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Biology

ऑर्गेनेल-विशिष्ट रंगों का उपयोग करके केनोरहाब्डिस एलिगेंस और स्तनधारी कोशिकाओं में मिटोफैगी का पता लगाना

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65337
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

Summary

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, आनुवंशिक सेंसर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से माइटोफैगी की खोज के लिए महंगे उपकरण, कुशल कर्मियों और एक महत्वपूर्ण समय निवेश की आवश्यकता होती है। यहां, हम केनोरहाब्डिस एलिगेंस और यकृत कैंसर सेल लाइन दोनों में माइटोफैगी प्रक्रिया को निर्धारित करने में एक वाणिज्यिक प्रतिदीप्ति डाई किट की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करते हैं।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन, लिपिड चयापचय, कैल्शियम होमियोस्टैसिस, हीम बायोसिंथेसिस, विनियमित कोशिका मृत्यु और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पीढ़ी सहित विभिन्न जैविक कार्यों के लिए आवश्यक हैं। आरओएस प्रमुख जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, अनियंत्रित होने पर, वे माइटोकॉन्ड्रियल क्षति सहित ऑक्सीडेटिव चोट का कारण बन सकते हैं। क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया अधिक आरओएस जारी करते हैं, जिससे सेलुलर चोट और रोग की स्थिति तेज हो जाती है। माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी (माइटोफैगी) नामक एक होमियोस्टैटिक प्रक्रिया चुनिंदा रूप से क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया को हटा देती है, जिसे बाद में नए लोगों द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। कई माइटोफैगी मार्ग हैं, जिनमें सामान्य समापन बिंदु लाइसोसोम में क्षतिग्रस्त माइटोकॉन्ड्रिया का टूटना है।

आनुवंशिक सेंसर, एंटीबॉडी इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सहित कई पद्धतियां, माइटोफैगी को मापने के लिए इस समापन बिंदु का उपयोग करती हैं। माइटोफैगी की जांच करने के लिए प्रत्येक विधि के अपने फायदे हैं, जैसे कि विशिष्ट ऊतक / सेल लक्ष्यीकरण (आनुवंशिक सेंसर के साथ) और महान विवरण (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ)। हालांकि, इन विधियों को अक्सर महंगे संसाधनों, प्रशिक्षित कर्मियों और वास्तविक प्रयोग से पहले एक लंबी तैयारी के समय की आवश्यकता होती है, जैसे कि ट्रांसजेनिक जानवरों को बनाने के लिए। यहां, हम माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम को लक्षित करने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके माइटोफैगी को मापने के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रस्तुत करते हैं। यह विधि नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस और मानव यकृत कोशिकाओं में माइटोफैगी को प्रभावी ढंग से मापती है, जो अन्य मॉडल प्रणालियों में इसकी संभावित दक्षता को इंगित करती है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया मनुष्यों सहित सभी एरोबिक जानवरों के लिए आवश्यक हैं। वे ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण1 के माध्यम से बायोमोलेक्यूल्स की रासायनिक ऊर्जा को एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) में परिवर्तित करते हैं, हेम2 को संश्लेषित करते हैं, β ऑक्सीकरण3 के माध्यम से फैटी एसिड को नीचा दिखाते हैं, कैल्शियम4 और आयरन5 होमियोस्टैसिस को विनियमित करते हैं, एपोप्टोसिस6 द्वारा कोशिका मृत्यु को नियंत्रित करते हैं, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) उत्पन्न करते हैं, जो रेडॉक्स होमियोस्टैसिस7 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।. दो पूरक और विपरीत प्रक्रियाएं माइटोकॉन्ड्रिया की अखंडता और उचित कार्य को बनाए रखती हैं: नए माइटोकॉन्ड्रियल घटकों (बायोजेनेसिस) का संश्लेषण और माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी (यानी, माइटोफैगी) के माध्यम से क्षतिग्रस्त लोगों को चुनिंदा हटाना।

कई माइटोफैगी मार्गों को एंजाइमों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है, जैसे कि पिंक 1 / पार्किन, और रिसेप्टर्स, जिनमें फंडसी 1, एफकेबीपी 8 और बीएनआईपी / निक्स 9,10 शामिल हैं। विशेष रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल घटकों का चयनात्मक क्षरण ऑटोफैगोसोम मशीनरी (यानी, माइटोकॉन्ड्रियल-व्युत्पन्न पुटिकाओं के माध्यम से) से स्वतंत्र रूप से हो सकता है। हालांकि, विभिन्न चयनात्मक माइटोफैगी मार्गों के समापन बिंदु समान हैं (यानी, लाइसोसोमल एंजाइमों द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल क्षरण)12,13। इस कारण से, माइटोफैगी की पहचान करने और मापने के विभिन्न तरीके माइटोकॉन्ड्रियल और लाइसोसोमल मार्कर 14,15,16,17 के सह-स्थानीयकरण पर भरोसा करते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन / माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए 18 के स्तर में कमी करते हैं।

नीचे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पशु कोशिकाओं में माइटोफैगी को मापने के लिए मौजूदा प्रयोगात्मक पद्धतियों का संक्षिप्त विवरण दिया गया है, जो माइटोफैगी एंडपॉइंट चरण पर जोर देता है।

माइटोफैगी बायोसेंसर
माइटोकॉन्ड्रियल क्षरण लाइसोसोम19 के अम्लीय वातावरण के भीतर होता है। इसलिए, प्रोटीन सहित माइटोकॉन्ड्रियल घटक, माइटोफैगी प्रक्रिया के समापन बिंदु पर एक तटस्थ से अम्लीय पीएच में बदलाव का अनुभव करते हैं। यह पैटर्न कई माइटोफैगी बायोसेंसर की कार्रवाई के तंत्र को रेखांकित करता है, जिसमें माइटो-रोसेला18 और टेंडम एमचेरी-जीएफपी-एफआईएस 114 शामिल हैं। इन सेंसरों में एक पीएच-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरेसेंस प्रोटीन (जीएफपी) और एक पीएच-असंवेदनशील लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन (आरएफपी) होता है। इसलिए, माइटोफैगी के समापन बिंदु पर, जीएफपी फ्लोरोफोरे के शमन के कारण हरे-से-लाल प्रतिदीप्ति अनुपात में काफी गिरावट आती है। इन सेंसरों की प्रमुख सीमाएं हैं (1) फ्लोरोफोरेस के बीच संभावित फॉस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट); (2) जीएफपी और आरएफपी की अंतर परिपक्वता दर; (3) पॉलीपेप्टाइड के प्रोटियोलिटिक दरार के कारण जीएफपी और आरएफपी के बीच पृथक्करण जो उन्हें जोड़ता है; (4) प्रतिदीप्ति-उत्सर्जन ओवरलैप; और (5) अंतर फ्लोरोफोरचमक और शमन15,16।

