Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Kemisk kortlægning af G-quadruplex DNA-strukturer af bis-3-chloropiperidiner

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65373
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2Institute of Organic Chemistry, Justus Liebig University Giessen

Summary

Bis-3-chlorpiperidiner (B-CeP'er) er nyttige kemiske sonder til at identificere og karakterisere G-quadruplex strukturer i DNA-skabeloner in vitro. Denne protokol beskriver proceduren til udførelse af sondereaktioner med B-CeP'er og til opløsning af reaktionsprodukter ved polyacrylamidgelelektroforese med høj opløsning.

Abstract

G-quadruplexes (G4s) er biologisk relevante, ikke-kanoniske DNA-strukturer, der spiller en vigtig rolle i genekspression og sygdomme, der repræsenterer betydelige terapeutiske mål. Tilgængelige metoder er nødvendige til in vitro karakterisering af DNA inden for potentielle G-quadruplex-dannende sekvenser (PQS'er). B-CeP'er er en klasse af alkyleringsmidler, der har vist sig at være nyttige kemiske sonder til undersøgelse af nukleinsyrers højere ordens struktur. Dette papir beskriver et nyt kemisk kortlægningsassay, der udnytter den specifikke reaktivitet af B-CeP'er med N7 af guaniner, efterfulgt af direkte strengspaltning ved de alkylerede Gs.

For at skelne G4-folder fra udfoldede DNA-former bruger vi nemlig B-CeP 1 til at sonde trombinbindende aptamer (TBA), et 15-mer DNA, der er i stand til at antage G4-arrangementet. Reaktion af B-CeP-responderende guaniner med B-CeP 1 giver produkter, der kan opløses ved polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) med høj opløsning på et enkeltnukleotidniveau ved at lokalisere individuelle alkyleringsaddukter og DNA-strengspaltning ved de alkylerede guaniner. Kortlægning ved hjælp af B-CeP'er er et simpelt og kraftfuldt værktøj til in vitro-karakterisering af G-quadruplex-dannende DNA-sekvenser, der muliggør den præcise placering af guaniner involveret i dannelsen af G-tetrader.

Introduction

Ud over den typiske Watson-Crick-dobbelthelix kan nukleinsyrer vedtage forskellige sekundære strukturer, såsom den alternative G-quadruplex (G4) form på grund af deres guaninrige sekvenser. G4-strukturen er baseret på dannelsen af plane tetramerer, kaldet G-tetrader, hvor fire guaniner interagerer gennem Hoogsteen-hydrogenbindinger. G-tetrader stables og stabiliseres yderligere af monovalente kationer, der koordineres i midten af guaninkernen (figur 1)1.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af en G-quadruplex-struktur. (A) Skematisk gengivelse af en G-tetrad. Det plane array stabiliseres ved Hoogsteen baseparring og ved en central kation (M +). Klik her for at se en større version af denne figur.

Sekvenser med fire eller flere kørsler af mindst to på hinanden følgende guaninnukleotider er potentielle G-quadruplex-dannende sekvenser (PQS'er), der kan foldes i G-quadruplex-strukturer. PQS'er er placeret i mange forskellige cellulære sammenhænge, såsom telomerer, genpromotorer, ribosomalt DNA og rekombinationssteder, og er involveret i reguleringen af mange biologiske processer2. Derfor er identifikation og eksperimentel validering af G4s i det menneskelige genom, som i øjeblikket primært udføres ved hjælp af beregningsværktøjer, et biologisk relevant spørgsmål3. For at understøtte beregningsmæssige forudsigelser eller detektere uforudsigelige G4-strukturer vises her en tilgængelig metode baseret på kemisk kortlægning til at identificere G4-dannelsen i en DNA-skabelon, hvilket muliggør præcis identifikation af guaniner, der danner G-tetradstrukturen.

