Summary
Bis-3-chloorpiperidines (B-CeP's) zijn nuttige chemische sondes om G-quadruplex-structuren in DNA-sjablonen in vitro te identificeren en te karakteriseren. Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van tastende reacties met B-CeP's en het oplossen van reactieproducten door middel van polyacrylamidegelelektroforese met hoge resolutie.
Abstract
G-quadruplexen (G4's) zijn biologisch relevante, niet-canonieke DNA-structuren die een belangrijke rol spelen bij genexpressie en ziekten en belangrijke therapeutische doelen vertegenwoordigen. Toegankelijke methoden zijn vereist voor de in vitro karakterisering van DNA binnen potentiële G-quadruplexvormende sequenties (PQS's). B-CeP's zijn een klasse van alkylerende middelen die hebben bewezen nuttige chemische sondes te zijn voor onderzoek naar de hogere-orde structuur van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een nieuwe chemische mapping-test die gebruik maakt van de specifieke reactiviteit van B-CeP's met de N7van guanines, gevolgd door directe strengsplitsing bij de gealkyleerde G's.
Namelijk, om G4-vouwen te onderscheiden van ongevouwen DNA-vormen, gebruiken we B-CeP 1 om het trombinebindende aptameer (TBA) te onderzoeken, een 15-mer DNA dat in staat is om de G4-rangschikking aan te nemen. Reactie van B-CeP-reagerende guanines met B-CeP 1 levert producten op die kunnen worden opgelost door polyacrylamidegelelektroforese met hoge resolutie (PAGE) op het niveau van één nucleotide door individuele alkyleringsadducten en DNA-strengsplitsing bij de gealkyleerde guanines te lokaliseren. Het in kaart brengen met behulp van B-CeP's is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de in vitro karakterisering van G-quadruplex-vormende DNA-sequenties, waardoor de precieze locatie van guanines die betrokken zijn bij de vorming van G-tetrads mogelijk wordt.
Introduction
Naast de typische Watson-Crick dubbele helix, kunnen nucleïnezuren verschillende secundaire structuren aannemen, zoals de alternatieve G-quadruplex (G4) vorm, vanwege hun guaninerijke sequenties. De G4-structuur is gebaseerd op de vorming van vlakke tetrameren, G-tetrads genaamd, waarin vier guanines op elkaar inwerken via Hoogsteen-waterstofbruggen. G-tetrads worden gestapeld en verder gestabiliseerd door monovalente kationen die worden gecoördineerd in het midden van de guaninekern (Figuur 1)1.
Figuur 1: Schematische weergave van een G-quadruplex structuur. (A) Schematische weergave van een G-tetrad. De vlakke array wordt gestabiliseerd door Hoogsteen basenparen en door een centraal kation (M+). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Sequenties met vier of meer runs van ten minste twee opeenvolgende guaninenucleotiden zijn potentiële G-quadruplex-vormende sequenties (PQS's) die zich in G-quadruplexstructuren kunnen vouwen. PQS's bevinden zich in veel verschillende cellulaire contexten, zoals op telomeren, genpromotors, ribosomaal DNA en recombinatieplaatsen, en zijn betrokken bij de regulatie van veel biologische processen. Daarom is de identificatie en experimentele validatie van G4's in het menselijk genoom, die momenteel voornamelijk wordt uitgevoerd door middel van computationele hulpmiddelen, een biologisch relevante kwestie3. Om computationele voorspellingen te ondersteunen of onvoorspelbare G4-structuren te detecteren, wordt hier een toegankelijke methode getoond op basis van chemische mapping om de G4-formatie in een DNA-sjabloon te identificeren, waardoor de nauwkeurige identificatie van guanines die de G-tetrad-structuur vormen, mogelijk wordt.