एक सेंसर जो इन सीमाओं में से कुछ को पार करता है वह है कीमा माइटोकॉन्ड्रियल सेंसर17। एमटी-कीमा सेंसर (कोरल प्रोटीन कीमा से प्राप्त) एक एकल उत्सर्जन शिखर (620 एनएम) प्रदर्शित करता है। हालांकि, इसकी उत्तेजना चोटियां पीएच-संवेदनशील हैं। नतीजतन, उच्च पीएच से अम्लीय पीएच 16,17 में स्थानांतरित होने पर हरे रंग की उत्तेजना (440 एनएम) से लाल (586 एनएम) में संक्रमण होता है। एक और हालिया माइटोफैगी सेंसर, मिटो-एसआरएआई, ने निश्चित जैविक नमूनों में माप की अनुमति देकर क्षेत्र को उन्नत कियाहै। हालांकि, आनुवंशिक सेंसर के कई फायदों के बावजूद, जैसे कि विशिष्ट ऊतकों / कोशिकाओं में उन्हें व्यक्त करने और उन्हें अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रियल डिब्बों में लक्षित करने की क्षमता, उनकी सीमाएं भी हैं। एक सीमा यह है कि आनुवंशिक सेंसर को कोशिकाओं या जानवरों में व्यक्त करने की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और संसाधन-गहन हो सकती है।

इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सेंसर की अभिव्यक्ति स्वयं माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस वर्म बॉडी वॉल मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल जीएफपी (एमटीजीएफपी) को व्यक्त करना माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क21 का विस्तार करता है। यह फेनोटाइप तनाव-सक्रिय प्रतिलेखन कारक एटीएफएस -1 के कार्य पर निर्भर करता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया (यूपीआरएमटी) 21 में अनफोल्डेड प्रोटीन प्रतिक्रिया के सक्रियण में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। इसलिए, हालांकि आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड माइटोकॉन्ड्रिया / माइटोफैगी बायोसेंसर विवो में माइटोकॉन्ड्रिया होमियोस्टैसिस की निगरानी के लिए बेहद उपयोगी हैं, वे उस प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं जिसे वे मापने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं।

माइटोकॉन्ड्रिया/ लाइसोसोम-विशिष्ट एंटीबॉडी और रंजक
लाइसोसोम कोलोकलाइजेशन के परीक्षण के लिए एक और रणनीति माइटोकॉन्ड्रियल / लाइसोसोमल प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करना है, जैसे कि माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली प्रोटीन टीओएम 20 और लाइसोसोमल से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (एलएएमपी 1)22। ज्यादातर मामलों में, द्वितीयक एंटीबॉडी जो एक फ्लोरोफोरे से संयुग्मित होते हैं, का उपयोग माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए किया जाता है। लाइसोसोमल रंगों के साथ आनुवंशिक संरचनाओं को संयोजित करना है, जैसे कि एलएएमपी 1:: जीएफपी संलयन निर्माण को कोशिकाओं में व्यक्त करना जबकि उन्हें लाल माइटोकॉन्ड्रियल डाई (जैसे, मिटोट्रैकर रेड) 16 के साथ धुंधला करना। इन पद्धतियों को, जबकि प्रभावी होने पर, विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है और अक्सर निश्चित नमूनों के साथ काम करना या कोशिकाओं / ट्रांसजेनिक जानवरों को फ्लोरोसेंटली लेबल माइटोकॉन्ड्रिया / लाइसोसोम व्यक्त करना शामिल होता है।

यहां, हम सिंथेटिक डायमाइन ओ, ओ (ऑक्टेन -1,8-डाइल) बीआईएस (हाइड्रॉक्सिलमाइन) के माइटोफैगी-सक्रिय गुणों का आकलन करने के लिए एक वाणिज्यिक लाइसोसोम / माइटोकॉन्ड्रिया / परमाणु धुंधला किट के उपयोग को रेखांकित करते हैं, जिसे बाद में सी एलिगेंस कीड़े और मानव कैंसर सेल लाइन हेप -3 बी (चित्रा 1) में वीएल -85023 के रूप में संदर्भित किया जाता है। धुंधला किट में लाइसोसोमल / माइटोकॉन्ड्रियल / परमाणु-लक्षित रंगों का मिश्रण होता है जो विशेष रूप से इन ऑर्गेनेल23 को दाग देते हैं। हमने पहले सी एलिगेंस23 में 1,8 डायमिनोऑक्टेन (इसके बाद वीएल -004 के रूप में संदर्भित) की माइटोफैगी गतिविधि को प्रदर्शित करने के लिए इस किट का उपयोग किया था। महत्वपूर्ण रूप से, हमने माइटो-रोसेला बायोसेंसर और माइटोकॉन्ड्रियल: परमाणु डीएनए सामग्री23 के क्यूपीसीआर माप के साथ धुंधला किट परिणामों को मान्य किया। यह धुंधला किट निम्नलिखित लाभ प्रदान करता है। सबसे पहले, माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक जानवरों या कोशिकाओं को उत्पन्न करने की कोई आवश्यकता नहीं है। इसलिए, हम असंशोधित जंगली-प्रकार के जानवरों या कोशिकाओं का अध्ययन कर सकते हैं और इस प्रकार, बहुत समय, धन और श्रम बचा सकते हैं। इसके अलावा, जैसा कि उल्लेख किया गया है, माइटोकॉन्ड्रियल बायोसेंसर व्यक्त करना माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को बदल सकता है। दूसरा, किट लागत प्रभावी, उपयोग में आसान और तेज़ है। तीसरा, हालांकि हम सी एलिगेंस और मानव कोशिकाओं में विधि का प्रदर्शन करते हैं, इसे अन्य सेल प्रकारों और जीवों के लिए संशोधित किया जा सकता है।

इसके साथ ही, किसी भी विधि की तरह, धुंधला किट प्रोटोकॉल में कमियां हैं। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक के साथ कीड़े का इनक्यूबेशन भोजन की अनुपस्थिति में किया जाता है (हमने देखा है कि मृत बैक्टीरिया भी धुंधला दक्षता को काफी कम कर देते हैं)। यद्यपि इनक्यूबेशन समय अपेक्षाकृत कम है, यह संभव है कि इस समय सीमा में भी, होमोस्टैटिक प्रतिक्रियाओं को बदल दिया जा सकता है, जिसमें माइटोफैगी भी शामिल है। इसके अलावा, ईआर / माइटोकॉन्ड्रियल / परमाणु प्रोटीन और अन्य बायोमोलेक्यूल्स के लिए रंगों का बंधन इन ऑर्गेनेल की गतिविधियों को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, आनुवंशिक सेंसर के साथ माइटोफैगी माप के विपरीत, हम कीड़े और कोशिकाओं के साथ काम करते हैं जो रासायनिक निर्धारण से गुजरे हैं। इसलिए, अलग-अलग समय पर एक ही कीड़े / कोशिकाओं की निगरानी जारी रखना असंभव है। इसलिए, हम एक विशेष शारीरिक प्रक्रिया में माइटोफैगी के कार्य को मान्य करने के लिए विभिन्न पद्धतियों के संयोजन की सलाह देते हैं। नीचे, हम नए डेटा प्रस्तुत करते हैं जो दर्शाता है कि वीएल -850 सी एलिगेंस कीड़े और हेप -3 बी कोशिकाओं में मजबूत माइटोफैगी को प्रेरित करता है। इसलिए, ये डेटा इस परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि वीएल -850 सी एलिगेंस के जीवनकाल को बढ़ाता है और स्वस्थ माइटोफैगी के प्रेरण के माध्यम से सी एलिगेंस को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाता है। हमने प्रोटॉन आयोनोफोर कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) का उपयोग किया है, जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक शक्तिशाली माइटोफैगी इंड्यूसर24 है।