Det rapporterede kemiske kortlægningsassay udnytter den forskellige reaktivitet af bis-3-chlorpiperidiner (B-CeP'er) med guaniner efter dannelsen af G4-strukturer. På grund af deres høje reaktivitet med nukleofiler 4,5,6,7,8,9 er B-CeP'er nukleinsyre-alkyleringsmidler med evnen til at reagere meget effektivt med N7-positionen af guaninnukleotider10. Alkylering efterfølges af depurination og strengspaltning i enkelt- og dobbeltstrengede DNA-konstruktioner. Tværtimod er guaniner, der er involveret i dannelsen af G-tetraderne i G4-arrangementer, uigennemtrængelige for B-CeP-alkylering, da guaninernes N7-positioner impliceret i Hoogsteen-hydrogenbindingerne. Denne specifikke reaktivitet af B-CeP'er tillader ikke kun påvisning af G4-strukturer, men også identifikation af guaninerne, der danner tetraden (e), da de kan udledes af deres relative beskyttelse mod alkylering sammenlignet med guaniner i enkelt- og dobbeltstrenget DNA.

Den kemiske kortlægningsprotokol rapporteres her ved hjælp af B-CeP 1 (figur 2A) som en sonde til karakterisering af thrombinbindende aptamer (TBA), et 15-mer DNA, der er i stand til at antage G4-arrangementet i nærvær af kaliumkationer11,12. G4-arrangementet af TBA (G4-TBA) sammenlignes direkte med to kontroller, nemlig TBA i enkeltstrenget form (ssTBA) og TBA udglødet til dets komplementære sekvens for at danne den dobbeltstrengede konstruktion (dsTBA) (tabel 1). Produkter af sondereaktioner opløses ved polyacrylamidgelelektroforese med høj opløsning (PAGE) på enkeltnukleotidniveau ved at lokalisere individuelle alkyleringsaddukter og DNA-strengspaltning ved de alkylerede guaniner. Visualisering på gelen muliggøres ved konjugering af TBA-oligonukleotiden med en fluorofor i dens 3'-ende (tabel 1). Denne protokol viser, hvordan man folder TBA i dens forskellige konformationer (G4 og kontroller), og hvordan man udfører sonderende reaktioner med B-CeP'er efterfulgt af PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nukleinsyre og kemisk sondeforberedelse

  1. Nukleinsyrer
    BEMÆRK: Oligonukleotidet med navnet "TBA" er 15-mer DNA-sekvensen 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' mærket i 3'-enden af fluoroforen 5-carboxyfluorescein (FAM) for at muliggøre visualisering på gelen. Det umærkede oligonukleotid "cTBA" er dets DNA-komplementære sekvens 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA og cTBA anvendes til at opnå de tre forskellige strukturer, som vist i tabel 1.
    1. Autoklavespidser og 0,5 ml rør for at opnå sterile engangsartikler og undgå kontaminering.
    2. Forbered stamopløsninger, der opløser hvert oligonukleotid i ultrarent vand til en slutkoncentration på 100 μM. Bestem den nøjagtige oligonukleotidkoncentration med et ultraviolet-synligt (UV-Vis) spektrofotometer ved hjælp af ekstinktionskoefficienten ved 260 nm leveret af producenten.
      BEMÆRK: Udryddelseskoefficienter: 164.300 M-1 cm-1 og 138.600 M-1 cm-1 blev brugt til henholdsvis TBA og cTBA.
    3. Opbevar TBA- og cTBA-stamopløsninger ved -20 °C (i flere måneder under disse forhold).
  2. Forbindelse B-CeP 1
    BEMÆRK: Forbindelsen B-CeP 1 syntetiseres som tidligere rapporteret6.
    1. Forbered B-CeP 1-stamopløsningen ved ~10 mM. Der afvejes ~1 mg frysetørret forbindelse ved hjælp af en analysevægt anbragt i en stinkhætte og opløses i 100% dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Beregn den nøjagtige sammensatte koncentration baseret på den faktiske mængde forbindelse og DMSO (d = 1,1 g /cm3) anvendt.
      BEMÆRK: Håndter altid forbindelsen med handsker (både når den frysetørrede og når den opløses i DMSO)13,14.

