Påvisning av mitophagi i Caenorhabditis elegans og pattedyrceller ved bruk av organelle-spesifikke fargestoffer
Summary
Å utforske mitofagi gjennom elektronmikroskopi, genetiske sensorer og immunfluorescens krever kostbart utstyr, dyktig personell og en betydelig tidsinvestering. Her demonstrerer vi effekten av et kommersielt fluorescensfargesett ved kvantifisering av mitofagiprosessen i både Caenorhabditis elegans og en leverkreftcellelinje.
Abstract
Mitokondrier er essensielle for ulike biologiske funksjoner, inkludert energiproduksjon, lipidmetabolisme, kalsiumhomeostase, hemebiosyntese, regulert celledød og generering av reaktive oksygenarter (ROS). ROS er avgjørende for viktige biologiske prosesser. Men når de ikke er kontrollert, kan de føre til oksidativ skade, inkludert mitokondriell skade. Skadede mitokondrier frigjør mer ROS, og derved intensiverer cellulær skade og sykdomstilstanden. En homeostatisk prosess kalt mitokondriell autofagi (mitofagi) fjerner selektivt skadede mitokondrier, som deretter erstattes av nye. Det er flere mitofagiveier, med det vanlige endepunktet som nedbrytningen av de skadede mitokondriene i lysosomer.
Flere metoder, inkludert genetiske sensorer, antistoffimmunfluorescens og elektronmikroskopi, bruker dette endepunktet til å kvantifisere mitofagi. Hver metode for å undersøke mitofagi har sine fordeler, for eksempel spesifikk vev / cellemålretting (med genetiske sensorer) og stor detalj (med elektronmikroskopi). Imidlertid krever disse metodene ofte dyre ressurser, trent personell og en lang forberedelsestid før selve forsøket, for eksempel for å skape transgene dyr. Her presenterer vi et kostnadseffektivt alternativ for måling av mitofagi ved bruk av kommersielt tilgjengelige fluorescerende fargestoffer rettet mot mitokondrier og lysosomer. Denne metoden måler effektivt mitofagi i nematoden Caenorhabditis elegans og humane leverceller, noe som indikerer dens potensielle effektivitet i andre modellsystemer.
Introduction
Mitokondrier er essensielle for alle aerobe dyr, inkludert mennesker. De konverterer den kjemiske energien til biomolekyler til adenosintrifosfat (ATP) via oksidativ fosforylering1, syntetiserer heme2, nedbryter fettsyrer gjennom β oksidasjon3, regulerer kalsium4 og jern 5-homeostase, kontrollerer celledød ved apoptose6 og genererer reaktive oksygenarter (ROS), som spiller en viktig rolle i redokshomeostase7. To komplementære og motsatte prosesser opprettholder integriteten og riktig funksjon av mitokondriene: syntesen av nye mitokondrielle komponenter (biogenese) og selektiv fjerning av skadede gjennom mitokondriell autofagi (dvs. mitofagi)8.
Flere mitofagiveier medieres av enzymer, som PINK1 / Parkin, og reseptorer, inkludert FUNDC1, FKBP8 og BNIP / NIX 9,10. Spesielt kan den selektive nedbrytningen av mitokondrielle komponenter forekomme uavhengig av autofagosommaskineriet (dvs. gjennom mitokondrielle avledede vesikler)11. Imidlertid er endepunktene til de forskjellige selektive mitofagiveiene like (dvs. mitokondriell nedbrytning av lysosomale enzymer)12,13. Av denne grunn er ulike metoder for å identifisere og måle mitofagi avhengig av samlokalisering av mitokondrielle og lysosomale markører 14,15,16,17 og reduserte nivåer av mitokondrielle proteiner / mitokondrielt DNA 18.
Nedenfor er en kortfattet beskrivelse av eksisterende eksperimentelle metoder for måling av mitofagi i dyreceller ved bruk av fluorescensmikroskopi, med vekt på mitofagy-endepunktfasen.
Mitophagy biosensorer
Mitokondriell nedbrytning skjer i det sure miljøet i lysosomet19. Derfor opplever mitokondrielle komponenter, inkludert proteiner, et skifte fra en nøytral til en sur pH ved endepunktet av mitofagiprosessen. Dette mønsteret underbygger virkningsmekanismen til flere mitofagibiosensorer, inkludert mito-Rosella18 og tandem mCherry-GFP-FIS114. Disse sensorene inneholder et pH-følsomt grønt fluorescensprotein (GFP) og et pH-ufølsomt rødt fluorescensprotein (RFP). Derfor, ved endepunktet for mitofagi, faller det grønne til røde fluorescensforholdet betydelig på grunn av slukkingen av GFP-fluoroforen. De største begrensningene til disse sensorene er (1) mulig Förster resonans energioverføring (FRET) mellom fluoroforene; (2) differensialmodningsgraden av GFP og RFP; (3) dissosiasjon mellom GFP og RFP på grunn av proteolytisk spaltning av polypeptidet som forbinder dem; (4) fluorescens-utslipp overlapping; og (5) differensialfluoroforlysstyrke og slukking15,16.
En sensor som overvinner noen av disse begrensningene er Keima mitokondriesensor17. Mt-Keima-sensoren (avledet fra korallproteinet Keima) viser en enkelt utslippstopp (620 nm). Imidlertid er eksitasjonstoppene pH-følsomme. Som et resultat er det en overgang fra en grønn eksitasjon (440 nm) til en rød (586 nm) når du skifter fra høy pH til en sur pH16,17. En nyere mitofagisensor, Mito-SRAI, har avansert feltet ved å tillate målinger i faste biologiske prøver20. Til tross for de mange fordelene med genetiske sensorer, for eksempel evnen til å uttrykke dem i bestemte vev / celler og målrette dem mot forskjellige mitokondrielle rom, har de også begrensninger. En begrensning er at de genetiske sensorene må uttrykkes i celler eller dyr, noe som kan være tid- og ressurskrevende.