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Protocol

नोट: पाठकों की सुविधा के लिए, हमने प्रोटोकॉल को दो भागों में विभाजित किया है: एक सी एलिगेंस में माइटोफैगी को मापने के लिए प्रोटोकॉल पर केंद्रित है, और दूसरा यकृत कोशिकाओं में माइटोफैगी को मापने के लिए प्रोटोकॉल पर केंद्रित है। सामग्री की सूची प्रदान की गई सामग्री की तालिका में पाई जा सकती है।

1. सी एलिगेंस प्रोटोकॉल

  1. नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) प्लेटों और एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 जीवाणु स्टॉक तैयार करना
    नोट: स्पष्टीकरण के बिंदु के रूप में, जबकि हमने एनजीएम प्लेटों और ओपी 50 बैक्टीरियल स्टॉक25,26 की तैयारी के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन किया, हम मानते हैं कि विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच इन प्रोटोकॉल में भिन्नताएं हो सकती हैं। इसलिए, हमने प्रयोग की सटीक प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए पूर्ण प्रोटोकॉल शामिल किए हैं।
    1. पीएच 6 तक पहुंचने तक 1 एम केएच 2 पीओ 4 समाधान के ~ 150 एमएल 1 एम के 2 एचपीओ 4 से 500 एमएल1 एम केएच2पीओ4 समाधान को जोड़कर 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर, पीएच 6 बनाएं। बफर को 0.22 μm वैक्यूम फिल्टर / स्टोरेज सिस्टम के माध्यम से पारित करके निष्फल करें।
    2. कैल्शियम क्लोराइड (CaCl 2) और मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4) का 0.1 M बनाएं, और उन्हें0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर के साथ निष्फल करें।
    3. पूर्ण इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल तैयार करें।
      नोट: चूंकि कोलेस्ट्रॉल इथेनॉल में तैयार किया जाता है, इसलिए इसे फ़िल्टर न करें।
    4. 500 मिलीलीटर डबल-डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीडब्ल्यू) में 1.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 1.25 ग्राम पेप्टोन और 8.5 ग्राम आगर को घोलकर एनजीएम-आगर तैयार करें। आटोक्लेव और इसे ~ 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    5. बाँझ परिस्थितियों में, पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6) के 12.5 एमएल, 0.1 एम सीएसीएल2 के 0.5 एमएल, 0.1 एम एमजीएसओ4 के 0.5 एमएल और 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 1 एमएल जोड़ें। हर अतिरिक्त के बाद अच्छी तरह मिलाएं।
    6. प्रत्येक 35 मिमी प्लेट में पिघला हुआ एनजीएम-आगर का 4 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी, ~ 21 डिग्री सेल्सियस) पर जमने के लिए रात भर व्यंजन छोड़ दें।
    7. लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेटबनाने के लिए, 400 मिलीलीटर आसुत, विआयनीकृत पानी (डीडीडब्ल्यू) के 5 ग्राम एनएसीएल, 5 ग्राम ट्रिप्टोन, 2.5 ग्राम खमीर अर्क और 7.5 ग्राम आगर को घोलें, घोल के पीएच को 7.0 तक समायोजित करें, डीडीडब्ल्यू और आटोक्लेव के साथ मात्रा को 500 एमएल तक लाएं। एक बार घोल 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाने के बाद, प्रत्येक 90 मिमी पेट्री डिश में 25 मिलीलीटर मिश्रण डालें, और प्लेटों को कमरे के तापमान पर 2 दिनों तक सूखने दें। इसके बाद, ग्लिसरॉल स्टॉक से सूखे एलबी प्लेटों पर ओपी 50 बैक्टीरिया को बाहर निकालें, और एकल उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    8. 8 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम खमीर अर्क और 2.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) को डीडीडब्ल्यू के 0.5 एल में घोलकर 2एक्स खमीर ट्रिप्टोन (वाईटी) तैयार करें। पीएच को 7 में समायोजित करें, और आटोक्लेव।
    9. ठंडा होने पर, ताजा लकीर वाली एलबी प्लेट से एक ओपी 50 बैक्टीरिया कॉलोनी को 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 2एक्स वाईटी माध्यम के 50 मिलीलीटर में टीका लगाएं। लगभग 0.6 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी600) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर हिलाएं।
  2. वाहन और प्रायोगिक प्लेटों को तैयार करना
    1. प्रत्येक 35 मिमी एनजीएम-अगर प्लेट के केंद्र में ओपी 50 बैक्टीरिया के 100 μL जोड़ें। आरटी (कमरे का तापमान, 21 डिग्री सेल्सियस) पर रात भर सुखाएं।
    2. डीएमएसओ में 0.5 एम वीएल -850 तैयार करें, और एम 9 बफर (22 एमएम केएच 2 पीओ 4, 42 एमएम एनए2एचपीओ 4, 86 एमएम एनएसीएल, पीएच 7,और 1 एमएम एमजीएसओ 4)26 का उपयोग करके 10 एमएम वीएल -850 तक पतला करें। पुष्टि करें कि पीएच 7.0 है (यदि नहीं, तो 0.1 एम एचसीएल के साथ टाइटरेट), और 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें। ऊपर वर्णित वाहन तैयार करें, लेकिन दवा के बिना (इस मामले में, वीएल -850)। डीएमएसओ में 50 एमएम एफसीसीपी बनाएं, एम 9 बफर के साथ 1 एमएम एफसीसीपी को पतला करें, और 0.22 μm सिरिंज फिल्टर के साथ समाधान को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
    3. बैक्टीरियल लॉन पर अलग से बीज वाली एनजीएम प्लेटों में वाहन (नकारात्मक नियंत्रण), एफसीसीपी (सकारात्मक नियंत्रण; 5 μM), या VL-850 (प्रयोगात्मक उपचार; 62.5 μM) के 25 μL जोड़ें।
    4. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को कवर करें, और उन्हें आरटी (कमरे का तापमान, 21 डिग्री सेल्सियस) पर सूखने के लिए छोड़ दें। ~ 16 घंटे के बाद प्लेटों का उपयोग करें।
  3. सिंक्रनाइज़ युवा वयस्क सी एलिगेंस हेर्मैफ्रोडाइट्स प्राप्त करना।