Tabel 1: Oligonukleotidstrukturer anvendt i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

2. Foldning af nukleinsyrekonstruktioner

  1. Forberedelse af buffere
    1. Der fremstilles en BPE-stødpudeopløsning (biphosphatethylendiamintetraeddikesyre [EDTA], 5x: 2 mMNaH2PO4, 6 mM Na2 HPO 4, 1 mMNa2EDTA, pH7,4) og en opløsning af 500 mM KCl i ultrarent vand. Filtrer opløsningerne gennem 0,22 μm porestørrelsesfiltre.
      BEMÆRK: Brug frisklavede opløsninger for at opnå de bedste resultater. BPE-bufferen kan opbevares ved 4 °C i op til 15 dage.
  2. Foldning af G4-TBA-, ssTBA- og dsTBA-prøver ved varmefoldningsproceduren
    BEMÆRK: Kaliumkationer er nødvendige for at folde G4-strukturen (G4-TBA). Tilsæt ikke kaliumkationer i foldeopløsningen af kontrollerne ssTBA og dsTBA.
    1. Der fremstilles 40 μL af en 4 μM opløsning af G4-TBA i 1x BPE og 100 mM KCl. Oligonukleotid G4-TBA-opløsningen denatureres ved at opvarme røret til 95 °C i 5 minutter og afkøles langsomt til stuetemperatur (RT), så TBA'en kan foldes sammen til G-quadruplexer.
    2. Forbered 40 μL af en 4 μM opløsning af ssTBA i 1x BPE. Udfør varmefoldningsproceduren, som nævnt i trin 2.2.1, for at folde TBA i sin enkeltstrengede form.
    3. Forbered 40 μL af en 4 μM opløsning af dsTBA ved at blande ækvimolære mængder TBA og cTBA i 1x BPE. Udfør varmefoldningsproceduren som nævnt ovenfor (trin 2.2.1) for TBA at anneal til sin komplementære sekvens cTBA og danne den dobbeltstrengede form af TBA.
      BEMÆRK: Det endelige volumen af hver foldeopløsning er baseret på antallet af prøver til sondereaktionerne, idet der tages hensyn til, at der vil være behov for 5 μL 4 μM-opløsning til hver prøve. Forbered lidt overskydende volumen af hver opløsning for at undgå pipetteringsfejl.

3. Undersøgelse af reaktioner

BEMÆRK: Sondereaktioner skal udføres umiddelbart efter varmefoldningsproceduren.

  1. Når foldeopløsningerne af G4-TBA, ssTBA og dsTBA er afkølet til RT, udføres en centrifugering med kort centrifugering (7.000 × g i 5-8 s ved RT) og starter sondereaktionerne.
  2. Forbered 21 tomme 0,5 ml autoklaverede rør. Organiser dem i tre sæt af syv rør hver i stativet til laboratorieprøver, som rapporteret i tabel 2.
    BEMÆRK: Hvert kolonnesæt svarer til de tre forskellige TBA-foldebetingelser G4-TBA, ssTBA og dsTBA. Hver række svarer til tre forskellige inkubationstider. Hver celle i kolonnen svarer til den endelige B-CeP 1-sondekoncentration (tabel 2). Sørg for at mærke rørene tydeligt.
  3. Tilsæt 3 μL ultrarent vand i hvert rør.
  4. Der tilsættes 5 μL foldet G4-TBA i hvert rør i det første sæt (trin 3.2). Tilsæt 5 μL foldet ssTBA i hvert rør i det andet sæt. Tilsæt 5 μL foldet dsTBA i hvert rør i det tredje sæt.
  5. B-CeP 1-stamopløsningen fortyndes til 250 μM og 25 μM i ultrarent vand.
    BEMÆRK: Fortyndinger af den kemiske sonde B-CeP 1 skal være frisklavede og straks reageret med DNA-substratet for at undgå konkurrerende reaktioner med vand.
  6. Der tilsættes 2 μL af den relevante B-CeP 1-fortynding (25 μM og 250 μM) til prøverne. Udskift forbindelsen med ultrarent vand i de tre kontrolprøver (C) til analyse af de forskelligt foldede TBA'er i fravær af forbindelsen. Alle prøverne inkuberes ved 37 °C.
  7. Efter 1 time, 4 timer og 15 timers inkubation standses reaktionen ved at anbringe glassene ved -20 °C indtil næste trin.
    BEMÆRK: Prøverne kan opbevares under disse forhold i et par dage.
  8. Prøverne tørres i en vakuumcentrifuge.
    BEMÆRK: De tørrede prøver kan opbevares ved -20 °C i uger, før PAGE-analysen fortsættes.

