Detektion av mitofagi i Caenorhabditis elegans och däggdjursceller med användning av organellspecifika färgämnen
Summary
Att utforska mitofagi genom elektronmikroskopi, genetiska sensorer och immunofluorescens kräver dyr utrustning, kompetent personal och en betydande tidsinvestering. Här demonstrerar vi effekten av ett kommersiellt fluorescensfärgningskit för att kvantifiera mitofagiprocessen i både Caenorhabditis elegans och en levercancercellinje.
Abstract
Mitokondrier är viktiga för olika biologiska funktioner, inklusive energiproduktion, lipidmetabolism, kalciumhomeostas, hembiosyntes, reglerad celldöd och generering av reaktiva syreradikaler (ROS). ROS är avgörande för viktiga biologiska processer. Men när de är okontrollerade kan de leda till oxidativ skada, inklusive mitokondriell skada. Skadade mitokondrier släpper ut mer ROS, vilket intensifierar cellulär skada och sjukdomstillståndet. En homeostatisk process som heter mitokondriell autofagi (mitofagi) tar selektivt bort skadade mitokondrier, som sedan ersätts av nya. Det finns flera mitofagivägar, med den gemensamma slutpunkten är nedbrytningen av de skadade mitokondrierna i lysosomer.
Flera metoder, inklusive genetiska sensorer, antikroppsimmunofluorescens och elektronmikroskopi, använder denna slutpunkt för att kvantifiera mitofagi. Varje metod för att undersöka mitofagi har sina fördelar, såsom specifik vävnad / cellinriktning (med genetiska sensorer) och stor detalj (med elektronmikroskopi). Dessa metoder kräver dock ofta dyra resurser, utbildad personal och en lång förberedelsetid före själva experimentet, till exempel för att skapa transgena djur. Här presenterar vi ett kostnadseffektivt alternativ för att mäta mitofagi med kommersiellt tillgängliga fluorescerande färgämnen riktade mot mitokondrier och lysosomer. Denna metod mäter effektivt mitofagi i nematoden Caenorhabditis elegans och humana leverceller, vilket indikerar dess potentiella effektivitet i andra modellsystem.
Introduction
Mitokondrier är viktiga för alla aeroba djur, inklusive människor. De omvandlar biomolekylernas kemiska energi till adenosintrifosfat (ATP) via oxidativ fosforylering1, syntetiserar heme2, bryter ned fettsyror genom β oxidation3, reglerar kalcium4 och järn 5-homeostas, kontrollerar celldöd genom apoptos6 och genererar reaktiva syreradikaler (ROS), som spelar en viktig roll i redoxhomeostas7. Två komplementära och motsatta processer upprätthåller mitokondriernas integritet och korrekta funktion: syntesen av nya mitokondriella komponenter (biogenes) och selektivt avlägsnande av skadade genom mitokondriell autofagi (dvs mitofagi)8.
Flera mitofagivägar medieras av enzymer, såsom PINK1 / Parkin, och receptorer, inklusive FUNDC1, FKBP8 och BNIP / NIX 9,10. I synnerhet kan den selektiva nedbrytningen av mitokondriella komponenter ske oberoende av autofagosommaskineriet (dvs. genom mitokondriella härledda vesiklar)11. Endpoints för de olika selektiva mitofagivägarna är dock likartade (dvs. mitokondriell nedbrytning av lysosomala enzymer)12,13. Av denna anledning bygger olika metoder för att identifiera och mäta mitofagi på samlokalisering av mitokondriella och lysosomala markörer 14,15,16,17 och minskade nivåer av mitokondriella proteiner/mitokondriellt DNA 18.
Nedan följer en kortfattad beskrivning av de befintliga experimentella metoderna för mätning av mitofagi i djurceller med hjälp av fluorescensmikroskopi, med betoning på mitofagislutpunktsfasen.
Mitophagy biosensorer
Mitokondriell nedbrytning sker inom den sura miljön i lysosomen19. Därför upplever mitokondriella komponenter, inklusive proteiner, ett skifte från ett neutralt till ett surt pH vid slutpunkten för mitofagiprocessen. Detta mönster ligger till grund för verkningsmekanismen för flera mitofagibiosensorer, inklusive mito-Rosella18 och tandem mCherry-GFP-FIS114. Dessa sensorer innehåller ett pH-känsligt grönt fluorescensprotein (GFP) och ett pH-okänsligt rött fluorescensprotein (RFP). Därför sjunker det gröna till röda fluorescensförhållandet signifikant vid mitofagiens slutpunkt på grund av släckningen av GFP-fluoroforen. De största begränsningarna hos dessa sensorer är (1) möjlig Förster-resonansenergiöverföring (FRET) mellan fluoroforerna; (2) den differentierade mognadsgraden för GFP och RFP; (3) dissociation mellan GFP och RFP på grund av proteolytisk klyvning av polypeptiden som förbinder dem; 4) Överlappning mellan fluorescens och emission. och (5) differentiell fluoroforljusstyrka och släckning15,16.