    1. 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4, और 86 mM NaCl के साथ M9 बफर का 1 L बनाएं। ऑटोक्लेविंग करके स्टरलाइज़ करें, और इसे ठंडा होने दें। एक बार ठंडा होने के बाद, 1 mM MgSO4 (0.22 μm फ़िल्टर-निष्फल) का 1 mL जोड़ें।
    2. 2.5 एन सोडियम हाइड्रॉक्साइड के 0.8 एमएल और सोडियम हाइपोक्लोराइट के 5% घोल के 1 एमएल को 2.2 एमएल डीडीडब्ल्यू के साथ मिलाकर 4 एमएल क्षारीय हाइपोक्लोराइट घोल (सोडियम हाइड्रॉक्साइड के लिए 0.5 एन और सोडियम हाइपोक्लोराइट के लिए 1.25% की अंतिम एकाग्रता) बनाएं।
    3. कीड़े (ग्रेविड हेर्मैफ्रोडाइट्स) को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें, एनजीएम प्लेटों को 1 एमएल एम 9 बफर 3 एक्स के साथ धोकर यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी माताओं को ट्यूब में एकत्र किया गया है।
    4. 1 मिनट के लिए 500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कीड़े को तलछट करें, और 1 एमएल की मात्रा शेष रहने तक सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    5. क्षारीय हाइपोक्लोराइट घोल के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और ट्यूब 5 x को उलटकर मिलाएं। अंडे की रिहाई में सहायता के लिए 3 मिनट के लिए ट्यूब को धीरे से भंवर करें, और एक विच्छेदन स्टीरियोस्कोप के तहत कीड़े की स्थिति का निरीक्षण करें।
    6. जब लगभग 50% कीड़े टूट जाते हैं, तो एम 9 बफर के 5 एमएल जोड़ें और तुरंत 500 × ग्राम पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके अंडे को तलछट करें।
    7. गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाले को सावधानी से निकालें। एम 9 बफर के 5 एमएल जोड़ें, और धोने की प्रक्रिया को 2 x दोहराएं।
    8. सतह पर तैरनेवाला को 2 एमएल रहने तक निकालें, और सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा प्राप्त करने के लिए ~ 16 घंटे (आरटी, 21 डिग्री सेल्सियस) के लिए 20 आरपीएम पर ट्यूब (360 डिग्री रोटेशन) घुमाएं। इस ट्यूब से, एक ग्लास स्लाइड पर 5 μL की बूंद लें, एक स्टीरियोस्कोप के तहत लार्वा की संख्या की गणना करें, इस चरण को 3x दोहराएं, तीन गणनाओं का औसत लें, और प्रति माइक्रोलीटर (μL) कीड़े की संख्या का अनुमान लगाएं। इन गणनाओं के आधार पर, ओपी 50 बैक्टीरिया के साथ बीज ति प्रति एनजीएम प्लेट ~ 200 लार्वा जोड़ें।
    9. युवा वयस्क अवस्था तक ~ 48 घंटे के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर एल 1 लार्वा विकसित करें।
  4. दवा उपचार और माइक्रोस्कोपी प्रक्रिया
    1. प्रत्येक प्रयोगात्मक या नियंत्रण प्लेटों पर 100 कीड़े डालें। सुनिश्चित करें कि नकारात्मक, सकारात्मक और प्रयोगात्मक प्लेटों में वाहन, 5 μM FCCP, और 62.5 μM VL-850 शामिल हैं। 6 घंटे के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. प्रत्येक प्लेट से कीड़े को 1.7 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में धोने के लिए एम 9 बफर के 1 एमएल का उपयोग करें। ट्यूब को संक्षेप में (~ 3 एस) एक मिनीसेंट्रीफ्यूज में घुमाएं। इसके बाद, कीड़े के गोली को परेशान किए बिना एम 9 बफर को धीरे से बाहर निकालकर सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें। इस धोने के चरण 2x को दोहराएं, और फिर कीड़े की गोली को परेशान किए बिना धीरे से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें।
    3. एम 9 बफर के 200 μL जोड़ें, जिसमें 0.1% v / v Poloxamer 188, 0.1% v / v Pluronic F127, और 2 μL स्टेनिंग किट अभिकर्मक शामिल हैं। मिश्रण को आरटी (कमरे का तापमान, 21 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए 20 आरपीएम (360 डिग्री रोटेशन) पर घूमने दें। रंगों को प्रकाश से बचाने के लिए, ट्यूबों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
    4. कीड़े को धीरे से घुमाएं, जैसा कि चरण 1.3.4 में वर्णित है। फिर, कीड़े की गोली को परेशान किए बिना धुंधला घोल हटा दें। इसके बाद, चरण 1.3.2 में वर्णित कीड़े को धो लें, और उन्हें उचित उपचार युक्त बीज एनजीएम-एगर प्लेट में स्थानांतरित करें- उदाहरण के लिए, एफसीसीपी के साथ इलाज किए गए कीड़े को एफसीसीपी युक्त प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों को कवर करें क्योंकि धुंधला अभिकर्मक प्रकाश-संवेदनशील है।
      नोट: हमने कीड़े को बैक्टीरिया युक्त कल्चर प्लेटों और संबंधित उपचार एजेंट में स्थानांतरित कर दिया ताकि अतिरिक्त डाई के कारण पृष्ठभूमि शोर को कम किया जा सके। उदाहरण के लिए, एफसीसीपी के साथ इलाज किए गए कीड़े को एफसीसीपी-पूरक प्लेटों में स्थानांतरित कर दिया गया था, और इसी तरह।
    5. 1 एमएल एम 9 बफर का उपयोग करके प्लेटों से कीड़े को ताजा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में धो लें; कीड़े को उसी तरह से धोएं 2x . इसके बाद, कीड़े को 30 मिनट के लिए बर्फ पर 1% फॉर्मलाडेहाइड के साथ ठीक करें, और अवशिष्ट फॉर्मलाडेहाइड को हटाने के लिए एम 9 बफर 3 एक्स के 1 एमएल के साथ कीड़े को धो लें। धोने के बाद, कीड़े को एक गोली में घुमाएं, और सतह पर तैरने वाले की अधिकतम मात्रा को एस्पिरेट करें, जिससे कीड़े की गोली एम 9 के 10 μL में बरकरार रहे।