Tabel 2: Prøver for sondereaktioner (strukturer, sondekoncentrationer og inkubationstid). Hvert kolonnesæt svarer til de tre forskellige TBA-foldebetingelser (G4-TBA, ssTBA og dsTBA). Hver række svarer til tre forskellige inkubationstider (1, 4, 15 timer). Hver celle i kolonnen svarer til den endelige B-CeP 1-sondekoncentration (5 eller 50 μM). Kontrollen (C) for hvert sæt svarer til en prøve af de forskelligt foldede TBA'er, der er inkuberet i længere tid (15 timer) i fravær af forbindelse. Klik her for at downloade denne tabel.

4. SIDE i høj opløsning

  1. Fremstilling af denatureringspolyacrylamidopløsningen
    BEMÆRK: Forbered på forhånd 500 ml 20% denaturerende polyacrylamidgelopløsning. Omkring 80 ml af denne opløsning vil blive brugt til hvert forsøg. Brug en ravfarvet glasflaske eller dæk en glasflaske med aluminiumsfolie til at opbevare opløsningen hos RT.
    FORSIGTIG: Polyacrylamid er neurotoksisk. Under alle trin i gelforberedelse og hældning skal du bære handsker og en laboratoriefrakke. Kassér polymeriseret acrylamid i en passende kasse til kontaminerede materialer.
    1. Der afvejes 210 g urinstof i et 1 liters bægerglas. Der tilsættes 250 ml 40 % acrylamid/bisacrylamidopløsning (19/1) og 50 ml 10x TBE (890 mM Tris-HCI, 890 mM borat, 20 mM EDTA, pH 8).
    2. Bægerglasset anbringes på en røreplade og blandes med en omrøringsstang. Bægerglasset dækkes med aluminiumsfolie under blanding for at forhindre stænk og forurening.
    3. Bland opløsningen, indtil urinstoffet er helt opløst, og opløsningen er klar.
      BEMÆRK: Dette trin kan tage mange timer. For at fremme opløsningen af urinstof tilsættes en lille delprøve vand uden at gå ud over det ønskede endelige volumen.
    4. Fjern omrøringsstangen. Hæld opløsningen i en cylinder og tilsæt vand til et nøjagtigt slutvolumen på 500 ml.
  2. Opstilling af gelapparater
    1. Rengør to plader (en hakket og en uhakket) med 70% ethanol, lad dem tørre, og behandl derefter pladerne med en dimethyldichlorsilanopløsning.
      BEMÆRK: Silanisering kan springes over, selvom det hjælper frigivelsen af gelen fra en af pladerne, når gelsandwichen skilles ad.
      FORSIGTIG: Håndter silaniseringsopløsningen med handsker, og udfør pladebehandlingen med denne opløsning i en stinkhætte.
    2. Placer 0,4 mm afstandsstykkerne langs de lange kanter af den længere plade, placer den korte plade oven på den anden, og juster de to plader i bunden.
    3. Placer flere lag papirtape langs alle kanterne undtagen toppen.
    4. For at undgå lækager under støbning skal du tilføje et ekstra lag tape til bunden af gelen.
    5. Klip siderne af glassandwichen med rene klemmer efter leverandørens anvisninger (forskellige leverandører bruger lidt forskellige apparater, sandwichklemmer og pakninger).
  3. Hældning af gelen
    BEMÆRK: Hæld gelen ved RT (25 °C), da polyacrylamidpolymerisation er temperaturfølsom.
    1. I et bægerglas hældes 80 ml af den tidligere fremstillede denatureringspolyacrylamidopløsning (trin 4.1), 450 μL af en 10% m/V ammoniumpersulfatopløsning (APS) og 45 μl tetramethylethylendiamin (TEMED) umiddelbart før brug.
    2. Bland opløsningen og hæld den hurtigt ned mellem glaspladerne ved hjælp af en 50 ml sprøjte. Indfør kammen med det ønskede antal brønde mellem glaspladerne, undgå bobler. Tilsæt gelopløsning for at fylde sandwichen helt, hvis det er nødvendigt. Placer fire klemmer på kammen for at trykke ned og muliggøre jævn fordeling af brøndene.