I tillegg kan uttrykket av sensorene i mitokondriene selv påvirke mitokondriefunksjonen. For eksempel utvider uttrykker mitokondriell GFP (mtGFP) i C. elegans orm kroppsveggmuskler mitokondrienettverket21. Denne fenotypen avhenger av funksjonen til den stressaktiverte transkripsjonsfaktoren ATFS-1, som spiller en viktig rolle i aktiveringen av ufoldet proteinrespons i mitokondrier (UPRmt)21. Derfor, selv om genetisk kodede mitokondrier / mitofagibiosensorer er ekstremt nyttige for å overvåke mitokondriehomeostase in vivo, kan de påvirke selve prosessen de er designet for å måle.
Mitokondrier/lysosomspesifikke antistoffer og fargestoffer
En annen strategi for å teste mitokondriell/lysosom-kolokalisering er å bruke antistoffer mot mitokondrielle/lysosomale proteiner, slik som det mitokondrielle ytre membranproteinet TOM20 og lysosomalt assosiert membranprotein 1 (LAMP1)22. I de fleste tilfeller brukes sekundære antistoffer som er konjugert til en fluorofor for å oppdage fluorescenssignalet via mikroskopi. En annen strategi er å kombinere genetiske konstruksjoner med mitokondrielle / lysosomale fargestoffer, for eksempel å uttrykke en LAMP1: GFP-fusjonskonstruksjon i celler mens du farger dem med et rødt mitokondrielt fargestoff (f.eks. Mitotracker Red) 16. Disse metodene, selv om de er effektive, krever spesifikke antistoffer og involverer ofte arbeid med faste prøver eller generering av celler / transgene dyr som uttrykker fluorescerende merkede mitokondrier / lysosomer.
Her skisserer vi bruken av et kommersielt lysosom / mitokondrier / nukleært fargesett for å vurdere mitofagiaktiverende egenskaper av syntetisk diamin O, O (oktan-1,8-diyl) bis (hydroksylamin), heretter referert til som VL-85023, i C. elegans ormer og den humane kreftcellelinjen Hep-3B (figur 1). Fargesettet inneholder en blanding av lysosomale / mitokondrielle / kjernefysiske målrettede fargestoffer som spesifikt flekker disse organellene23. Vi har tidligere brukt dette settet for å demonstrere mitofagiaktiviteten til 1,8 diaminooktan (heretter kalt VL-004) i C. elegans23. Det er viktig at vi validerte fargesettresultatene med mito-Rosella biosensor og qPCR-målinger av mitokondrielt: nukleært DNA-innhold23. Dette fargesettet gir følgende fordeler. For det første er det ikke nødvendig å generere transgene dyr eller celler som uttrykker en mitokondriell biosensor. Derfor kan vi studere umodifiserte dyr eller celler av villtype og dermed spare mye tid, penger og arbeidskraft. Dessuten, som nevnt, kan uttrykke mitokondrielle biosensorer endre mitokondriefunksjonen. For det andre er settet kostnadseffektivt, enkelt å bruke og raskt. For det tredje, selv om vi demonstrerer metoden i C. elegans og humane celler, kan den modifiseres for andre celletyper og organismer.
Når det er sagt, som enhver metode, har fargesettprotokollen ulemper. For eksempel utføres inkubasjonen av ormene med reagenset i fravær av mat (vi har sett at selv døde bakterier reduserer fargeeffektiviteten betydelig). Selv om inkubasjonstiden er relativt kort, er det mulig at selv i denne tidsrammen kan homeostatiske responser endres, inkludert mitofagi. I tillegg kan bindingen av fargestoffene til ER / mitokondrielle / nukleære proteiner og andre biomolekyler påvirke aktivitetene til disse organellene. Dessuten, i motsetning til mitofagimåling med genetiske sensorer, jobber vi med ormer og celler som har gjennomgått kjemisk fiksering. Det er derfor umulig å fortsette overvåkingen av de samme ormene/cellene til forskjellige tider. Derfor anbefaler vi å kombinere ulike metoder for å validere funksjonen til mitofagi i en bestemt fysiologisk prosess. Nedenfor presenterer vi nye data som viser at VL-850 induserer robust mitofagi i C. elegans ormer og Hep-3B-celler. Derfor støtter disse dataene ytterligere hypotesen om at VL-850 forlenger levetiden til C. elegans og beskytter C. elegans mot oksidativ skade gjennom induksjon av sunn mitofagi . Vi har brukt protonionoforkarbonylcyanid 4-(trifluormetoksy)fenylhydrazon (FCCP), som er en potent mitofaginduktor24, som positiv kontroll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere mitofagiveier involverer forskjellige proteiner og biomolekyler (f.eks. Kardiolipin29). Imidlertid er endepunktet for disse veiene likt – nedbrytningen av mitokondrier av lysosomale enzymer12,13. Faktisk bruker flere metoder dette endepunktet for å kvantifisere mitofagi. Noen metoder, som elektronmikroskopi, krever imidlertid tilgang til kostbart utstyr, trente eksperter og en utvidet forberedelsestid for prøvene og analysen. Vider…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Gross-laboratoriet for kritisk lesing av manuskriptet og deres kommentarer og råd. Vi takker Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som er finansiert av National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), for å gi noen av stammene. Denne forskningen ble støttet av et stipend fra Vitalunga Ltd og Israel Science Foundation (stipend nr. 989/19). Den grafiske abstrakte figuren (figur 1) ble generert med BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