    6. 2.5% अगारोस तैयार करने के लिए, 10 एमएल बोरोसिलिकेट ग्लास टेस्ट ट्यूब में 0.125 ग्राम अगारोस का वजन करें, 5 एमएल एम 9 बफर जोड़ें, और बन्सन बर्नर के साथ ट्यूब को धीरे से गर्म करके अगारोस को भंग करें। पिघले हुए अगारोस को 75 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखे स्नान सेट में स्थानांतरित करें, और 1 एमएल टिप का उपयोग करके, पिघले हुए अगारोस के 100 μL को डेकग्लेसर माइक्रोस्कोप कवर ग्लास (24 मिमी x 60 मिमी) पर डालें। तुरंत, एक क्रॉस आकार बनाते हुए, अगारोस बूंद पर लंबवत एक और स्लाइड डालें। ~ 2 मिनट प्रतीक्षा करें, और धीरे से ऊपरी कवर ग्लास को धक्का देकर स्लाइड को अलग करें, इस प्रकार नीचे कवर स्लाइड पर अगारोस पैड छोड़ दें।
      नोट: ट्यूब में अगारोस को गर्म करते समय सावधान रहें, और सुनिश्चित करें कि ट्यूब को शरीर से दूर रखा गया है। अगारोस के जमावट को कम करने के लिए 1 एमएल टिप के किनारे को काट लें।
    7. कीड़े को पाश्चर ग्लास पिपेट (यानी, ट्यूब में पूरी राशि, ~ 10 μL) के साथ अगारोस पैड पर स्थानांतरित करें। प्रयोगशाला पोंछे से बने बाती के साथ अतिरिक्त तरल को हटा दें, और फिर कीड़े को एक छोटी कवर स्लाइड (24 मिमी x 40 मिमी) के साथ कवर करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए छोटी कवर स्लाइड की परिधि में पारदर्शी नेल पॉलिश लागू करें। स्लाइड को प्रकाश से बचाने के लिए एक अंधेरे बॉक्स में रखें।
    8. 60x आवर्धन लेंस का उपयोग करके उचित तरंग दैर्ध्य (नीचे देखें) पर 24 घंटे के भीतर कीड़े की छवि बनाने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      1. स्लाइड को माइक्रोस्कोप मंच पर रखें।
      2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, और सॉफ़्टवेयर के ग्रे क्षेत्र पर राइट-क्लिक करें। खुला अधिग्रहण | टीआई 2 फुल पैड | एनडी अधिग्रहण | पॉप-अप पर विकल्पों पर क्लिक करके एलयूटी जो राइट क्लिक के परिणामस्वरूप उभरता है।
      3. Ti2 पूर्ण पैड के अंतर्गत, 60x का चयन करें।
      4. अधिग्रहण के तहत, आईपीस डीआईए का चयन करें, और माइक्रोस्कोप फाइन-फोकस नॉब का उपयोग करके कीड़े को फोकस में लाएं। अधिग्रहण के अंतर्गत, स्पिनिंग डिस्क का चयन करें, और 16-बिट - नो बिनिंग विकल्प चुनें। प्रत्येक प्रतिदीप्ति फ़िल्टर के लिए, ब्राइटफील्ड के लिए एक्सपोजर समय 500 एमएस और 20 एमएस पर सेट करें। एक बार ये पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, अभी चलाएँ का चयन करें, और आउटपुट छवि को ND2 फ़ाइल के रूप में उत्पन्न होने की प्रतीक्षा करें।
        नोट: एक्सपोज़र समय को प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है, क्योंकि विभिन्न इमेजिंग सेटअप में अलग-अलग विशेषताएं हैं। प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच करने के लिए लुकअप टेबल (एलयूटी) का उपयोग करें।
  5. छवि विश्लेषण
    1. कोलोकलाइजेशन प्लगइन के साथ इमेजजे27 में कॉन्फोकल छवियों (यहां, निकोन एनडी 2 फाइलें) खोलें। प्रत्येक एनडी फ़ाइल में तीन तरंग दैर्ध्य (डीएपीआई, जीएफपी / एफआईटीसी [ग्रीन], और टेक्सास रेड [लाल] फिल्टर का उपयोग करके) और दृश्य मान प्रकाश पर लिए गए छवि विमान शामिल हैं। इन छवियों तक पहुँचने के लिए, ImageJ सर्वर में ND फ़ाइल खोलें, और संवाद बॉक्स में विभाजित छवियाँ का चयन करें। ब्राइटफील्ड (बीएफ), ग्रीन चैनल और लाल चैनल छवियों के साथ काम करें।
    2. इमेज पर क्लिक करके मूल छवि को अछूता रखने के लिए इन छवियों के डुप्लिकेट उत्पन्न करें | डुप्लिकेट या कुंजीपटल शॉर्टकट Shift + D का उपयोग करना.
    3. पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, छवि का एक और डुप्लिकेट उत्पन्न करें, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है। 100 की रोलिंग त्रिज्या के साथ पृष्ठभूमि को घटाएं, और दी गई छवि की पृष्ठभूमि के साथ एक छवि उत्पन्न करने के लिए पृष्ठभूमि बनाएं (घटाएं नहीं) विकल्प का चयन करें। इसके बाद, प्रक्रिया पर जाएं | छवि कैलकुलेटर, और दूसरी डुप्लिकेट छवि से पहली डुप्लिकेट छवि को घटाएं। सहस्थानीयकरण विश्लेषण के लिए परिणामी छवियों का उपयोग करें।
    4. कोलोकलाइजेशन प्लगइन का उपयोग करने के लिए, हरे चैनल और लाल चैनल छवियों को 8-बिट में परिवर्तित करें। ऐसा करने के लिए, छवि पर क्लिक करें | प्रकार | 8 बिट.
    5. प्लगइन्स पर क्लिक करें | कोलोकलाइजेशन। कोलोकलाइजेशन प्लगइन (ऊपर देखें) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम संकेतों के कोलोकलाइजेशन को मापने के लिए, निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: अनुपात = 75%, थ्रेशोल्ड रेड चैनल = 80.0, थ्रेशोल्ड ग्रीन चैनल = 50.0। आउटपुट एक 8-बिट बाइनरी छवि है जिसमें कोलोकाइज्ड पंक्टा और आरजीबी छवि में तीन 8-बिट छवियों (हरे, लाल और कोलोकाइज्ड छवि) का संयोजन होता है।
    6. मैन्युअल रूप से इस क्षेत्र का चयन करके और संपादित करें पर क्लिक करके मास्क बनाकर कीड़े के सिर, शरीर-दीवार की मांसपेशियों में पंक्टा पर ध्यान केंद्रित करें । चयन | मास्क बनाएं, जो रुचि के क्षेत्र का चयन करता है (चित्रा 2 ए, बी)। सिर के शरीर-दीवार मांसपेशी क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए अन्य दाग वाली संस्थाओं (जैसे, ग्रसनी मांसपेशियों) को चुनिंदा रूप से हटा दें।
    7. रुचि के क्षेत्र (आरओआई) में कणों का चयन करने के लिए, छवि कैलकुलेटर का उपयोग करके कोलोकाइज्ड 8-बिट और मुखौटा छवियों का चयन करें। फिर, ROI में पंक्टा का चयन करने के लिए ऑपरेशन और (चित्रा 3A) का उपयोग करें। यह ROI (चित्रा 3B) में पंक्टा के साथ एक छवि उत्पन्न करता है।
    8. कोलोकाइज्ड माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण का चयन करें | कणों का विश्लेषण करें, और 0.1625 μm2 और 4 μm2 के बीच पंक्टा के योग को मापें।