De gerapporteerde chemische mapping-test maakt gebruik van de verschillende reactiviteit van bis-3-chloorpiperidines (B-CeP's) met guanines na de vorming van G4-structuren. Vanwege hun hoge reactiviteit met nucleofielen 4,5,6,7,8,9 zijn B-CeP's nucleïnezuuralkylerende middelen met het vermogen om zeer efficiënt te reageren met de N 7-positie van guaninenucleotiden10. Alkylering wordt gevolgd door depurinatie en strengsplitsing in enkel- en dubbelstrengs DNA-constructen. Integendeel, guanines die betrokken zijn bij de vorming van de G-tetrads in G4-opstellingen zijn ongevoelig voor B-CeP-alkylering, aangezien de N7-positie van guanines betrokken is bij de Hoogsteen-waterstofbruggen. Deze specifieke reactiviteit van B-CeP's maakt niet alleen de detectie van G4-structuren mogelijk, maar ook de identificatie van de guanines die de tetrad(s) vormen, zoals ze kunnen worden afgeleid uit hun relatieve bescherming tegen alkylering in vergelijking met guanines in enkel- en dubbelstrengs DNA.
Het chemische mapping-protocol wordt hier gerapporteerd met behulp van B-CeP 1 (Figuur 2A) als een sonde voor de karakterisering van trombine-bindend aptameer (TBA), een 15-mer DNA dat in staat is om de G4-rangschikking aan te nemen in aanwezigheid van kaliumkationen11,12. De G4-opstelling van TBA (G4-TBA) wordt rechtstreeks vergeleken met twee controles, namelijk TBA in de enkelstrengsvorm (ssTBA) en TBA gegloeid tot zijn complementaire sequentie om het dubbelstrengs construct (dsTBA) te vormen (tabel 1). Producten van sonderingsreacties worden opgelost door polyacrylamidegelelektroforese met hoge resolutie (PAGE) op het niveau van één nucleotide door individuele alkyleringsadducten en DNA-strengsplitsing bij de gealkyleerde guanines te lokaliseren. Visualisatie op de gel wordt mogelijk gemaakt door conjugatie van het TBA-oligonucleotide met een fluorofoor aan het 3'-uiteinde (tabel 1). Dit protocol laat zien hoe TBA in zijn verschillende conformaties (G4 en controles) moet worden gevouwen en hoe sonderreacties kunnen worden uitgevoerd met B-CeP's gevolgd door PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nucleïnezuur en chemische sondebereiding
- Nucleïnezuren
OPMERKING: Het oligonucleotide met de naam "TBA" is de 15-mer DNA-sequentie 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' die aan het 3'-uiteinde is gelabeld door de fluorofoor 5-carboxyfluoresceïne (FAM) om visualisatie op de gel mogelijk te maken. Het niet-gelabelde oligonucleotide "cTBA" is de DNA-complementaire sequentie 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA en cTBA worden gebruikt om de drie verschillende structuren te verkrijgen, zoals weergegeven in tabel 1.- Autoclaaftips en buisjes van 0,5 ml om steriele disposables te verkrijgen en besmetting te voorkomen.
- Bereid stockoplossingen voor waarbij elke oligonucleotide in ultrapuur water wordt opgelost tot een eindconcentratie van 100 μM. Bepaal de exacte oligonucleotideconcentratie met een ultravioletzichtbare (UV-Vis) spectrofotometer met behulp van de extinctiecoëfficiënt bij 260 nm die door de fabrikant wordt verstrekt.
OPMERKING: Extinctiecoëfficiënten: 164.300 M-1 cm-1 en 138.600 M-1 cm-1 werden gebruikt voor respectievelijk TBA en cTBA. - Bewaar TBA- en cTBA-voorraadoplossingen bij -20 °C (maandenlang onder deze omstandigheden).
- Samenstelling B-CeP 1
OPMERKING: De verbinding B-CeP 1 wordt gesynthetiseerd zoals eerder gerapporteerd6.- Bereid de B-CeP 1 stockoplossing op ~10 mM. Weeg ~1 mg van de gevriesdroogde verbinding af met behulp van een analytische balans in een zuurkast en los deze op in 100% dimethylsulfoxide (DMSO).
- Bereken de exacte concentratie van de verbinding op basis van de werkelijk gebruikte hoeveelheid verbinding en DMSO (d = 1,1 g/cm3).
NOTITIE: Hanteer de verbinding te allen tijde met handschoenen (zowel wanneer gevriesdroogd als wanneer opgelost in DMSO)13,14.