En sensor som övervinner några av dessa begränsningar är Keima mitokondriell sensor17. mt-Keima-sensorn (härledd från korallproteinet Keima) visar en enda emissionstopp (620 nm). Dess excitationstoppar är dock pH-känsliga. Som ett resultat sker en övergång från en grön excitation (440 nm) till en röd (586 nm) vid övergång från ett högt pH till ett surt pH16,17. En nyare mitofagisensor, Mito-SRAI, har avancerat fältet genom att möjliggöra mätningar i fasta biologiska prover20. Men trots de många fördelarna med genetiska sensorer, såsom förmågan att uttrycka dem i specifika vävnader / celler och rikta dem till distinkta mitokondriella fack, har de också begränsningar. En begränsning är att de genetiska sensorerna behöver uttryckas i celler eller djur, vilket kan vara tidskrävande och resurskrävande.
Dessutom kan uttrycket av sensorerna inom mitokondrierna själva påverka mitokondriell funktion. Till exempel, att uttrycka mitokondriell GFP (mtGFP) i C. elegans maskkroppsväggsmuskler expanderar mitokondriellt nätverk21. Denna fenotyp beror på funktionen hos den stressaktiverade transkriptionsfaktorn ATFS-1, som spelar en viktig roll vid aktivering av veckat proteinsvar i mitokondrier (UPRmt)21. Därför, även om genetiskt kodade mitokondrier / mitofagibiosensorer är extremt användbara för övervakning av mitokondriernas homeostas in vivo, kan de påverka själva processen de är utformade för att mäta.
Mitokondrier/lysosomspecifika antikroppar och färgämnen
En annan strategi för att testa mitokondriell/lysosomsamlokalisering är att använda antikroppar mot mitokondriella/lysosomala proteiner, såsom det mitokondriella yttermembranproteinet TOM20 och lysosomalt associerat membranprotein 1 (LAMP1)22. I de flesta fall används sekundära antikroppar som är konjugerade till en fluorofor för att detektera fluorescenssignalen via mikroskopi. En annan strategi är att kombinera genetiska konstruktioner med mitokondriella/lysosomala färgämnen, såsom att uttrycka en LAMP1::GFP-fusionskonstruktion i celler samtidigt som de färgas med ett rött mitokondriellt färgämne (t.ex. Mitotracker Red)16. Dessa metoder, även om de är effektiva, kräver specifika antikroppar och involverar ofta att arbeta med fasta prover eller generera celler / transgena djur som uttrycker fluorescerande märkta mitokondrier / lysosomer.
Här beskriver vi användningen av ett kommersiellt lysosom/mitokondrier/nukleärt färgningskit för att bedöma mitofagiaktiverande egenskaper hos syntetisk diamin O,O (oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin), nedan kallad VL-85023, i C. elegans-maskar och den humana cancercellinjen Hep-3B (figur 1). Färgningssatsen innehåller en blandning av lysosomala / mitokondriella / kärnriktade färgämnen som specifikt fläckar dessa organeller23. Vi har tidigare använt detta kit för att demonstrera mitofagiaktiviteten hos 1,8 diaminooktan (nedan kallad VL-004) i C. elegans23. Viktigt är att vi validerade färgningssatsresultaten med mito-Rosella-biosensorn och qPCR-mätningar av mitokondriell: nukleärt DNA-innehåll23. Detta färgningssats erbjuder följande fördelar. För det första finns det inget behov av att generera transgena djur eller celler som uttrycker en mitokondriell biosensor. Därför kan vi studera omodifierade vilda djur eller celler och därmed spara mycket tid, pengar och arbete. Dessutom, som nämnts, kan uttryck för mitokondriella biosensorer förändra mitokondriell funktion. För det andra är satsen kostnadseffektiv, enkel att använda och snabb. För det tredje, även om vi demonstrerar metoden i C. elegans och humana celler, kan den modifieras för andra celltyper och organismer.