2. हेप -3 बी कैंसर सेल प्रोटोकॉल

  1. दवा स्टॉक समाधान तैयार करना
    1. डीएमएसओ में 100 एमएम वीएल -850 तैयार करें। इसे 0.5 एम एचईपीईएस बफर, पीएच 7.3 के साथ 5 एमएम तक पतला करें, और 0.22 μm सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके समाधान को निष्फल करें। फिर, वाहन को पहले वर्णित के रूप में तैयार करें, लेकिन दवा के बिना (इस मामले में, वीएल -850)।
  2. प्रयोग, दवा उपचार और माइक्रोस्कोपी प्रक्रिया के लिए हेप -3 बी कोशिकाओं का संवर्धन
    1. 10 सेमी ऊतक संवर्धन प्लेटों में हेप -3 बी कोशिकाओं को विकसित करें जिसमें डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) होते हैं, जो 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2% एल-ग्लूटामाइन और 1% टेट्रासाइक्लिन (इसके बाद पूर्ण डीएमईएम के रूप में संदर्भित) के साथ पूरक होते हैं। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    2. हेप -3 बी कोशिकाओं की एक प्लेट चुनें जो 70% -80% सेल कंफ्लुएंसी (लघुगणकीय विकास चरण) प्रदर्शित करती है, माध्यम को हटा दें, और प्लेट को 5 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से धो लें। पीबीएस को हटा दें, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 3 मिनट के लिए 1 एमएल प्रीवार्म्ड 0.25% ट्रिप्सिन / 0.02% ईडीटीए के साथ इनक्यूबेट करें; एक ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप (10x) के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। ट्रिप्सिन पाचन को रोकें जब कोशिकाएं गोल हो जाती हैं और 5 एमएल पूर्ण डीएमईएम जोड़कर प्लेट से अलग होना शुरू कर देती हैं। 5 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और पूर्ण डीएमईएम के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. सेल एकाग्रता निर्धारित करें। 50 μL सेल सस्पेंशन को ट्राइपैन ब्लू के 50 μL के साथ मिलाएं। एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके या हेमोसाइटोमीटर 5x का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, और गणना की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए इन गणनाओं का औसत लें।
    4. प्रत्येक 8-वेल μ-स्लाइड में 42,000 हेप 3 जी कोशिकाओं को पूर्ण डीएमईएम के 400 μL में बीज दें (जैसा कि ऊपर वर्णित है)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. ~ 80% -85% कंफ्लुएंसी पर 24 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं से 250 μL मध्यम निकालें, और उचित उपचार या वाहन के साथ 50 μL मध्यम जोड़ें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, कोशिकाओं को 100 μM VL-850, 5 μM FCCP, और एक वाहन के साथ एक नियंत्रण के रूप में इलाज करें।
    6. यौगिकों के साथ 6 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, धुंधला अभिकर्मक वाले प्रत्येक कुएं में 50 μL माध्यम जोड़ें (प्रत्येक कुएं में 250 μL के लिए 0.5 μL डाई)। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए डाई के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: चूंकि धुंधला अभिकर्मक प्रकाश-संवेदनशील है, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ नमूने को कवर करके और मंद-प्रकाश वातावरण (यदि संभव हो तो) में काम करके प्रकाश के संपर्क को कम करें।
    7. 200 μL पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं से सभी माध्यम (250 μL) को धीरे से हटा दें, और फिर कोशिकाओं को 200 μL प्रीवार्म्ड पीबीएस के साथ धो लें।
    8. आरटी पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में तैयार 4% फॉर्मलाडेहाइड और 2.5% ग्लूटार्ल्डिहाइड युक्त 200 μL फिक्सिंग घोल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
    9. फिक्सेटिव समाधान को हटा दें, और पीबीएस के 200 μL के साथ संक्षेप में धो लें।
    10. पीबीएस के 200 μL जोड़ें, कोशिकाओं को कवर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित रखें, और 24 घंटे के भीतर छवि।
      नोट: हमने चरण 1.4.8 के रूप में डीआईसी, टीआईटीसी, एफआईटीसी और डीएपीआई सहित चार चैनलों में स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया। हमने प्रति उपचार ~ 300 कोशिकाओं की छवि बनाई।
  3. छवि विश्लेषण
    1. चरण 1.5.1-1.5.5 निष्पादित करें। कोशिकाओं के आरओआई प्राप्त करने के लिए, एक छवि उत्पन्न करें जो कोशिकाओं के क्षेत्र पर प्रकाश डालती है। इसके लिए, एक कोलोकाइज्ड पॉइंट्स (आरजीबी) छवि (चित्रा 4 ए) चुनें। संपूर्ण सेल क्षेत्र का चयन करने के लिए, प्रक्रिया का चयन करें | द्विआधारी | एक द्विआधारी छवि प्राप्त करने के लिए मुखौटा बनाएं (चित्रा 4 बी)। सेल के क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए, विश्लेषण का चयन करें | कणों का विश्लेषण करें, और छवि में सभी कणों को 0 से अनंत तक मापें, जो कणों का विश्लेषण करने के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग है।
    2. कोलोकाइज्ड माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए, एक कोलोकाइज्ड 8-बिट छवि का चयन करें, इसे प्रक्रिया का चयन करके बाइनरी में परिवर्तित करें द्विआधारी | बाइनरी बनाएं, विश्लेषण का चयन करें | कणों का विश्लेषण करें, और 0.1625 μm2 और 4 μm2 के बीच पंक्टा के योग को मापें। कोलोकाइज्ड पंक्टा को मापने के लिए, कुल सेल क्षेत्र से कोलोकाइज्ड माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के क्षेत्र को विभाजित करें।