Tabel 1: Oligonucleotidestructuren die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
2. Vouwen van nucleïnezuurconstructen
- Voorbereiding van buffers
- Bereid een BPE-bufferoplossing (bifosfaat-ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na 2 HPO 4,1 mM Na2EDTA, pH7,4) en een oplossing van 500 mM KCl in ultrapuur water. Filtreer de oplossingen door filters met een poriegrootte van 0,22 μm.
NOTITIE: Gebruik voor het beste resultaat vers bereide oplossingen. BPE-buffer kan maximaal 15 dagen bij 4 °C worden bewaard.
- Bereid een BPE-bufferoplossing (bifosfaat-ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na 2 HPO 4,1 mM Na2EDTA, pH7,4) en een oplossing van 500 mM KCl in ultrapuur water. Filtreer de oplossingen door filters met een poriegrootte van 0,22 μm.
- Vouwen van G4-TBA-, ssTBA- en dsTBA-monsters door middel van de warmte-hervouwprocedure
OPMERKING: Kaliumkationen zijn nodig om de G4-structuur te vouwen (G4-TBA). Voeg geen kaliumkationen toe aan de vouwoplossing van de controles ssTBA en dsTBA.- Bereid 40 μL van een 4 μM-oplossing van G4-TBA in 1x BPE en 100 mM KCl. Denatureer de oligonucleotide G4-TBA-oplossing door de buis gedurende 5 minuten te verwarmen tot 95 °C en langzaam af te koelen tot kamertemperatuur (RT) zodat de TBA zich kan vouwen tot G-quadruplexen.
- Bereid 40 μL van een 4 μM oplossing van ssTBA in 1x BPE. Voer de in stap 2.2.1 beschreven procedure voor het opnieuw vouwen van de warmte uit om TBA in zijn enkelstrengsvorm te vouwen.
- Bereid 40 μL van een 4 μM oplossing van dsTBA door equimolaire hoeveelheden TBA en cTBA te mengen in 1x BPE. Voer de hierboven beschreven procedure voor het opnieuw vouwen van de warmte uit (stap 2.2.1) om TBA te laten gloeien tot de complementaire sequentie cTBA en de dubbelstrengs vorm van TBA te vormen.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume van elke vouwoplossing is gebaseerd op het aantal monsters voor de tasterreacties, waarbij wordt aangenomen dat voor elk monster 5 μL 4 μM-oplossing nodig is. Bereid een beetje overtollig volume van elke oplossing om pipetteerfouten te voorkomen.
3. Indringende reacties
NOTITIE: Tasterreacties moeten onmiddellijk na de warmte-hervouwprocedure worden uitgevoerd.
- Wanneer de vouwoplossingen van G4-TBA, ssTBA en dsTBA zijn afgekoeld tot RT, voert u een centrifugatie met korte centrifugatie uit (7.000 × g gedurende 5-8 s bij RT) en start u de sonderingsreacties.
- Bereid 21 lege 0,5 ml geautoclaveerde buisjes voor. Organiseer ze in drie sets van elk zeven buisjes in het rek voor laboratoriummonsters, zoals gerapporteerd in tabel 2.
OPMERKING: Elke kolommenset komt overeen met de drie verschillende TBA-vouwcondities G4-TBA, ssTBA en dsTBA. Elke rij komt overeen met drie verschillende incubatietijden. Elke cel in de kolom komt overeen met de uiteindelijke B-CeP 1-sondeconcentratie (tabel 2). Zorg ervoor dat u de buizen duidelijk labelt. - Voeg 3 μL ultrapuur water toe aan elke buis.
- Voeg 5 μL gevouwen G4-TBA toe aan elk buisje van de eerste set (stap 3.2). Voeg 5 μL gevouwen ssTBA toe aan elk buisje van de tweede set. Voeg 5 μL gevouwen dsTBA toe aan elk buisje van de derde set.
- Verdun de B-CeP 1 stockoplossing tot 250 μM en 25 μM in ultrapuur water.
OPMERKING: Verdunningen van de B-CeP 1 chemische sonde moeten vers worden bereid en onmiddellijk reageren met het DNA-substraat om concurrerende reacties met water te voorkomen. - Voeg 2 μL van de juiste B-CeP 1-verdunning (25 μM en 250 μM) toe aan de monsters. Vervang de verbinding door ultrapuur water in de drie controlemonsters (C) voor analyse van de verschillend gevouwen TBA's in afwezigheid van de verbinding. Incubeer alle monsters bij 37 °C.