    3. Lad gelen polymerisere i mindst 45 min.
  4. Kører gelen
    1. Efter polymerisationen fjernes alle klemmer og papirbåndlag. Fjern kammen langsomt og skyl brøndene grundigt med destilleret vand.
    2. Følg instruktionerne fra den specifikke leverandør for korrekt placering af gelsandwichen i det lodrette gelelektroforeseapparat.
    3. Forbered TBE-løbebuffer (1x: 89 mM Tris-HCI, 89 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8) i deioniseret vand og fyld både de øverste og nederste reservoirer med bufferen.
    4. Pladerne opvarmes ved at udføre en forkørsel af gelelektroforesen i mindst 30 minutter ved 50 W.
    5. Forbered denatureringsgelbelastningsbuffer (DGLB: 1 M Tris-HCI, 80% formamid, 50% glycerol, 0,05% bromphenolblåt) i ultrarent vand.
      BEMÆRK: GLB hjælper med at spore oligonukleotidprøvernes bevægelse ind i gelsystemet og gør det muligt at indlæse prøverne i gelens brønde. Tilstedeværelsen af denatureringsmidlet formamid gør det muligt for DNA-arter at adskille sig efter størrelse, selv i en ikke-denaturerende PAGE.
    6. De tørrede prøver (prøver fra trin 3.8) resuspenderes i 5 μl DGLB.
    7. Før prøverne lægges i, rengøres hullerne med en lille sprøjte og TBE-bufferen i det øverste bufferkammer for at fjerne urinstof fra hullerne.
      BEMÆRK: Gentag dette trin flere gange for nøjagtigt at rengøre brøndene, så du undgår bånd, der er vanskelige at fortolke.
    8. Læg prøverne i de rene brønde, og noter rækkefølgen af ilægningen.
    9. Kør gelelektroforesen i 2 timer ved 50 W, eller i det mindste indtil bromphenolblåt farvestof er kørt 2/3 ned i gelen.
  5. Billeddannelse af gelen
    1. Efter elektroforese skal du slukke for strømforsyningen, fjerne glassandwichen og rengøre brillerne.
    2. Detekter fluorescensen af de FAM-mærkede oligonukleotidbånd ved at scanne ved hjælp af et gelbilleddanner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser et repræsentativt resultat af et kemisk kortlægningsassay udført, som beskrevet i protokollen med B-CeP 1 på TBA-oligonukleotid foldet i tre forskellige strukturer. G-quadruplex arrangementet af TBA (G4-TBA) blev opnået ved foldning af oligonukleotidet i BPE og i nærvær af K + kationen, mens den enkeltstrengede form af den samme TBA-sekvens (ssTBA) blev foldet i fravær af kalium. Den dobbeltstrengede konstruktion (dsTBA) blev fremstillet ved at udgløde TBA til dens komplementære sekvens i BPE-bufferen. Enten en 5 eller 50 μM endelig koncentration af B-CeP 1 blev reageret med 2 μM-prøver af G4-TBA (venstre baner i figur 2B), ssTBA (centrale baner i figur 2B) og dsTBA (højre baner i figur 2B) i 1 time, 4 timer og 15 timer. Yderligere kontroller er DNA-konstruktionerne, der ikke reageres med sonden. Cirkulær dikroisme (CD) analyse af de tre forskellige TBA-foldninger bekræftede deres korrekte struktur (supplerende figur S1). CD-spektret af dsTBA var faktisk kendetegnet ved et positivt langbølgelængdebånd ved ~260-280 nm og et negativt bånd ved ~245 nm15, i overensstemmelse med en DNA-helix i sin B-form. ssTBA viste sig at være dårligt struktureret i fravær af K + ioner, mens G4-TBA folder i en anti-parallel G4 i nærvær af K + ioner, kendetegnet ved et negativt bånd ved 260 nm og et positivt bånd ved 290 nm15.

