ऑर्गेनेल-विशिष्ट रंगों का उपयोग करके केनोरहाब्डिस एलिगेंस और स्तनधारी कोशिकाओं में मिटोफैगी का पता लगाना
Summary
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, आनुवंशिक सेंसर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से माइटोफैगी की खोज के लिए महंगे उपकरण, कुशल कर्मियों और एक महत्वपूर्ण समय निवेश की आवश्यकता होती है। यहां, हम केनोरहाब्डिस एलिगेंस और यकृत कैंसर सेल लाइन दोनों में माइटोफैगी प्रक्रिया को निर्धारित करने में एक वाणिज्यिक प्रतिदीप्ति डाई किट की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन, लिपिड चयापचय, कैल्शियम होमियोस्टैसिस, हीम बायोसिंथेसिस, विनियमित कोशिका मृत्यु और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी सहित विभिन्न जैविक कार्यों के लिए आवश्यक हैं। आरओएस प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, अनियंत्रित होने पर, वे माइटोकॉन्ड्रियल क्षति सहित ऑक्सीडेटिव चोट का कारण बन सकते हैं। क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया अधिक आरओएस जारी करते हैं, जिससे सेलुलर चोट और रोग की स्थिति तेज हो जाती है। माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी (माइटोफैगी) नामक एक होमियोस्टैटिक प्रक्रिया चुनिंदा रूप से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटा देती है, जिसे बाद में नए लोगों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। कई माइटोफैगी मार्ग हैं, जिनमें सामान्य समापन बिंदु लाइसोसोम में क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया का टूटना है।
आनुवंशिक सेंसर, एंटीबॉडी इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहित कई पद्धतियां, माइटोफैगी को मापने के लिए इस समापन बिंदु का उपयोग करती हैं। माइटोफैगी की जांच करने के लिए प्रत्येक विधि के अपने फायदे हैं, जैसे कि विशिष्ट ऊतक / सेल लक्ष्यीकरण (आनुवंशिक सेंसर के साथ) और महान विवरण (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ)। हालांकि, इन विधियों को अक्सर महंगे संसाधनों, प्रशिक्षित कर्मियों और वास्तविक प्रयोग से पहले एक लंबी तैयारी के समय की आवश्यकता होती है, जैसे कि ट्रांसजेनिक जानवरों को बनाने के लिए। यहां, हम माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम को लक्षित करने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके माइटोफैगी को मापने के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रस्तुत करते हैं। यह विधि नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस और मानव यकृत कोशिकाओं में माइटोफैगी को प्रभावी ढंग से मापती है, जो अन्य मॉडल प्रणालियों में इसकी संभावित दक्षता को इंगित करती है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया मनुष्यों सहित सभी एरोबिक जानवरों के लिए आवश्यक हैं। वे ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण1 के माध्यम से बायोमोलेक्यूल्स की रासायनिक ऊर्जा को एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) में परिवर्तित करते हैं, हेम2 को संश्लेषित करते हैं, β ऑक्सीकरण3 के माध्यम से फैटी एसिड को नीचा दिखाते हैं, कैल्शियम4 और आयरन5 होमियोस्टैसिस को विनियमित करते हैं, एपोप्टोसिस6 द्वारा कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करते हैं, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) उत्पन्न करते हैं, जो रेडॉक्स होमियोस्टैसिस7 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।. दो पूरक और विपरीत प्रक्रियाएं माइटोकॉन्ड्रिया की अखंडता और उचित कार्य को बनाए रखती हैं: नए माइटोकॉन्ड्रियल घटकों (बायोजेनेसिस) का संश्लेषण और माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी (यानी, माइटोफैगी) के माध्यम से क्षतिग्रस्त लोगों को चुनिंदा हटाना।
कई माइटोफैगी मार्गों को एंजाइमों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, जैसे कि पिंक 1 / पार्किन, और रिसेप्टर्स, जिनमें फंडसी 1, एफकेबीपी 8 और बीएनआईपी / निक्स 9,10 शामिल हैं। विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल घटकों का चयनात्मक क्षरण ऑटोफैगोसोम मशीनरी (यानी, माइटोकॉन्ड्रियल-व्युत्पन्न पुटिकाओं के माध्यम से) से स्वतंत्र रूप से हो सकता है। हालांकि, विभिन्न चयनात्मक माइटोफैगी मार्गों के समापन बिंदु समान हैं (यानी, लाइसोसोमल एंजाइमों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल क्षरण)12,13। इस कारण से, माइटोफैगी की पहचान करने और मापने के विभिन्न तरीके माइटोकॉन्ड्रियल और लाइसोसोमल मार्कर 14,15,16,17 के सह-स्थानीयकरण पर भरोसा करते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन / माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए 18 के स्तर में कमी करते हैं।