- Stop na 1 uur, 4 uur en 15 uur incubatie de reactie door de buizen bij -20 °C te plaatsen tot de volgende stap.
OPMERKING: De monsters kunnen onder deze omstandigheden een paar dagen worden bewaard. - Droog de monsters in een vacuümcentrifuge.
OPMERKING: De gedroogde monsters kunnen wekenlang bij -20 °C worden bewaard voordat ze doorgaan met de PAGE-analyse.
Tabel 2: Monsters voor de tasterreacties (structuren, sondeconcentraties en incubatietijd). Elke kolommenset komt overeen met de drie verschillende TBA-vouwcondities (G4-TBA, ssTBA en dsTBA). Elke rij komt overeen met drie verschillende incubatietijden (1, 4, 15 uur). Elke cel in de kolom komt overeen met de uiteindelijke B-CeP 1-sondeconcentratie (5 of 50 μM). De controlegroep (C) voor elke set komt overeen met een monster van de verschillend gevouwen TBA's die gedurende de langere tijd (15 uur) zijn geïncubeerd zonder verbinding. Klik hier om deze tabel te downloaden.
4. PAGINA met hoge resolutie
- Bereiding van de denaturerende polyacrylamideoplossing
OPMERKING: Bereid van tevoren 500 ml 20% denaturerende polyacrylamidegeloplossing. Voor elk experiment zal ongeveer 80 ml van deze oplossing worden gebruikt. Gebruik een amberkleurige glazen fles of bedek een glazen fles met aluminiumfolie om de oplossing bij RT te bewaren.
LET OP: Polyacrylamide is neurotoxisch. Draag tijdens alle stappen van de gelbereiding en het gieten handschoenen en een laboratoriumjas. Gooi gepolymeriseerd acrylamide weg in een geschikte doos voor verontreinigde materialen.- Weeg 210 g ureum af in een bekerglas van 1 liter. Voeg 250 ml 40% acrylamide/bisacrylamide-oplossing (19/1) en 50 ml 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM boraat, 20 mM EDTA, pH 8) toe.
- Plaats het bekerglas op een roerplaat en meng de oplossing met een roerstaaf. Dek het bekerglas tijdens het mengen af met aluminiumfolie om spatten en verontreiniging te voorkomen.
- Meng de oplossing totdat het ureum volledig is opgelost en de oplossing helder is.
OPMERKING: Deze stap kan vele uren duren. Om het oplossen van ureum te bevorderen, voegt u een kleine hoeveelheid water toe zonder het gewenste eindvolume te overschrijden. - Verwijder de roerstaaf. Giet de oplossing in een cilinder en voeg water toe tot een exact eindvolume van 500 ml.
- Opzetten van gelapparatuur
- Reinig twee platen (een met inkepingen en een zonder inkepingen) met 70% ethanol, laat ze drogen en behandel de platen vervolgens met een dimethyldichloorsilaanoplossing.
OPMERKING: Silanisatie kan worden overgeslagen, hoewel het helpt bij het vrijkomen van de gel uit een van de platen wanneer de gelsandwich uit elkaar wordt gehaald.
LET OP: Hanteer de silanisatieoplossing met handschoenen en voer de plaatbehandeling met deze oplossing uit in een zuurkast. - Plaats de afstandhouders van 0.4 mm langs de lange zijden van de langere plaat, plaats de korte plaat op de andere en lijn de twee platen aan de onderkant uit.
- Plak meerdere lagen papieren tape langs alle randen behalve de bovenkant.
- Om lekken tijdens het gieten te voorkomen, voegt u een extra laag tape toe aan de onderkant van de gel.
- Knip de zijkanten van de glazen sandwich vast met schone klemmen volgens de instructies van de leverancier (verschillende leveranciers gebruiken iets andere apparaten, sandwichklemmen en pakkingen).
- Reinig twee platen (een met inkepingen en een zonder inkepingen) met 70% ethanol, laat ze drogen en behandel de platen vervolgens met een dimethyldichloorsilaanoplossing.