De højopløselige PAGE-resultater, der er rapporteret i figur 2B, giver et omfattende overblik over de tids- og koncentrationsafhængige reaktioner af B-CeP 1 mod G4-TBA, ssTBA og dsTBA, hvilket tydeligt afslører et markant anderledes alkyleringsmønster for G4-TBA sammenlignet med det, der blev observeret for ssTBA- og dsTBA-konstruktionerne. Bånd, der migrerer med lavere mobilitet end de ubehandlede prøver (C), er i overensstemmelse med DNA-substratalkylering. I tilfælde af G4-TBA-substratet observeres kun en alkyleringsaddukt tydeligt i henhold til tilstedeværelsen af kun en guanin (G8) tilgængelig til alkylering (nummerering af guaniner i figur 2C). Tværtimod skelnes der mellem flere addukter, når substratet enten er ssTBA eller dsTBA, hvor alle guaniner, der besidder N7-positionen, frit kan undersøges. Hurtigere migrerende bånd tilskrives i stedet produkterne fra strengspaltning. I tilfælde af G4-TBA-substratet er guaninerne (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15), der er involveret i G-quadruplex-tetrader, uigennemtrængelige for alkylering, mens G8 påvirkes af spaltning som et efterfølgende alkyleringstrin. I ssTBA- og dsTBA-konstruktionerne er alle guaniner modtagelige for spaltning, som det fremgår af de mange bånd, der detekteres, som gradvist bliver mere intense ved længere inkubationstider.

Denne protokol giver mulighed for diskrimination mellem guaninerne involveret i dannelsen af G-quadruplex tetraderne og guaninerne, der ikke er impliceret i et sådant arrangement, hvilket belyser G4-TBA-strukturen (figur 2C).

En mulig ulempe ved eksperimentet er tilstedeværelsen af uønskede nukleofiler i reaktionsmiljøet. For eksempel konkurrerer nukleofiler, der stammer fra salte i reaktionsbufferen, med DNA om reaktiviteten med B-CeP'er, hvilket fører til ineffektiv reaktion af sonden med substratet. Figur 3 viser resultaterne af sondereaktionerne udført i Tris-bufferen, som indeholder den nukleofile Tris-base. B-CeP 1 (5 og 50 μM) reageres med 2 μM-prøver af G4-TBA (venstre baner i figur 3), ssTBA (centrale baner i figur 3) og dsTBA (højre baner i figur 3) i 1 time, 4 timer, 15 timer og 24 timer. Under disse forhold reduceres sondens reaktivitet mod alle tre DNA-substrater tydeligt. For G4-TBA-prøverne kan vi kun observere dannelsen af addukter uden at detektere strengspaltning. I tilfælde af ssTBA og dsTBA er DNA-fragmenteringen først efter 24 timer sammenlignelig med den, der observeres efter 15 timers inkubation i figur 2B. Den uønskede konkurrerende reaktivitet af B-CeP'er med Tris fører til mangel på nukleinsyrestrukturel information.