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Representative Results

वीएल -850 के साथ सी एलिगेंस कीड़े और हेप -3 बी कोशिकाओं दोनों में एक मजबूत माइटोफैगी प्रतिक्रिया का प्रेरण।
वीएल -850 सी एलिगेंस कीड़े और मानव केराटिनोसाइट्स (एचसीएटी कोशिकाओं) कोऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है। कार्रवाई के अपने तंत्र का पता लगाने के लिए, हमने जांच की कि क्या वीएल -850 सी एलिगेंस और अन्य मानव कोशिकाओं में माइटोफैगी को प्रेरित करता है। इसका परीक्षण करने के लिए, हमने सी एलिगेंस कीड़े (युवा वयस्क, एल 1 के 3 दिन बाद) को 62.5 μM VL-850, 5 μM FCCP (सकारात्मक नियंत्रण), और वाहन (नकारात्मक नियंत्रण) को 6 घंटे के लिए उजागर किया। जैसा कि ऊपर वर्णित है, हमने धुंधला अभिकर्मक का उपयोग करके माइटोफैगी को मापा। हमने वीएल -850 के लिए 62.5 μM एकाग्रता का उपयोग करना चुना क्योंकि यह कीड़े को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है और उनके जीवनकालको काफी लंबा करता है। वीएल -850 ने कीड़े के सिर के शरीर-दीवार की मांसपेशियों में मजबूत माइटोफैगी को प्रेरित किया (चित्रा 5), यह दर्शाता है कि यह एक शक्तिशाली माइटोफैगी इंड्यूसर है। ध्यान दें, वीएल 850 की माइटोफैगी शक्ति एफसीसीपी (चित्रा 5) के समान थी।

इसके अलावा, हमने हेप -3 बी कोशिकाओं के साथ एक समान प्रयोग किया; यह सेल लाइन प्राथमिक हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (एचसीसी) 28 के साथ एक 8 वर्षीय काले पुरुष से उत्पन्न हुई थी। एलिगेंस प्रयोग के समान, हमने कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए 100 μM VL-850, 5 μM FCCP (सकारात्मक नियंत्रण), और वाहन (नकारात्मक नियंत्रण) के संपर्क में लाया और माइटोफैगी को मापने के लिए धुंधला अभिकर्मक का उपयोग किया। वीएल -850 और एफसीसीपी ने हेप -3 बी कोशिकाओं (चित्रा 6) में महत्वपूर्ण माइटोफैगी (एक समान सीमा तक) को प्रेरित किया, जो हमारी परिकल्पना का समर्थन करता है कि वीएल -850 सी एलिगेंस और मानव कोशिकाओं दोनों में एक शक्तिशाली माइटोफैगी इंड्यूसर है।

Figure 1
चित्र 1: सी एलिगेंस और हेप -3 बी कोशिकाओं में माइटोफैगी माप। सी एलिगेंस कीड़े और यकृत कैंसर कोशिकाओं दोनों में माइटोफैगी को मापने के लिए धुंधला किट के उपयोग को दर्शाते हुए योजनाबद्ध ड्राइंग। संक्षेप: वीएल -850 = ओ, ओ (ऑक्टेन -1,8-डाइल) बिस (हाइड्रॉक्सिलमाइन); एफसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एनजीएम = नेमाटोड विकास माध्यम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सी एलिगेंस में रुचि के सिर के शरीर-दीवार मांसपेशी क्षेत्र का चयन करना। (ए) रुचि के क्षेत्र को मैन्युअल रूप से चुना जाता है, और एक मुखौटा उत्पन्न होता है। (बी) परिणामी मुखौटा छवि रुचि के मुख्य क्षेत्र को प्रदर्शित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सी एलिगेंस में रुचि के क्षेत्र में कोलोकाइज्ड पंक्टा का परिमाणीकरण। (ए) रुचि के क्षेत्र में पंक्टा का चयन करने के लिए, ऑपरेशन "एंड" का चयन किया जाना चाहिए। (बी) परिणामी छवि रुचि के क्षेत्र में पंक्टा प्रदर्शित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: रुचि के क्षेत्र में कक्षों का चयन करना. (ए) कोलोकलाइजेशन फ़ंक्शन के बाद एक कोलोकाइज्ड पॉइंट (आरजीबी) छवि उत्पन्न होती है। (बी) एक मुखौटा छवि जो पूरे सेल क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करती है जिसमें पंक्टा का अध्ययन किया जाना है। संक्षिप्त नाम: आरजीबी = लाल, हरा और नीला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: वीएल -850 द्वारा सी एलिगेंस में मजबूत माइटोफैगी का प्रेरण। (ए) एरोहेड प्रतिनिधि कोलोकलाइजेशन के उदाहरण के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के कोलोकलाइजेशन को दर्शाते हैं। इनसेट, जिसमें आठ गुना वृद्धि है, बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए प्रदान किया गया है। स्केल बार = 100 μm (B) कोलोकलाइजेशन को प्रति उपचार तीन जैविक दोहराव और 30 कीड़े के साथ निर्धारित किया गया था। परिणामों का महत्व वाहन नियंत्रणों से तुलना करके निर्धारित किया गया था, और तारांकन सांख्यिकीय महत्व को इंगित करते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण एक अप्रकाशित एक-तरफ़ा एनोवा (वेल्च के सुधार के साथ ब्राउन-फोर्सिथ और वेल्च एनोवा परीक्षण) का उपयोग करके किया गया था, और 0.0001 (****पी < 0.0001) से कम का पी-मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था। संक्षिप्त नाम: एफसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: वीएल -850 हेप -3 बी कोशिकाओं में महत्वपूर्ण माइटोफैगी को प्रेरित करता है। (ए) एरोहेड कोलोकलाइजेशन का प्रतिनिधित्व करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया और लाइसोसोम के कोलोकलाइजेशन को दिखाते हैं, और आठ गुना वृद्धि पर कोलोकलाइजेशन को प्रदर्शित करने के लिए एक इनसेट शामिल किया जाता है। स्केल बार = 25 μm. (B) कोलोकलाइजेशन को तीन जैविक दोहराव और N ≥ 411 कोशिकाओं प्रति उपचार के साथ परिमाणित किया गया था (411 उस सीमा के भीतर आता है जो सांख्यिकीय महत्व और परिणामों में विश्वास की अनुमति देता है)। वाहन नियंत्रण की तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का आकलन किया गया था, और तारांकन महत्व का संकेत देते हैं। डेटा का विश्लेषण एक अप्रकाशित एक-तरफ़ा एनोवा (वेल्च के सुधार के साथ ब्राउन-फोर्सिथ और वेल्च एनोवा परीक्षण) का उपयोग करके किया गया था, और 0.0001 (***पी < 0.0001) से कम का पी-वैल्यू सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था। संक्षिप्त नाम: एफसीसीपी = कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कई माइटोफैगी मार्गों में विभिन्न प्रोटीन और बायोमोलेक्यूल्स शामिल होते हैं (उदाहरण के लिए, कार्डियोलिपिन29)। हालांकि, इन मार्गों का समापन बिंदु समान है- लाइसोसोमल एंजाइम12,13 द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया का क्षरण। दरअसल, कई विधियां माइटोफैगी को मापने के लिए इस समापन बिंदु का उपयोग करती हैं। हालांकि, कुछ तरीके, जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, महंगे उपकरणों, प्रशिक्षित विशेषज्ञों और नमूनों और विश्लेषण के लिए एक विस्तारित तैयारी समय तक पहुंच की मांग करते हैं। इसके अलावा, माइटोफैगी बायोसेंसर का उपयोग करने के फायदों के बावजूद, जिसमें विशिष्ट ऊतकों / कोशिकाओं / उपकोशिकीय डिब्बों में माइटोफैगी को मापना शामिल है, ऐसे सेंसर की अभिव्यक्ति सेल21 के शरीर विज्ञान को बदल सकती है। इसलिए, सामान्य सेल फिजियोलॉजी के साथ दीर्घकालिक हस्तक्षेप की आवश्यकता के बिना माइटोफैगी को मापने के लिए एक विश्वसनीय, लागत प्रभावी और तेज़ विधि की आवश्यकता है।