- Het gieten van de gel
OPMERKING: Giet de gel bij RT (25 °C), aangezien polyacrylamidepolymerisatie temperatuurgevoelig is.- Giet in een bekerglas 80 ml van de eerder bereide denatureringspolyacrylamideoplossing (stap 4.1), 450 μl 10% ammoniumpersulfaatoplossing (APS) en 45 μl tetramethylethyleendiamine (TEMED) vlak voor gebruik.
- Meng de oplossing en giet deze snel tussen de glasplaten met een spuit van 50 ml. Breng de kam met het gewenste aantal putjes tussen de glasplaten en vermijd luchtbellen. Voeg indien nodig geloplossing toe om de sandwich volledig te vullen. Plaats vier klemmen op de kam om naar beneden te drukken en een gelijkmatige verdeling van de putjes mogelijk te maken.
- Laat de gel minimaal 45 minuten polymeriseren.
- De gel laten lopen
- Verwijder na de polymerisatie alle klemmen en papiertapelagen. Verwijder de kam langzaam en spoel de putjes grondig af met gedestilleerd water.
- Volg de instructies van de specifieke leverancier om de gelsandwich correct in het verticale gelelektroforese-apparaat te plaatsen.
- Bereid de TBE-lopende buffer (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM boraat, 2 mM EDTA, pH 8) voor in gedeïoniseerd water en vul zowel het bovenste als het onderste reservoir met de buffer.
- Verwarm de platen door de gelelektroforese gedurende ten minste 30 minuten bij 50 W voor te laten lopen.
- Bereid de laadbuffer van de denaturerende gel (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% formamide, 50% glycerol, 0,05% broomfenolblauw) in ultrapuur water.
OPMERKING: GLB helpt bij het volgen van de beweging van de oligonucleotidemonsters in het gelsysteem en maakt het mogelijk om de monsters in de putjes van de gel te laden. Door de aanwezigheid van het denatureringsmiddel formamide kunnen DNA-soorten scheiden op basis van grootte, zelfs in een niet-denaturerende PAGE. - Resuspendeer de gedroogde monsters (monsters uit stap 3.8) in 5 μl DGLB.
- Voordat u de monsters plaatst, reinigt u de putjes met een kleine spuit en de TBE-buffer in de bovenste bufferkamer om het ureum uit de putjes te verwijderen.
NOTITIE: Herhaal deze stap meerdere keren om de putten nauwkeurig schoon te maken en zo moeilijk te interpreteren banden te vermijden. - Laad de monsters in de schone putten en noteer de volgorde van laden.
- Laat de gelelektroforese gedurende 2 uur op 50 W lopen, of in ieder geval totdat de broomfenolblauwe kleurstof 2/3 van de gel heeft laten lopen.
- Beeldvorming van de gel
- Schakel na elektroforese de stroomtoevoer uit, verwijder de glazen sandwich en maak de glazen schoon.
- Detecteer de fluorescentie van de FAM-gelabelde oligonucleotidebanden door te scannen met behulp van een gelimager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont een representatief resultaat van een chemische mappingtest die is uitgevoerd, zoals beschreven in het protocol met B-CeP 1 op het TBA-oligonucleotide gevouwen in drie verschillende structuren. De G-quadruplex-rangschikking van TBA (G4-TBA) werd verkregen door het oligonucleotide te vouwen in BPE en in aanwezigheid van het K+-kation, terwijl de enkelstrengs vorm van dezelfde TBA-sequentie (ssTBA) werd gevouwen in afwezigheid van kalium. Het dubbelstrengs construct (dsTBA) werd bereid door TBA te gloeien tot zijn complementaire sequentie in BPE-buffer. Een eindconcentratie van 5 of 50 μM van B-CeP 1 werd gereageerd met 2 μM-monsters van G4-TBA (linkerrijstroken van figuur 2B), ssTBA (centrale rijstroken van figuur 2B) en dsTBA (rechterrijstroken van figuur 2B) gedurende 1 uur, 4 uur en 15 uur. Aanvullende controles zijn de DNA-constructen die niet met de sonde reageerden. Analyse van circulair dichroïsme (CD) van de drie verschillende TBA-vouwen bevestigde hun juiste structuur (aanvullende figuur S1). Het CD-spectrum van dsTBA werd in feite gekenmerkt door een positieve lange golflengteband bij ~260-280 nm en een negatieve band bij ~245 nm15, consistent met een DNA-helix in zijn B-vorm. De ssTBA bleek slecht gestructureerd te zijn in afwezigheid van K+-ionen, terwijl G4-TBA vouwt in een anti-parallelle G4 in aanwezigheid van K+-ionen, gekenmerkt door een negatieve band bij 260 nm en een positieve band bij 290 nm15.