Figure 2
Figur 2: Kemisk kortlægning af en TBA G-quadruplex struktur ved B-CeP 1 i BPE-buffer. (A) B-CeP's kemiske struktur 1. B) Tids- og koncentrationsafhængighed af sondereaktionerne mellem B-CeP 1 og TBA i BPE-bufferen. Alikvoter af TBA blev foldet under tre forskellige betingelser for at opnå G-quadruplex-arrangementet (G4-TBA), det enkeltstrengede oligonukleotid (ssTBA) og TBA udglødet til dets komplementære sekvens for at danne den dobbeltstrengede konstruktion (dsTBA). TBA-oligonukleotidet blev mærket i 3'-enden med en fluorofor (FAM) for at muliggøre visualisering på gelsystemet. Alikvoter (2 μM) G4-TBA, ssTBA og dsTBA blev behandlet med B-CeP 1 ved enten en 5 eller 50 μM slutkoncentration i BPE-buffer og inkuberet ved 37 °C i det angivne tidsrum. Resultatet af sondereaktionerne blev analyseret ved højopløsnings denaturerende PAGE (20% polyacrylamid [PAA], 7 M urinstof, 1x TBE). "C" angiver kontrolprøven for hver TBA-konstruktion. (C) Tegneserie af G-quadruplex arrangementet af G4-TBA og nummerering af guaniner i TBA-sekvensen. Den eneste guanin, der ikke var involveret i G4-strukturen og dermed reagerede med B-CeP 1, er fremhævet med rødt. Den grønne stjerne repræsenterer fluoroforen FAM. Forkortelser: TBA = trombinbindende aptamer; B-CeP1 = bis-3-chloropiperidin 1; BPE = biphosphat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkeltstrenget; ds = dobbeltstrenget; FAM = 5-carboxyfluorescein; PAA = polyacrylamid; PAGE = polyacrylamidgelelektroforese; TBE = Tris-borat-EDTA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Ineffektiv kemisk kortlægning i nærvær af Tris-buffer. Tids- og koncentrationsafhængighed af sondereaktionerne mellem B-CeP 1 og TBA i Tris buffer. Alikvoter af TBA blev foldet under tre forskellige betingelser for at opnå G-quadruplex-arrangementet (G4-TBA), det enkeltstrengede oligonukleotid (ssTBA) og TBA udglødet til dets komplementære sekvens for at danne den dobbeltstrengede konstruktion (dsTBA). TBA-oligonukleotid blev mærket i 3'-enden med en fluorofor (FAM) for at muliggøre visualisering på gelsystemet. Alikvoter (2 μM) af G4-TBA, ssTBA og dsTBA blev behandlet med B-CeP 1 ved enten en 5 eller 50 μM slutkoncentration i 10 mM Tris-HCl buffer og inkuberet ved 37 °C i den angivne tid. Resultatet af sondereaktionerne blev analyseret ved højopløsnings denaturering PAGE (20% PAA, 7 M urinstof, 1x TBE). "C" angiver kontrolprøven for hver TBA-konstruktion. Nukleofilicitet af Tris, der anvendes som buffer under sondereaktionerne, fører til lavere signaler og tab af strukturel information. Forkortelser: TBA = trombinbindende aptamer; B-CeP1 = bis-3-chloropiperidin 1; BPE = biphosphat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkeltstrenget; ds = dobbeltstrenget; FAM = 5-carboxyfluorescein; PAA = polyacrylamid; PAGE = polyacrylamidgelelektroforese; TBE = Tris-borat-EDTA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: CD-spektre af G4-TBA, ssTBA og dsTBA. Efter korrekt foldning af de tre forskellige strukturer blev CD-spektre optaget ved 25 °C. CD-spektret af dsTBA, karakteriseret ved positive lange bølgelængdebånd ved ~ 260-280 nm og et negativt bånd ved ~ 245 nm16, er i overensstemmelse med en B-form af DNA-helixen. I sammenligning med ssTBA, som viste sig at være dårligt struktureret i fravær af K + ioner, foldes G4-TBA i en anti-parallel G4 i nærvær af K + ioner, kendetegnet ved et negativt bånd ved 260 nm og et positivt bånd ved 290 nm15. Forkortelser: TBA = trombinbindende aptamer; B-CeP1 = bis-3-chloropiperidin 1; BPE = biphosphat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkeltstrenget; ds = dobbeltstrenget. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

G-quadruplexes er nukleinsyre sekundære strukturer, der typisk foldes inden for guaninrige DNA-sekvenser, og er betydelige forskningsmål på grund af deres tilknytning til genetisk kontrol og sygdomme. Kemisk kortlægning af B-CeP'er er en nyttig protokol til karakterisering af DNA G4'er, som kan bruges til at identificere guaninbaserne involveret i dannelsen af G-tetrader under fysiologiske saltforhold.