यहां, हम ऐसी विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया / लाइसोसोम / परमाणु डाई कॉकटेल के एक किफायती वाणिज्यिक मिश्रण का उपयोग शामिल है। हमने हाल ही में सी एलिगेंस और अमर मानव केराटिनोसाइट्स (एचसीएटी कोशिकाओं) 23 में माइटोफैगी को मापने में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन किया। स्टेनिंग किट के परिणामों को दो बायोसेंसर के साथ मान्य किया गया था, जिसमें माइटो-रोसेला ( सी एलिगेंस में) और कॉक्स 8-एमचेरी-ईजीएफपी (मानव एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं में) के साथ-साथ क्यूपीसीआर प्रयोग शामिल थे, जिन्होंने माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु डीएनए सामग्री और कई माइटोफैगी / ऑटोफैगी जीन23 की अभिव्यक्ति के बीच अनुपात को निर्धारित किया था।

इस अध्ययन में, हमने सी एलिगेंस कीड़े और मानव यकृत एडेनोकार्सिनोमा हेप -3 बी कोशिकाओं में वीएल -850 की माइटोफैगी-सक्रिय शक्ति का पता लगाने के लिए अपने शोध का विस्तार किया। परिणाम बताते हैं कि वीएल -850 एक शक्तिशाली माइटोफैगी इंड्यूसर है (चित्रा 5 और चित्रा 6)। ये परिणाम पिछले अवलोकनों का समर्थन करते हैं कि वीएल -850 सी एलिगेंस को ऑक्सीडेटिव तनाव से बचाता है और उनके जीवनकाल को बढ़ाता है, साथ ही साथ हैकैट कोशिकाओं23 में माइटोफैगी को प्रेरित करता है।

धुंधला किट की उपयोगिता के बावजूद, सी एलिगेंस अध्ययन के संबंध में इसकी कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, कम से कम अध्ययन की गई स्थितियों के तहत, हमने डेंड्राइट और अक्षतंतु के धुंधलापन का निरीक्षण नहीं किया। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल इन न्यूरोनल संस्थाओं में माइटोफैगी को मापने के लिए उपयोगी नहीं है। दूसरा, आंतों की ऑटोफ्लोरेसेंस माइटोकॉन्ड्रियल डाई के हरे प्रतिदीप्ति संकेत में हस्तक्षेप कर सकती है। इसलिए, आंत में माइटोफैगी माप के लिए इस विधि को लागू करते समय सावधानी बरतनी चाहिए। अंत में, और विशेष रूप से मानव / कृंतक कोशिका लाइनों के संदर्भ में, लाइसोसोम डाई नाभिक के भीतर अम्लीय संस्थाओं को दाग सकता है। इसलिए, प्रत्येक सेल लाइन / मध्यम संरचना के लिए धुंधला अभिकर्मक एकाग्रता / इनक्यूबेशन समय को अनुभवपूर्वक संशोधित करने की सिफारिश की जाती है।

इसके अलावा, जैसा कि ऊपर सुझाव दिया गया है, माइटोफैगी का प्रदर्शन करने के लिए कोई भी विधि पर्याप्त नहीं है। इसलिए, हम वैकल्पिक तरीकों (जैसे, माइटोफैगी बायोसेंसर, क्यूपीसीआर, इम्यूनोस्टेनिंग) का उपयोग करके धुंधला अभिकर्मक परिणामों के सत्यापन की सलाह देते हैं और हमेशा एक सकारात्मक माइटोफैगी नियंत्रण (जैसे, एफसीसीपी) शामिल करते हैं। निष्कर्ष में, धुंधला अभिकर्मक डाई कॉकटेल सी एलिगेंस और मानव कोशिकाओं में माइटोफैगी को निर्धारित करने के लिए एक विश्वसनीय और लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है। मानव और सी एलिगेंस कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर को देखते हुए, हम उम्मीद करते हैं कि इस विधि को आसानी से अन्य पशु प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पठन और उनकी टिप्पणियों और सलाह के लिए सकल प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) को धन्यवाद देते हैं, जिसे कुछ उपभेदों को प्रदान करने के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। इस शोध को विटालुंगा लिमिटेड और इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 989/19) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ग्राफिकल अमूर्त आंकड़ा (चित्रा 1) BioRender.com के साथ उत्पन्न किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent or resource
Analytical balance Mettler-Toledo
Bacto Agar BD-Difco 214010
Bacto Peptone BD-Difco 211677
Bacto Tryptone BD-Difco 211705
Bacto Yeast extract BD-Difco 212750
Calcium chloride Sigma C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma C2920
Chemicals
Cholestrol Thermo Fisher C/5360/48
DMEM high glucose Biological Industries 01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
FBS heat inactivated Invitrogen M7514
Gluteradehyde (25%) Sigma G5882
HEPES Buffer 1 M Biological Industries 03-025-1B
L-gluatamine Biological Industries 03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent Abcam ab139487
Magnesium Sulfate Sigma M7506
Nonidet P 40 Sigma 74385
Paraformalydehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15720
Poloxamer 188 Solution Sigma P5556
Potassium dihydrogen phosphate Millipore 1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic Sigma P3786
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride Bio-Lab 1903059100
Sodium Hydroxide Gadot 1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate Sigma 4273
Tetracycline hydrochloride Sigma 87128-25G
Trypsin-EDTA Biological Industries 03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter Millex GV SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes Lifegene LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates Corning 430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB15-500
35 mm Petri dishes Bar Naor BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm Lifegene LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube Lifegene LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm Marienfeld 101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass Pyrex 99445-13
iBiDi 8 well μ-slides iBiDi 80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm Bar Naor BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire World Precision Instruments PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF DeNovix CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400 Biosan BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software Nikon CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope Olympus SZ61
pH meter Mettler-Toledo MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator Labnet H5600

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References

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जीव विज्ञान अंक 195 मिटोफैगी माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी लाइसोसोम केनोरहाब्डिस एलिगेंस हेप -3 बी कोशिकाएं।
ऑर्गेनेल-विशिष्ट रंगों का उपयोग करके <em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> और स्तनधारी कोशिकाओं में मिटोफैगी का पता लगाना
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Srivastava, V., Gross, E. Detection… More

Srivastava, V., Gross, E. Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes. J. Vis. Exp. (195), e65337, doi:10.3791/65337 (2023).

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