mitofagiske biosensorer er yderst nyttige til overvågning af mitokondrierhomeostase in vivo, kan de derfor påvirke selve processen, de er designet til at måle.
Mitokondrier/lysosomspecifikke antistoffer og farvestoffer
En anden strategi til test af mitokondrie/lysosom-colokalisering er at anvende antistoffer mod mitokondrie/lysosomale proteiner, såsom mitokondrie-ydermembranproteinet TOM20 og lysosomalassocieret membranprotein 1 (LAMP1)22. I de fleste tilfælde anvendes sekundære antistoffer, der konjugeres til en fluorofor, til at detektere fluorescenssignalet via mikroskopi. En anden strategi er at kombinere genetiske konstruktioner med mitokondrie/lysosomale farvestoffer, såsom at udtrykke en LAMP1::GFP-fusionskonstruktion i celler, mens de farves med et rødt mitokondriefarvestof (f.eks. Mitotracker Red)16. Disse metoder, selvom de er effektive, kræver specifikke antistoffer og involverer ofte arbejde med faste prøver eller generering af celler / transgene dyr, der udtrykker fluorescerende mærkede mitokondrier / lysosomer.
Her skitserer vi brugen af et kommercielt lysosom/mitokondrier/nukleart farvningssæt til vurdering af de mitofagiaktiverende egenskaber ved syntetisk diamin O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin), i det følgende benævnt VL-85023, i C. elegans orme og den humane kræftcellelinje Hep-3B (figur 1). Farvningssættet indeholder en blanding af lysosomale / mitokondrie / nukleare-målrettede farvestoffer, der specifikt pletter disse organeller23. Vi har tidligere brugt dette kit til at demonstrere mitofagiaktiviteten af 1,8 diaminooktan (i det følgende benævnt VL-004) i C. elegans23. Det er vigtigt, at vi validerede resultaterne af farvningssættet med mito-Rosella-biosensoren og qPCR-målingerne af mitokondriet: nukleært DNA-indhold23. Dette farvningssæt giver følgende fordele. For det første er der ikke behov for at generere transgene dyr eller celler, der udtrykker en mitokondriel biosensor. Derfor kan vi studere umodificerede vildtypedyr eller celler og dermed spare meget tid, penge og arbejde. Desuden kan ekspression af mitokondrie biosensorer som nævnt ændre mitokondriefunktionen. For det andet er sættet omkostningseffektivt, let at bruge og hurtigt. For det tredje, selvom vi demonstrerer metoden i C. elegans og humane celler, kan den modificeres til andre celletyper og organismer.
Når det er sagt, som enhver metode, har farvningssætprotokollen ulemper. For eksempel udføres inkubationen af ormene med reagenset i fravær af mad (vi har set, at selv døde bakterier signifikant reducerer farvningseffektiviteten). Selvom inkubationstiden er relativt kort, er det muligt, at selv i denne tidsramme kan homeostatiske reaktioner ændres, herunder mitofagi. Derudover kan bindingen af farvestofferne til ER / mitokondrie / nukleare proteiner og andre biomolekyler påvirke aktiviteterne af disse organeller. Desuden arbejder vi i modsætning til mitofagmåling med genetiske sensorer med orme og celler, der har gennemgået kemisk fiksering. Derfor er det umuligt at fortsætte med at overvåge de samme orme / celler på forskellige tidspunkter. Derfor anbefaler vi at kombinere forskellige metoder til at validere funktionen af mitofagi, i en bestemt fysiologisk proces. Nedenfor præsenterer vi nye data, der viser, at VL-850 inducerer robust mitofagi, i C. elegans-orme og Hep-3B-celler. Derfor understøtter disse data yderligere hypotesen om, at VL-850 forlænger levetiden for C. elegans og beskytter C. elegans mod oxidativ skade gennem induktion af sund mitofagi . Vi har brugt protonionoforcarbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazon (FCCP), som er en potent mitofagi-inducer24, som en positiv kontrol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere mitofagiveje involverer forskellige proteiner og biomolekyler (f.eks. Cardiolipin29). Imidlertid er endepunktet for disse veje ens – nedbrydningen af mitokondrier med lysosomale enzymer12,13. Faktisk bruger flere metoder dette endepunkt til at kvantificere mitofagi. Nogle metoder, såsom elektronmikroskopi, kræver imidlertid adgang til dyrt udstyr, uddannede eksperter og en forlænget forberedelsestid til prøverne og analysen. På …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmerne af Gross-laboratoriet for den kritiske læsning af manuskriptet og deres kommentarer og råd. Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), for at levere nogle af stammerne. Denne forskning blev støttet af et tilskud fra Vitalunga Ltd og Israel Science Foundation (bevilling nr. 989/19). Den grafiske abstrakte figur (figur 1) blev genereret med BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