De PAGE-resultaten met hoge resolutie die in figuur 2B worden gerapporteerd, geven een uitgebreid beeld van de tijd- en concentratieafhankelijke reacties van B-CeP 1 op G4-TBA, ssTBA en dsTBA, en onthullen duidelijk een duidelijk ander alkyleringspatroon voor de G4-TBA in vergelijking met wat werd waargenomen voor de ssTBA- en dsTBA-constructen. Banden die migreren met een lagere mobiliteit dan de onbehandelde monsters (C) komen overeen met DNA-substraatalkylering. In het geval van het G4-TBA-substraat wordt duidelijk slechts één alkyleringsadduct waargenomen, volgens de aanwezigheid van slechts één guanine (G8) die beschikbaar is voor alkylering (nummering van guanines in figuur 2C). Integendeel, er worden meerdere adducten onderscheiden wanneer het substraat ssTBA of dsTBA is, waarbij alle guanines die de N7-positie bezitten vrij zijn om te worden gesondeerd. Sneller migrerende banden worden in plaats daarvan toegeschreven aan de producten van strengsplitsing. In het geval van het G4-TBA-substraat zijn de guanines (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15) die betrokken zijn bij G-quadruplextetrads ongevoelig voor alkylering, terwijl G8 wordt aangetast door splitsing als volgende stap van alkylering. In de ssTBA- en dsTBA-constructies zijn alle guanines gevoelig voor splitsing, zoals blijkt uit de talrijke gedetecteerde banden, die steeds intenser worden naarmate de incubatietijd langer wordt.
Dit protocol maakt het mogelijk onderscheid te maken tussen de guanines die betrokken zijn bij de vorming van de G-quadruplextetrads en de guanines die niet betrokken zijn bij een dergelijke opstelling, waardoor de G4-TBA-structuur wordt opgehelderd (Figuur 2C).
Een mogelijk nadeel van het experiment is de aanwezigheid van ongewenste nucleofielen in de reactieomgeving. Nucleofielen die afkomstig zijn van zouten in de reactiebuffer concurreren bijvoorbeeld met DNA voor de reactiviteit met B-CeP's, wat leidt tot een inefficiënte reactie van de sonde met het substraat. Figuur 3 toont de resultaten van de sonderingsreacties die zijn uitgevoerd in Tris-buffer, die de nucleofiele Tris-base bevatten. B-CeP 1 (5 en 50 μM) reageert met 2 μM-monsters van G4-TBA (linkerrijstroken van figuur 3), ssTBA (centrale rijstroken van figuur 3) en dsTBA (rechterrijstroken van figuur 3) gedurende 1 uur, 4 uur, 15 uur en 24 uur. In deze omstandigheden is de reactiviteit van de sonde ten opzichte van alle drie de DNA-substraten duidelijk verminderd. Voor de G4-TBA-monsters kunnen we alleen de vorming van adducten waarnemen zonder de splitsing van de streng te detecteren. In het geval van ssTBA en dsTBA is de DNA-fragmentatie pas na 24 uur vergelijkbaar met de fragmentatie die na 15 uur incubatie wordt waargenomen in figuur 2B. De ongewenste concurrerende reactiviteit van B-CeP's met Tris leidt tot een gebrek aan structurele informatie over nucleïnezuren.