Med det sagt, som alla metoder, har färgningssatsprotokollet nackdelar. Till exempel utförs inkubationen av maskarna med reagenset i frånvaro av mat (vi har sett att även döda bakterier signifikant minskar färgningseffektiviteten). Även om inkubationstiden är relativt kort är det möjligt att även inom denna tidsram kan homeostatiska svar förändras, inklusive mitofagi. Dessutom kan bindningen av färgämnena till ER / mitokondriella / nukleära proteiner och andra biomolekyler påverka aktiviteterna hos dessa organeller. Dessutom, till skillnad från mitofagimätning med genetiska sensorer, arbetar vi med maskar och celler som har genomgått kemisk fixering. Därför är det omöjligt att fortsätta övervaka samma maskar/celler vid olika tidpunkter. Därför rekommenderar vi att man kombinerar olika metoder för att validera mitofagiens funktion i en viss fysiologisk process. Nedan presenterar vi nya data som visar att VL-850 inducerar robust mitofagi i C. elegans-maskar och Hep-3B-celler. Därför stöder dessa data ytterligare hypotesen att VL-850 förlänger livslängden hos C. elegans och skyddar C. elegans från oxidativ skada genom induktion av frisk mitofagi . Vi har använt protonjonoforen karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi)fenylhydrazon (FCCP), som är en potent mitofagiinducerare24, som en positiv kontroll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera mitofagivägar involverar olika proteiner och biomolekyler (t.ex. kardiolipin29). Slutpunkten för dessa vägar är dock liknande – nedbrytningen av mitokondrier av lysosomala enzymer12,13. Faktum är att flera metoder använder denna slutpunkt för att kvantifiera mitofagi. Vissa metoder, såsom elektronmikroskopi, kräver dock tillgång till dyr utrustning, utbildade experter och en förlängd förberedelsetid för proverna och ana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Gross-laboratoriet för den kritiska läsningen av manuskriptet och deras kommentarer och råd. Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), för att tillhandahålla några av stammarna. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Vitalunga Ltd och Israel Science Foundation (bidrag nr 989/19). Den grafiska abstrakta figuren (figur 1) genererades med BioRender.com.
Materials
| Reagent or resource | |||
| Analytical balance | Mettler-Toledo | ||
| Bacto Agar | BD-Difco | 214010 | |
| Bacto Peptone | BD-Difco | 211677 | |
| Bacto Tryptone | BD-Difco | 211705 | |
| Bacto Yeast extract | BD-Difco | 212750 | |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
| Chemicals | |||
| Cholestrol | Thermo Fisher | C/5360/48 | |
| DMEM high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Double distilled water (DDW) | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| FBS heat inactivated | Invitrogen | M7514 | |
| Gluteradehyde (25%) | Sigma | G5882 | |
| HEPES Buffer 1 M | Biological Industries | 03-025-1B | |
| L-gluatamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent | Abcam | ab139487 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M7506 | |
| Nonidet P 40 | Sigma | 74385 | |
| Paraformalydehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15720 | |
| Poloxamer 188 Solution | Sigma | P5556 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Millipore | 1.04873.1000 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P3786 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab | 1903059100 | |
| Sodium Hydroxide | Gadot | 1310732 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sigma | 4273 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | 87128-25G | |
| Trypsin-EDTA | Biological Industries | 03-052-1A | |
| VL-850: 1,8-diaminooxy-octane | Patented | ||
| Glass/Plastic Disposables | |||
| 0.22 μm syringe filter | Millex GV | SLGV033RS | |
| 1.7 mL Micro Centrifuge Tubes | Lifegene | LMCT1.7B-500 | |
| 10 cm Petri plates | Corning | 430167 | |
| 1,000 mL Erlenmeyer Flask | IsoLab, Germany | ||
| 15 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB15-500 | |
| 35 mm Petri dishes | Bar Naor | BN9015810 | |
| 500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm | Lifegene | LG-FPE205500S | |
| 50 mL Sterile Polypropylene tube | Lifegene | LTB50-500 | |
| Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass | Pyrex | 99445-13 | |
| iBiDi 8 well μ-slides | iBiDi | 80826 | |
| Microscope cover glass 24 x 40 mm | Bar Naor | BN1052421ECALN | |
| Platinum iridium 0.25 mM wire | World Precision Instruments | PT1002 | |
| Instruments | |||
| Cell counter CellDrop BF | DeNovix | CellDrop BF-UNLTD | |
| Microspin FV-2400 | Biosan | BS-010201-AAA | |
| Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software | Nikon | CSU-W1 | |
| Olympus SZ61 stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | MT30019032 | |
| Revolver Adjustable Lab Rotator | Labnet | H5600 |
References
- Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
- Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
- Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
- Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
- Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
- Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
- Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
- Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
- Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
- Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
- Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
- Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
- Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
- Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
- Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
- Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
- Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
- Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).