नीचे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पशु कोशिकाओं में माइटोफैगी को मापने के लिए मौजूदा प्रयोगात्मक पद्धतियों का संक्षिप्त विवरण दिया गया है, जो माइटोफैगी एंडपॉइंट चरण पर जोर देता है।
माइटोफैगी बायोसेंसर
माइटोकॉन्ड्रियल क्षरण लाइसोसोम19 के अम्लीय वातावरण के भीतर होता है। इसलिए, प्रोटीन सहित माइटोकॉन्ड्रियल घटक, माइटोफैगी प्रक्रिया के समापन बिंदु पर एक तटस्थ से अम्लीय पीएच में बदलाव का अनुभव करते हैं। यह पैटर्न कई माइटोफैगी बायोसेंसर की कार्रवाई के तंत्र को रेखांकित करता है, जिसमें माइटो-रोसेला18 और टेंडम एमचेरी-जीएफपी-एफआईएस 114 शामिल हैं। इन सेंसरों में एक पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) और एक पीएच-असंवेदनशील लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी) होता है। इसलिए, माइटोफैगी के समापन बिंदु पर, जीएफपी फ्लोरोफोरे के शमन के कारण हरे-से-लाल प्रतिदीप्ति अनुपात में काफी गिरावट आती है। इन सेंसरों की प्रमुख सीमाएं हैं (1) फ्लोरोफोरेस के बीच संभावित फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट); (2) जीएफपी और आरएफपी की अंतर परिपक्वता दर; (3) पॉलीपेप्टाइड के प्रोटियोलिटिक दरार के कारण जीएफपी और आरएफपी के बीच पृथक्करण जो उन्हें जोड़ता है; (4) प्रतिदीप्ति-उत्सर्जन ओवरलैप; और (5) अंतर फ्लोरोफोरचमक और शमन15,16।
एक सेंसर जो इन सीमाओं में से कुछ को पार करता है वह है कीमा माइटोकॉन्ड्रियल सेंसर17। एमटी-कीमा सेंसर (कोरल प्रोटीन कीमा से प्राप्त) एक एकल उत्सर्जन शिखर (620 एनएम) प्रदर्शित करता है। हालांकि, इसकी उत्तेजना चोटियां पीएच-संवेदनशील हैं। नतीजतन, उच्च पीएच से अम्लीय पीएच 16,17 में स्थानांतरित होने पर हरे रंग की उत्तेजना (440 एनएम) से लाल (586 एनएम) में संक्रमण होता है। एक और हालिया माइटोफैगी सेंसर, मिटो-एसआरएआई, ने निश्चित जैविक नमूनों में माप की अनुमति देकर क्षेत्र को उन्नत कियाहै। हालांकि, आनुवंशिक सेंसर के कई फायदों के बावजूद, जैसे कि विशिष्ट ऊतकों / कोशिकाओं में उन्हें व्यक्त करने और उन्हें अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रियल डिब्बों में लक्षित करने की क्षमता, उनकी सीमाएं भी हैं। एक सीमा यह है कि आनुवंशिक सेंसर को कोशिकाओं या जानवरों में व्यक्त करने की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और संसाधन-गहन हो सकती है।
इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सेंसर की अभिव्यक्ति स्वयं माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस वर्म बॉडी वॉल मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल जीएफपी (एमटीजीएफपी) को व्यक्त करना माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क21 का विस्तार करता है। यह फेनोटाइप तनाव-सक्रिय प्रतिलेखन कारक एटीएफएस -1 के कार्य पर निर्भर करता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया (यूपीआरएमटी) 21 में अनफोल्डेड प्रोटीन प्रतिक्रिया के सक्रियण में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। इसलिए, हालांकि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड माइटोकॉन्ड्रिया / माइटोफैगी बायोसेंसर विवो में माइटोकॉन्ड्रिया होमियोस्टैसिस की निगरानी के लिए बेहद उपयोगी हैं, वे उस प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं जिसे वे मापने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।
माइटोकॉन्ड्रिया/ लाइसोसोम-विशिष्ट एंटीबॉडी और रंजक
लाइसोसोम कोलोकलाइजेशन के परीक्षण के लिए एक और रणनीति माइटोकॉन्ड्रियल / लाइसोसोमल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करना है, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली प्रोटीन टीओएम 20 और लाइसोसोमल से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (एलएएमपी 1)22। ज्यादातर मामलों में, द्वितीयक एंटीबॉडी जो एक फ्लोरोफोरे से संयुग्मित होते हैं, का उपयोग माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए किया जाता है। लाइसोसोमल रंगों के साथ आनुवंशिक संरचनाओं को संयोजित करना है, जैसे कि एलएएमपी 1:: जीएफपी संलयन निर्माण को कोशिकाओं में व्यक्त करना जबकि उन्हें लाल माइटोकॉन्ड्रियल डाई (जैसे, मिटोट्रैकर रेड) 16 के साथ धुंधला करना। इन पद्धतियों को, जबकि प्रभावी होने पर, विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है और अक्सर निश्चित नमूनों के साथ काम करना या कोशिकाओं / ट्रांसजेनिक जानवरों को फ्लोरोसेंटली लेबल माइटोकॉन्ड्रिया / लाइसोसोम व्यक्त करना शामिल होता है।
यहां, हम सिंथेटिक डायमाइन ओ, ओ (ऑक्टेन -1,8-डाइल) बीआईएस (हाइड्रॉक्सिलमाइन) के माइटोफैगी-सक्रिय गुणों का आकलन करने के लिए एक वाणिज्यिक लाइसोसोम / माइटोकॉन्ड्रिया / परमाणु धुंधला किट के उपयोग को रेखांकित करते हैं, जिसे बाद में सी एलिगेंस कीड़े और मानव कैंसर सेल लाइन हेप -3 बी (चित्रा 1) में वीएल -85023 के रूप में संदर्भित किया जाता है। धुंधला किट में लाइसोसोमल / माइटोकॉन्ड्रियल / परमाणु-लक्षित रंगों का मिश्रण होता है जो विशेष रूप से इन ऑर्गेनेल23 को दाग देते हैं। हमने पहले सी एलिगेंस23 में 1,8 डायमिनोऑक्टेन (इसके बाद वीएल -004 के रूप में संदर्भित) की माइटोफैगी गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए इस किट का उपयोग किया था। महत्वपूर्ण रूप से, हमने माइटो-रोसेला बायोसेंसर और माइटोकॉन्ड्रियल: परमाणु डीएनए सामग्री23 के क्यूपीसीआर माप के साथ धुंधला किट परिणामों को मान्य किया। यह धुंधला किट निम्नलिखित लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जानवरों या कोशिकाओं को उत्पन्न करने की कोई आवश्यकता नहीं है। इसलिए, हम असंशोधित जंगली-प्रकार के जानवरों या कोशिकाओं का अध्ययन कर सकते हैं और इस प्रकार, बहुत समय, धन और श्रम बचा सकते हैं। इसके अलावा, जैसा कि उल्लेख किया गया है, माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर व्यक्त करना माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बदल सकता है। दूसरा, किट लागत प्रभावी, उपयोग में आसान और तेज़ है। तीसरा, हालांकि हम सी एलिगेंस और मानव कोशिकाओं में विधि का प्रदर्शन करते हैं, इसे अन्य सेल प्रकारों और जीवों के लिए संशोधित किया जा सकता है।
इसके साथ ही, किसी भी विधि की तरह, धुंधला किट प्रोटोकॉल में कमियां हैं। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक के साथ कीड़े का इनक्यूबेशन भोजन की अनुपस्थिति में किया जाता है (हमने देखा है कि मृत बैक्टीरिया भी धुंधला दक्षता को काफी कम कर देते हैं)। यद्यपि इनक्यूबेशन समय अपेक्षाकृत कम है, यह संभव है कि इस समय सीमा में भी, होमोस्टैटिक प्रतिक्रियाओं को बदल दिया जा सकता है, जिसमें माइटोफैगी भी शामिल है। इसके अलावा, ईआर / माइटोकॉन्ड्रियल / परमाणु प्रोटीन और अन्य बायोमोलेक्यूल्स के लिए रंगों का बंधन इन ऑर्गेनेल की गतिविधियों को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, आनुवंशिक सेंसर के साथ माइटोफैगी माप के विपरीत, हम कीड़े और कोशिकाओं के साथ काम करते हैं जो रासायनिक निर्धारण से गुजरे हैं। इसलिए, अलग-अलग समय पर एक ही कीड़े / कोशिकाओं की निगरानी जारी रखना असंभव है। इसलिए, हम एक विशेष शारीरिक प्रक्रिया में माइटोफैगी के कार्य को मान्य करने के लिए विभिन्न पद्धतियों के संयोजन की सलाह देते हैं। नीचे, हम नए डेटा प्रस्तुत करते हैं जो दर्शाता है कि वीएल -850 सी एलिगेंस कीड़े और हेप -3 बी कोशिकाओं में मजबूत माइटोफैगी को प्रेरित करता है। इसलिए, ये डेटा इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि वीएल -850 सी एलिगेंस के जीवनकाल को बढ़ाता है और स्वस्थ माइटोफैगी के प्रेरण के माध्यम से सी एलिगेंस को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाता है। हमने प्रोटॉन आयोनोफोर कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) का उपयोग किया है, जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक शक्तिशाली माइटोफैगी इंड्यूसर24 है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई माइटोफैगी मार्गों में विभिन्न प्रोटीन और बायोमोलेक्यूल्स शामिल होते हैं (उदाहरण के लिए, कार्डियोलिपिन29)। हालांकि, इन मार्गों का समापन बिंदु समान है- लाइसोसोमल एंजाइम12,13<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन और उनकी टिप्पणियों और सलाह के लिए सकल प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) को धन्यवाद देते हैं, जिसे कुछ उपभेदों को प्रदान करने के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। इस शोध को विटालुंगा लिमिटेड और इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 989/19) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ग्राफिकल अमूर्त आंकड़ा (चित्रा 1) BioRender.com के साथ उत्पन्न किया गया था।
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
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