Figuur 2: Chemische kartering van een TBA G-quadruplex structuur door B-CeP 1 in BPE buffer. (A) Chemische structuur van B-CeP 1. (B) Tijds- en concentratieafhankelijkheid van de indringende reacties tussen B-CeP 1 en TBA in de BPE-buffer. Aliquots van TBA werden in drie verschillende omstandigheden gevouwen om de G-quadruplex-opstelling (G4-TBA), de enkelstrengs oligonucleotide (ssTBA) en TBA gegloeid tot zijn complementaire sequentie te verkrijgen om het dubbelstrengs construct (dsTBA) te vormen. Het TBA-oligonucleotide werd aan het 3'-uiteinde gelabeld met een fluorofoor (FAM) om visualisatie op het gelsysteem mogelijk te maken. Aliquots (2 μM) van G4-TBA, ssTBA en dsTBA werden behandeld met B-CeP 1 in een eindconcentratie van 5 of 50 μM in de BPE-buffer en geïncubeerd bij 37 °C gedurende de aangegeven tijd. De uitkomst van de tasterreacties werd geanalyseerd door middel van denaturering met hoge resolutie PAGE (20% polyacrylamide [PAA], 7 M ureum, 1x TBE). "C" geeft het controlemonster van elk TBA-construct aan. (C) Cartoon van de G-quadruplex-opstelling van G4-TBA en nummering van guanines in de TBA-reeks. De enige guanine die niet betrokken was bij de G4-structuur en dus reageerde met B-CeP 1, is rood gemarkeerd. De groene ster staat voor de fluorofoor FAM. Afkortingen: TBA = trombine-bindende aptameer; B-CeP 1 = bis-3-chloorpiperidine 1; BPE = bifosfaat-EDTA; G = guanine; G4 = guanine quadruplex; ss = enkelstrengs; ds = dubbelstrengs; FAM = 5-carboxyfluoresceïne; PAA = polyacrylamide; PAGE = polyacrylamidegelelektroforese; TBE = Tris-boraat-EDTA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Inefficiënte chemische kartering in aanwezigheid van Tris-buffer. Tijd- en concentratieafhankelijkheid van de indringende reacties tussen B-CeP 1 en TBA in Tris-buffer. Aliquots van TBA werden in drie verschillende omstandigheden gevouwen om de G-quadruplex-opstelling (G4-TBA), de enkelstrengs oligonucleotide (ssTBA) en TBA gegloeid tot zijn complementaire sequentie te verkrijgen om het dubbelstrengs construct (dsTBA) te vormen. TBA-oligonucleotide werd aan het 3'-uiteinde gelabeld met een fluorofoor (FAM) om visualisatie op het gelsysteem mogelijk te maken. Aliquots (2 μM) van G4-TBA, ssTBA en dsTBA werden behandeld met B-CeP 1 in een eindconcentratie van 5 of 50 μM in een Tris-HCl-buffer van 10 mM en geïncubeerd bij 37 °C gedurende de aangegeven tijd. De uitkomst van de indringende reacties werd geanalyseerd door middel van denatureringsmiddel met hoge resolutie PAGE (20% PAA, 7 M ureum, 1x TBE). "C" geeft het controlemonster van elk TBA-construct aan. De nucleofiele werking van Tris die als buffer wordt gebruikt tijdens de sonderingsreacties leidt tot lagere signalen en een verlies van structurele informatie. Afkortingen: TBA = trombine-bindend aptameer; B-CeP 1 = bis-3-chloorpiperidine 1; BPE = bifosfaat-EDTA; G = guanine; G4 = guanine quadruplex; ss = enkelstrengs; ds = dubbelstrengs; FAM = 5-carboxyfluoresceïne; PAA = polyacrylamide; PAGE = polyacrylamidegelelektroforese; TBE = Tris-boraat-EDTA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: CD-spectra van G4-TBA, ssTBA en dsTBA. Na het correct vouwen van de drie verschillende structuren werden CD-spectra geregistreerd bij 25 °C. Het CD-spectrum van dsTBA, gekenmerkt door positieve lange golflengtebanden bij ~260-280 nm en een negatieve band bij ~245 nm16, komt overeen met een B-vorm van de DNA-helix. In vergelijking met de ssTBA, die slecht gestructureerd bleek te zijn in afwezigheid van K+-ionen, vouwt G4-TBA in een anti-parallelle G4 in aanwezigheid van K+-ionen, gekenmerkt door een negatieve band bij 260 nm en een positieve band bij 290 nm15. Afkortingen: TBA = trombine-bindend aptameer; B-CeP 1 = bis-3-chloorpiperidine 1; BPE = bifosfaat-EDTA; G = guanine; G4 = guanine quadruplex; ss = enkelstrengs; ds = dubbelstrengs. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G-quadruplexen zijn nucleïnezuur secundaire structuren die zich doorgaans vouwen binnen guaninerijke DNA-sequenties en zijn belangrijke onderzoeksdoelen vanwege hun associatie met genetische controle en ziekten. Chemische kartering door B-CeP's is een nuttig protocol voor de karakterisering van DNA G4's, dat kan worden gebruikt om de guaninebasen te identificeren die betrokken zijn bij de vorming van G-tetrads onder fysiologische zoutomstandigheden.
De chemische sonde die in dit protocol wordt gebruikt, is B-CeP 1 (figuur 2A), die, door specifiek te reageren met de N7 van guaninenucleobasen, onderscheid kan maken tussen de guanines die betrokken zijn bij de vorming van de G-quadruplextetrads en de guanines die niet betrokken zijn bij een dergelijke opstelling. In feite beïnvloeden Hoogsteen-waterstofinteracties tussen de guanines in G-tetrads (Figuur 1) de reactie met de sonde. Producten van indringende reacties worden opgelost door PAGE met hoge resolutie (Figuur 2B), een in het laboratorium toegankelijke procedure die veel wordt gebruikt om alkyleringsadducten en splitsingsplaatsen binnen DNA-sequenties te detecteren. Bovendien stelt het gebruik van een DNA-sequentie gelabeld met een fluorofoor gebruikers in staat om het experiment in veilige omstandigheden uit te voeren, waarbij radioactief gelabelde nucleïnezuren en de conventionele kleuringsstap met intercalatoren worden vermeden.
De B-CeP 1-sonde is zeer stabiel in vaste vorm en in niet-waterige voorraadoplossing, en er kunnen slechts enkele problemen optreden tijdens het uitvoeren van de sonderingsreactie. Om nadelen in het protocol te voorkomen, is het erg belangrijk om de aanwezigheid van ongewenste nucleofielen in de sondeeroplossingen te vermijden om concurrerende reacties te voorkomen die de titer van de actieve sonde die beschikbaar is om het adduct met het DNA te vormen, zouden kunnen verminderen. Aangezien de meest gebruikte buffers Tris-base bevatten, herinneren we de lezer eraan dat het nucleofiele primaire amine kan reageren met het elektrofiele centrum van de sonde dat concurreert met de reactiviteit van de guanines van het DNA-substraat10, zoals weergegeven in figuur 3 voor B-CeP 1. Dit is de reden voor het uitvoeren van de sonderingsreacties in fosfaatbuffer, zoals beschreven in het protocol. Om reacties met water7 te voorkomen, raden we ook aan om alle verdunningen van B-CeP 1 vers te bereiden en onmiddellijk te reageren met het nucleïnezuursubstraat.
De chemische kartering door B-CeP's die hier wordt beschreven, is een handig alternatief voor het dimethylsulfaat (DMS) footprinting-protocol, dat de reguliere test vertegenwoordigt voor de initiële karakterisering van G4s16. De twee protocollen geven in wezen dezelfde informatie, namelijk de vorming van de G4-structuur en de identificatie van de guanines die betrokken zijn bij de G4, ongeacht de G4-conformatie. Het in kaart brengen van chemicaliën met B-CePs heeft echter een belangrijk voordeel met betrekking tot DMS-footprinting: de eenvoud van het protocol. Na de tasterreacties heeft het hier beschreven protocol geen extra stappen nodig, terwijl DMS-footprinting na reactie met de sonde vervolgens moet worden gesplitst door hete piperidine, wat extra monsterzuivering en bufferuitwisseling impliceert16. De vermindering van het aantal stappen in het protocol met B-CeP's impliceert het gebruik van kleinere hoeveelheden van het oorspronkelijke DNA-substraat. Ten slotte zal het chemisch in kaart brengen door B-CeP's, hierin beschreven met de TBA-sequentie als een proof-of-concept, leiden tot nieuwe experimenten die van toepassing zijn op elke andere potentiële G-quadruplex-vormende sequentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Departement Farmaceutische en Farmacologische Wetenschappen, Universiteit van Padova (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