Den kemiske sonde, der anvendes i denne protokol, er B-CeP 1 (figur 2A), som ved specifikt at reagere med N7af guaninnukleobaser kan skelne mellem guaninerne involveret i dannelsen af G-quadruplex tetraderne og guaninerne, der ikke er impliceret i et sådant arrangement. Faktisk forringer Hoogsteen hydrogeninteraktioner mellem guaninerne i G-tetrader (figur 1) reaktionen med sonden. Produkter af sondereaktioner løses ved højopløsnings PAGE (figur 2B), en laboratorietilgængelig procedure, der er meget anvendt til at detektere alkyleringsaddukter og spaltningssteder inden for DNA-sekvenser. Desuden giver brugen af en DNA-sekvens mærket med en fluorofor brugerne mulighed for at udføre eksperimentet under sikre forhold, undgå radioaktivt mærkede nukleinsyrer og det konventionelle farvningstrin med interkalatorer.

B-CeP 1-sonden er meget stabil i fast form og i ikke-vandig stamopløsning, og der kan kun opstå få problemer under udførelsen af sondereaktionen. For at undgå ulemper i protokollen er det meget vigtigt at undgå tilstedeværelsen af uønskede nukleofiler i sondeopløsningerne for at undgå konkurrerende reaktioner, der kan mindske titeren af den aktive sonde, der er tilgængelig til dannelse af addukten med DNA'et. Da de mest almindeligt anvendte buffere indeholder Tris-base, minder vi læseren om, at dens nukleofile primære amin kan reagere med sondens elektrofile center, der konkurrerer om reaktiviteten af guaninerne i DNA-substratet10, som vist i figur 3 for B-CeP 1. Dette er begrundelsen for at udføre sondereaktionerne i fosfatbufferen, som beskrevet i protokollen. For at undgå reaktioner med vand7 anbefaler vi også, at alle fortyndinger af B-CeP 1 er frisklavede og øjeblikkeligt reageres med nukleinsyresubstratet.

Den kemiske kortlægning af B-CeP'er, der er beskrevet her, er et praktisk alternativ til dimethylsulfat (DMS) fodaftryksprotokollen, som repræsenterer mainstream-analysen til den indledende karakterisering af G4s16. De to protokoller giver stort set de samme oplysninger, nemlig dannelsen af G4-strukturen og identifikationen af de guaniner, der er involveret i G4, uanset G4-konformationen. Den kemiske kortlægning med B-CeP'er har imidlertid en vigtig fordel med hensyn til DMS-fodaftryk - protokollens enkelhed. Efter sondereaktionerne behøver protokollen beskrevet her ikke yderligere trin, mens DMS-fodaftryk kræver efterfølgende spaltning med varm piperidin efter reaktion med sonden, hvilket indebærer yderligere prøverensning og bufferbytning16. Reduktionen i antallet af trin i protokollen med B-CeP'er indebærer anvendelse af mindre mængder af det oprindelige DNA-substrat. Endelig vil den kemiske kortlægning af B-CeP'er, der er beskrevet heri med TBA-sekvensen som et proof-of-concept, føre til nye eksperimenter, der kan anvendes på enhver anden potentiel G-quadruplex-dannende sekvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Institut for Farmaceutiske og Farmakologiske Videnskaber, University of Padova (PRIDJ-BIRD2019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
  3. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
  4. Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
  5. Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
  6. Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
  7. Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
  8. Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
  9. Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
  10. Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
  11. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
  12. Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
  13. Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
  14. Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
  15. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  16. Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).

Tags

Biokemi nr. 195
<em>In vitro</em> Kemisk kortlægning af G-quadruplex DNA-strukturer af bis-3-chloropiperidiner <em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Dal Lago, C.,… More

Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter