Summary
Bis-3-chloropiperidines(B-CeP)는 in vitro에서 DNA 템플릿의 G-quadruplex 구조를 식별하고 특성화하는 데 유용한 화학 프로브입니다. 이 프로토콜은 B-CeP를 사용하여 프로빙 반응을 수행하고 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 반응 생성물을 분해하는 절차를 자세히 설명합니다.
Abstract
G-quadruplex(G4s)는 유전자 발현 및 질병에 중요한 역할을 하는 생물학적으로 관련된 비표준 DNA 구조로, 중요한 치료 표적을 나타냅니다. 잠재적인 G-quadruplex-forming sequences(PQS) 내에서 DNA의 in vitro 특성 분석을 위해서는 접근 가능한 방법이 필요합니다. B-CeP는 핵산의 고차원 구조 조사에 유용한 화학 프로브로 입증된 알킬화제의 한 종류입니다. 이 논문은 B-CeP와 구아닌의 N7의 특정 반응성을 활용한 후 알킬화된 Gs에서 직접 가닥 절단을 수행하는 새로운 화학 매핑 분석에 대해 설명합니다.
즉, G4 접힘과 풀린 DNA 형태를 구별하기 위해 B-CeP 1을 사용하여 G4 배열을 가정할 수 있는 15-mer DNA인 트롬빈 결합 압타머(TBA)를 조사합니다. B-CeP 반응 구아닌과 B-CeP 1의 반응은 알킬화된 구아닌에서 개별 알킬화 부가물 및 DNA 가닥 절단을 찾아 단일 뉴클레오티드 수준에서 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분해할 수 있는 산물을 생성합니다. B-CeP를 사용한 맵핑은 G-quadruplex 형성 DNA 염기서열의 in vitro 특성 분석을 위한 간단하고 강력한 도구로, G-tetrads 형성에 관여하는 구아닌의 정확한 위치를 파악할 수 있습니다.
Introduction
전형적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 이중나선 외에도, 핵산은 구아닌이 풍부한 서열로 인해 양자택일 G-4중(G4) 형태와 같은 다양한 2차 구조를 채택할 수 있습니다. G4 구조는 4개의 구아닌이 Hoogsteen 수소 결합을 통해 상호 작용하는 G-tetrads라고 하는 평면 사량체의 형성을 기반으로 합니다. G-tetrad는 구아닌 코어의 중심에서 조정되는 1가 양이온에 의해 적층되고 더욱 안정화됩니다(그림 1)1.
그림 1: G-quadruplex 구조 의 개략도. (A) G-tetrad의 개략적 표현. 평면 어레이는 Hoogsteen 염기쌍과 중심 양이온(M+)에 의해 안정화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
적어도 2개의 연속적인 구아닌 뉴클레오티드가 4회 이상 실행된 서열은 G-4중복합 구조에서 접힐 수 있는 잠재적인 G-사중-형성 서열(PQS)이다. PQS는 텔로미어, 유전자 프로모터, 리보솜 DNA, 재조합 부위 등 다양한 세포 환경에 위치하며, 많은 생물학적 과정의 조절에 관여한다2. 따라서 현재 주로 계산 도구를 통해 수행되는 인간 게놈에서 G4의 식별 및 실험적 검증은 생물학적으로 관련된 문제입니다3. 전산 예측을 지원하거나 예측하지 못한 G4 구조를 검출하기 위해 DNA 템플릿에서 G4 형성을 식별하기 위한 화학적 매핑을 기반으로 하는 접근 가능한 방법이 여기에 표시되어 G-tetrad 구조를 형성하는 구아닌을 정확하게 식별할 수 있습니다.
보고된 화학 매핑 분석은 G4 구조 형성 후 구아닌과 비스-3-클로로피페리딘(B-CeP)의 다양한 반응성을 이용합니다. 친핵체 4,5,6,7,8,9와의 높은 반응성으로 인해 B-CeP 는 구아닌 뉴클레오티드 10의 N 7 위치와 매우 효율적으로 반응할 수 있는 핵산 알킬화제입니다. 알킬화 다음에는 단일 및 이중 가닥 DNA 구조에서 탈피 및 가닥 절단이 뒤따릅니다. 반대로, G4 배열에서 G-테트라드의 형성에 관여하는 구아닌은 구아닌의 N7 위치가 Hoogsteen 수소 결합에 연루되어 있기 때문에 B-CeP 알킬화에 영향을 받지 않습니다. B-CeP의 이러한 특이적 반응성은 G4 구조의 검출뿐만 아니라 단일 및 이중 가닥 DNA의 구아닌과 비교하여 알킬화로부터 상대적인 보호로부터 추론할 수 있기 때문에 테트라드를 형성하는 구아닌의 식별도 가능하게 합니다.
화학적 매핑 프로토콜은 칼륨 양이온(11,12)의 존재 하에서 G4 배열을 가정할 수 있는 15-mer DNA인 트롬빈 결합 압타머(TBA)의 특성화를 위한 프로브로서 B-CeP 1(그림 2A)을 사용하여 여기에 보고됩니다. TBA(G4-TBA)의 G4 배열은 두 개의 대조군, 즉 단일 가닥 형태의 TBA(ssTBA)와 이중 가닥 구조(dsTBA)를 형성하기 위해 상보적인 서열로 어닐링된 TBA와 직접 비교됩니다(표 1). 프로빙 반응 산물은 알킬화된 구아닌에서 개별 알킬화 부가물과 DNA 가닥 절단을 찾아 단일 뉴클레오티드 수준에서 고분해능 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분해됩니다. 겔의 시각화는 TBA 올리고뉴클레오티드와 3'-말단의 형광단을 결합함으로써 가능합니다(표 1). 이 프로토콜은 TBA를 다양한 형태(G4 및 대조군)로 접는 방법과 B-CeP를 사용한 후 PAGE를 사용하여 프로빙 반응을 수행하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 핵산 및 화학 탐침 준비
- 핵산
참고: "TBA"라는 올리고뉴클레오티드는 형광단 5-카르복시플루오레세인(FAM)에 의해 3'-말단에 표지된 15-mer DNA 서열 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'으로 겔에 시각화를 가능하게 합니다. 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드 "cTBA"는 DNA 상보적 서열 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'입니다. 표 1에 나타낸 바와 같이 3개의 상이한 구조를 얻기 위해 TBA 및 cTBA가 채용된다.- 오토클레이브 팁과 0.5mL 튜브를 사용하여 멸균 일회용품을 얻고 오염을 방지할 수 있습니다.
- 각 올리고뉴클레오티드를 초순수에 최종 농도 100μM까지 용해시키는 원액을 준비합니다. 제조업체에서 제공한 260nm의 흡광 계수를 사용하여 자외선 가시광선(UV-Vis) 분광 광도계로 정확한 올리고뉴클레오티드 농도를 결정합니다.
참고: 흡광 계수: TBA 및 cTBA에는 각각 164,300 M-1 cm-1 및 138,600 M-1 cm-1이 사용되었습니다. - TBA 및 cTBA 원액을 -20°C에서 보관하십시오(이러한 조건에서 몇 달 동안).
- 화합물 B-CeP 1
참고: 화합물 B-CeP 1은 이전에 보고된바와 같이 합성된다 6.- ~10mM에서 B-CeP 1 원액을 준비합니다. 흄 후드에 있는 분석 저울을 사용하여 동결건조된 화합물 ~1mg을 칭량하고 100% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킵니다.
- 사용된 화합물 및 DMSO(d = 1.1g/cm3)의 실제 양을 기준으로 정확한 화합물 농도를 계산합니다.
알림: 항상 장갑을 끼고 화합물을 다루십시오(동결건조된 경우와 DMSO에 용해된 경우 모두)13,14.
표 1: 이 프로토콜에 사용된 올리고뉴클레오티드 구조. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
2. 핵산 구조체의 접힘
- 완충액의 준비
- BPE 완충 용액 (biphosphate-ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 5x : 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7.4) 및 500 mM KCl 용액을 초순수에 준비합니다. 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 용액을 여과합니다.
알림: 최상의 결과를 얻으려면 새로 준비된 용액을 사용하십시오. BPE 완충액은 4°C에서 최대 15일 동안 보관할 수 있습니다.
- BPE 완충 용액 (biphosphate-ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 5x : 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7.4) 및 500 mM KCl 용액을 초순수에 준비합니다. 0.22μm 공극 크기 필터를 통해 용액을 여과합니다.
- G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA 샘플의 접기 열 재접기 절차에 의한
참고: 칼륨 양이온은 G4 구조(G4-TBA)를 접는 데 필요합니다. 대조군 ssTBA 및 dsTBA의 접는 용액에 칼륨 양이온을 추가하지 마십시오.- 1x BPE 및 100mM KCl에서 G4-TBA의 4μM 용액 40μL를 준비합니다. 튜브를 95°C로 5분 동안 가열하여 올리고뉴클레오티드 G4-TBA 용액을 변성시키고 TBA가 G-4중으로 접힐 수 있도록 실온(RT)으로 천천히 냉각합니다.
- 40μL의 ssTBA 용액 1μL를 1x BPE로 준비합니다. 2.2.1단계에서 언급한 대로 열 재접기 절차를 수행하여 TBA를 단일 가닥 형태로 접습니다.
- 40x BPE에서 등몰량의 TBA와 cTBA를 혼합하여 dsTBA의 4μM 용액 1μL를 준비합니다. TBA에 대해 위에서 언급한 열 재접힘 절차(2.2.1단계)를 수행하여 보완 서열 cTBA에 어닐링하고 이중 가닥 형태의 TBA를 형성합니다.
참고: 각 접힘 용액의 최종 부피는 각 시료에 대해 5μL의 4μM 용액이 필요하다는 점을 고려하여 프로빙 반응을 위한 시료 수를 기준으로 합니다. 피펫팅 오류를 방지하기 위해 각 용액을 약간 초과하여 준비합니다.
3. 프로빙 반응
알림: 프로빙 반응은 열 재접기 절차 직후에 수행해야 합니다.
- G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA의 폴딩 용액이 RT로 냉각되면 짧은 스핀 원심분리(RT에서 5-8초 동안 7,000× g )를 수행하고 프로빙 반응을 시작합니다.
- 빈 0.5mL 고압멸균 튜브 21개를 준비합니다. 표 2에 보고된 대로 실험실 샘플용 랙에 각각 7개의 튜브로 구성된 3세트로 구성합니다.
참고: 각 열 집합은 세 가지 TBA 접기 조건 G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA에 해당합니다. 각 행은 세 가지 다른 배양 시간에 해당합니다. 컬럼 내의 각 셀은 최종 B-CeP 1 프로브 농도에 해당합니다(표 2). 튜브에 명확하게 라벨을 부착하십시오. - 각 튜브에 3μL의 초순수를 추가합니다.
- 첫 번째 세트의 각 튜브에 접힌 G5-TBA 4μL를 추가합니다(3.2단계). 두 번째 세트의 각 튜브에 접힌 ssTBA 5μL를 추가합니다. 세 번째 세트의 각 튜브에 접힌 dsTBA 5μL를 추가합니다.
- B-CeP 1 원액을 초순수에 250μM 및 25μM로 희석합니다.
참고: B-CeP 1 화학 프로브의 희석액은 물과의 경쟁 반응을 피하기 위해 신선하게 준비되고 즉시 DNA 기질과 반응해야 합니다. - 적절한 B-CeP 1 희석액 2μL(25μM 및 250μM)를 샘플에 추가합니다. 화합물이 없는 경우 다르게 접힌 TBA를 분석하기 위해 3개의 대조군 샘플(C)에서 화합물을 초순수로 교체합니다. 모든 샘플을 37°C에서 배양합니다.
- 1시간, 4시간, 15시간 배양 후 다음 단계까지 튜브를 -20°C에 두어 반응을 중지합니다.
참고: 샘플은 이러한 조건에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. - 진공 원심분리기에서 샘플을 건조시킵니다.
참고: 건조된 샘플은 PAGE 분석을 진행하기 전에 -20°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
표 2: 프로빙 반응에 대한 샘플(구조, 프로브 농도 및 배양 시간). 각 컬럼 세트는 세 가지 TBA 접기 조건(G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA)에 해당합니다. 각 행은 세 가지 다른 배양 시간(1시간, 4시간, 15시간)에 해당합니다. 컬럼 내의 각 셀은 최종 B-CeP 1 프로브 농도(5 또는 50μM)에 해당합니다. 각 세트에 대한 대조군 (C)는 화합물이 없는 상태에서 더 긴 시간(15시간) 동안 배양된 다르게 접힌 TBA의 샘플에 해당합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
4. 고해상도 PAGE
- 변성 폴리아크릴아미드 용액의 제조
참고: 500% 변성 폴리아크릴아미드 겔 용액 20mL를 미리 준비합니다. 이 용액의 약 80mL가 각 실험에 사용됩니다. 호박색 유리병을 사용하거나 유리병을 알루미늄 호일로 덮어 용액을 RT에 보관합니다.
주의: 폴리아크릴아미드는 신경독성이 있습니다. 젤 준비 및 붓기의 모든 단계에서 장갑과 실험실 가운을 착용하십시오. 중합된 아크릴아마이드는 오염된 물질에 적합한 상자에 넣어 폐기하십시오.- 1L 비커에 요소 210g의 무게를 잰다. 250 mL의 40 % 아크릴 아마이드 / 비스 아크릴 아미드 (19/1) 용액과 50x TBE (890mM Tris-HCl, 890mM 붕산염, 20mM EDTA, pH 8)를 추가합니다.
- 비커를 교반 접시에 놓고 용액을 교반 막대와 혼합합니다. 튀거나 오염되는 것을 방지하기 위해 혼합하는 동안 알루미늄 호일로 비커를 덮으십시오.
- 요소가 완전히 용해되고 용액이 맑아질 때까지 용액을 혼합합니다.
참고: 이 단계는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 요소의 용해를 촉진하려면 원하는 최종 부피를 초과하지 않고 작은 물 분취액을 추가하십시오. - 교반 막대를 제거합니다. 용액을 실린더에 붓고 정확한 최종 부피 500mL까지 물을 추가합니다.
- 겔 장치의 설치
- 70% 에탄올로 두 개의 플레이트(노치가 있는 플레이트와 노치가 없는 플레이트)를 청소하고 건조시킨 다음 플레이트를 디메틸디클로로실란 용액으로 처리합니다.
알림: 실란화는 건너뛸 수 있지만 젤 샌드위치를 분해할 때 플레이트 중 하나에서 젤을 방출하는 데 도움이 됩니다.
주의 : 장갑으로 실란화 용액을 취급하고 흄 후드에서 이 용액으로 플레이트 처리를 수행하십시오. - 긴 플레이트의 긴 가장자리를 따라 0.4mm 스페이서를 놓고 짧은 플레이트를 다른 플레이트 위에 놓고 두 플레이트를 바닥에 맞춥니다.
- 상단을 제외한 모든 가장자리를 따라 여러 겹의 종이 테이프를 놓습니다.
- 주조 중 누출을 방지하려면 젤 바닥에 테이프 층을 추가하십시오.
- 깨끗한 cl로 유리 샌드위치의 측면을 클립합니다.amp공급업체의 지침에 따라 s(공급업체마다 약간 다른 장치를 사용합니다.amps 및 개스킷).
- 70% 에탄올로 두 개의 플레이트(노치가 있는 플레이트와 노치가 없는 플레이트)를 청소하고 건조시킨 다음 플레이트를 디메틸디클로로실란 용액으로 처리합니다.
- 젤 붓기
참고: 폴리아크릴아미드 중합은 온도에 민감하기 때문에 RT(25°C)에서 겔을 붓습니다.- 비커에 이전에 준비한 변성 폴리아크릴아미드 용액 80mL(단계 4.1), 10% m/V 과황산암모늄(APS) 용액 450μL, 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 45μL를 사용 직전에 붓습니다.
- 용액을 혼합하고 50mL 주사기를 사용하여 유리판 사이에 빠르게 붓습니다. 기포를 피하면서 유리판 사이에 원하는 수의 웰이 있는 빗을 도입합니다. 필요한 경우 샌드위치를 완전히 채우기 위해 젤 용액을 추가합니다. 빗에 4개의 클램프를 놓아 아래로 누르고 우물이 고르게 분포되도록 합니다.
- 겔을 최소 45분 동안 중합시킵니다.
- 젤 실행
- 중합 후 모든 클램프와 종이 테이프 층을 제거합니다. 빗을 천천히 제거하고 증류수로 우물을 철저히 헹굽니다.
- 특정 공급업체의 지침에 따라 겔 샌드위치를 수직 겔 전기영동 장치에 올바르게 배치하십시오.
- 탈이온수에 TBE 러닝 버퍼(1x: 89mM Tris-HCl, 89mM 붕산염, 2mM EDTA, pH 8)를 준비하고 상단 및 하단 저장소를 모두 버퍼로 채웁니다.
- 50W에서 최소 30분 동안 겔 전기영동을 사전 실행하여 플레이트를 예열합니다.
- 변성 겔 로딩 버퍼 (DGLB : 1 M Tris-HCl, 80 % 포름 아미드, 50 % 글리세롤, 0.05 % 브로 모 페놀 블루)를 초순수로 준비합니다.
참고: GLB는 올리고뉴클레오티드 샘플이 겔 시스템으로 이동하는 것을 추적하고 샘플을 겔의 웰에 로드할 수 있도록 도와줍니다. 변성제 포름아미드의 존재는 비변성 PAGE에서도 DNA 종을 크기에 따라 분리할 수 있도록 합니다. - 건조된 샘플(3.8단계의 샘플)을 5μL의 DGLB에 재현탁시킵니다.
- 샘플을 로드하기 전에 작은 주사기를 사용하여 웰을 세척하고 상부 버퍼 챔버의 TBE 버퍼를 사용하여 웰에서 요소를 제거합니다.
알림: 이 단계를 여러 번 반복하여 웰을 정확하게 청소하여 해석하기 어려운 밴드를 피하십시오. - 샘플을 깨끗한 우물에 넣고 적재 순서를 기록해 둡니다.
- 50W에서 2시간 동안 또는 적어도 브로모페놀 청색 염료가 겔 아래로 2/3 정도 흐를 때까지 겔 전기영동을 실행합니다.
- 겔 이미징
- 전기영동 후 전원을 끄고 유리 샌드위치를 제거한 다음 안경을 청소하십시오.
- 겔 이미저를 사용하여 스캔하여 FAM 표지 올리고뉴클레오티드 띠의 형광을 검출합니다.
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Representative Results
그림 2는 세 가지 다른 구조로 접힌 TBA 올리고뉴클레오티드에 대한 B-CeP 1을 사용한 프로토콜에 설명된 대로 수행된 화학 매핑 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. TBA(G4-TBA)의 G-4중이중 배열은 BPE에서 올리고뉴클레오티드를 접고 K+ 양이온의 존재 하에서 얻은 반면, 동일한 TBA 서열의 단일 가닥 형태(ssTBA)는 칼륨이 없는 상태에서 접혔습니다. 이중-가닥 구조체(dsTBA)는 BPE 완충액에서 TBA를 이의 상보적 서열로 어닐링하여 제조하였다. B-CeP 1의 5 또는 50 μM 최종 농도를 G4-TBA(도 2B의 좌측 레인), ssTBA(도 2B의 중앙 레인) 및 dsTBA(도 2B의 우측 레인)의 2μM 샘플과 1시간, 4시간 및 15시간 동안 반응시켰다. 추가 대조군은 프로브와 반응하지 않는 DNA 구성물입니다. 세 가지 다른 TBA 접힘에 대한 원형 이색성(CD) 분석을 통해 적절한 구조를 확인했습니다(보충 그림 S1). dsTBA의 CD 스펙트럼은 실제로 ~ 260-280 nm에서 양의 장파장 대역과 ~ 245 nm15에서 음의 대역을 특징으로하며, B 형태의 DNA 나선과 일치합니다. ssTBA는 K+ 이온이 없을 때 제대로 구조화되지 않은 것으로 밝혀진 반면, G4-TBA는 K+ 이온이 있는 경우 역평행 G4에서 접히며, 260nm에서 음극 대역, 290nm에서 양성 대역을 특징으로합니다15.
그림 2B에 보고된 고분해능 PAGE 결과는 G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA에 대한 B-CeP 1의 시간 및 농도 의존적 반응에 대한 포괄적인 보기를 제공하며, ssTBA 및 dsTBA 구성물에 대해 관찰된 것과 비교하여 G4-TBA에 대한 현저하게 다른 알킬화 패턴을 명확하게 보여줍니다. 처리되지 않은 샘플(C)보다 이동성이 낮은 띠는 DNA 기질 알킬화와 일치합니다. G4-TBA 기질의 경우, 알킬화에 사용할 수 있는 구아닌(G8)이 하나만 존재하기 때문에 하나의 알킬화 부가물만 명확하게 관찰됩니다(그림 2C의 구아닌의 번호). 반대로, 기판이 ssTBA 또는 dsTBA일 때 다중 부가물이 구별되며, 모든 구아닌은 N7 위치를 자유롭게 프로빙할 수 있습니다. 더 빨리 이동하는 밴드는 대신 가닥 절단의 산물에 기인합니다. G4-TBA 기질의 경우, G-quadruplex tetrads에 관여하는 구아닌(G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15)은 알킬화에 영향을 받지 않는 반면, G8은 알킬화의 다음 단계로서 절단의 영향을 받습니다. ssTBA 및 dsTBA 구조에서 모든 구아닌은 검출된 수많은 밴드에 의해 입증된 바와 같이 절단에 취약하며, 이는 배양 시간이 길어질수록 점진적으로 더 강해집니다.
이 프로토콜은 G-quadruplex tetrad의 형성에 관여하는 guanine과 이러한 배열에 관여하지 않는 guanine을 구별할 수 있도록 하여 G4-TBA 구조를 설명합니다(그림 2C).
실험의 가능한 단점은 반응 환경에 원하지 않는 친핵체가 존재한다는 것입니다. 예를 들어, 반응 완충액의 염에서 유래한 친핵체는 B-CeP와의 반응성을 위해 DNA와 경쟁하여 프로브와 기질의 비효율적인 반응을 유도합니다. 도 3은 친핵성 Tris 염기를 함유한 Tris 완충액에서 수행된 프로빙 반응의 결과를 나타낸다. B-CeP 1(5 및 50μM)은 G4-TBA(도 3의 좌측 레인), ssTBA(도 3의 중앙 레인) 및 dsTBA(도 3의 우측 레인)의 2μM 샘플과 1시간, 4시간, 15시간 및 24시간 동안 반응시킨다. 이러한 조건에서는 세 가지 DNA 기질 모두에 대한 프로브의 반응성이 명확하게 감소합니다. G4-TBA 샘플의 경우 가닥 절단을 감지하지 않고 부가물 형성만 관찰할 수 있습니다. ssTBA 및 dsTBA의 경우, 24시간 후에만 그림 2B에서 15시간 배양 후 관찰된 것과 유사한 DNA 단편화가 나타납니다. B-CeP와 Tris의 원치 않는 경쟁 반응성은 핵산 구조 정보의 부족으로 이어집니다.
그림 2: BPE 완충액에서 B-CeP 1에 의한 TBA G-quadruplex 구조의 화학적 매핑. (A) B-CeP 1의 화학 구조. (B) BPE 완충액에서 B-CeP 1과 TBA 사이의 프로빙 반응의 시간 및 농도 의존성. TBA의 분취액은 G-quadruplex 배열(G4-TBA), 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssTBA) 및 TBA를 상보적 서열로 어닐링하여 이중 가닥 구조(dsTBA)를 형성하기 위해 세 가지 다른 조건에서 접혔습니다. TBA 올리고뉴클레오티드는 겔 시스템에서 시각화할 수 있도록 형광단(FAM)으로 3'-말단에 표지되었습니다. G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA의 분취액(2μM)을 BPE 완충액의 5 또는 50μM 최종 농도에서 B-CeP 1로 처리하고, 지시된 시간 동안 37°C에서 항온처리하였다. 프로빙 반응의 결과는 고분해능 변성 PAGE(20% 폴리아크릴아미드[PAA], 7M 요소, 1x TBE)로 분석되었습니다. "C"는 각 TBA 구조체의 제어 샘플을 나타냅니다. (C) G4-TBA의 G-4중도 배열과 TBA 시퀀스의 구아닌의 번호 매기기에 대한 만화. G4 구조에 관여하지 않아 B-CeP 1과 반응하는 유일한 구아닌은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 녹색 별은 형광단 FAM을 나타냅니다. 약어: TBA = 트롬빈 결합 압타머; B-CeP 1 = 비스-3-클로로피페리딘 1; BPE = 중인산-EDTA; G = 구아닌; G4 = 구아닌 4중; ss = 단일 가닥; ds = 이중 가닥; FAM = 5-카르복시플루오레세인; PAA = 폴리아크릴아미드; PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; TBE = 트리스-붕산염-EDTA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Tris 완충액이 있는 경우의 비효율적인 화학적 매핑. Tris 완충액에서 B-CeP 1과 TBA 사이의 프로빙 반응의 시간 및 농도 의존성. TBA의 분취액은 G-quadruplex 배열(G4-TBA), 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssTBA) 및 TBA를 상보적 서열로 어닐링하여 이중 가닥 구조(dsTBA)를 형성하기 위해 세 가지 다른 조건에서 접혔습니다. TBA 올리고뉴클레오타이드는 겔 시스템에서 시각화할 수 있도록 형광단(FAM)으로 3'-말단에 표지되었습니다. G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA의 부분 표본 (2 μM)을 10 mM Tris-HCl 완충액에서 5 또는 50 μM 최종 농도로 B-CeP 1로 처리하고 지시된 시간 동안 37 °C에서 항온처리하였다. 프로빙 반응의 결과는 고분해능 변성 PAGE(20% PAA, 7M 요소, 1x TBE)로 분석되었습니다. "C"는 각 TBA 구조체의 제어 샘플을 나타냅니다. 프로빙 반응 중 완충액으로 사용되는 Tris의 친핵성은 더 낮은 신호와 구조 정보의 손실로 이어집니다. 약어: TBA = 트롬빈 결합 압타머; B-CeP 1 = 비스-3-클로로피페리딘 1; BPE = 중인산-EDTA; G = 구아닌; G4 = 구아닌 4중; ss = 단일 가닥; ds = 이중 가닥; FAM = 5-카르복시플루오레세인; PAA = 폴리아크릴아미드; PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; TBE = 트리스-붕산염-EDTA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: G4-TBA, ssTBA 및 dsTBA의 CD 스펙트럼. 3개의 상이한 구조를 적절하게 접은 후, CD 스펙트럼을 25°C에서 기록하였다. ~260-280nm의 양의 장파장 대역과 ~245nm의 음의 대역을 특징으로 하는 dsTBA의 CD 스펙트럼은 DNA 나선의 B-형태와 일치한다. K+ 이온이 없을 때 구조화가 불량한 것으로 밝혀진 ssTBA와 비교하여, G4-TBA는 K+ 이온이 있는 경우 역평행 G4에서 접히며, 260nm에서 음극 대역, 290nm에서 양성 대역을 특징으로합니다15. 약어: TBA = 트롬빈 결합 압타머; B-CeP 1 = 비스-3-클로로피페리딘 1; BPE = 중인산-EDTA; G = 구아닌; G4 = 구아닌 4중; ss = 단일 가닥; ds = 이중 가닥. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
G-quadruplex는 일반적으로 구아닌이 풍부한 DNA 염기서열 내에서 접히는 핵산 2차 구조이며, 유전적 제어 및 질병과의 연관성 때문에 중요한 연구 대상입니다. B-CePs에 의한 화학적 매핑은 생리학적 염분 조건에서 G-tetrads의 형성에 관여하는 구아닌 염기를 식별하는 데 사용할 수 있는 DNA G4의 특성 분석에 유용한 프로토콜입니다.
이 프로토콜에 사용된 화학 프로브는 B-CeP 1(그림 2A)이며, 이는 구아닌 핵염기의 N7과 특이적으로 반응하여 G-사중이중 테트라드의 형성에 관여하는 구아닌과 이러한 배열에 관여하지 않는 구아닌을 구별할 수 있습니다. 실제로, G-tetrads(그림 1)의 구아닌(guanine) 사이의 Hoogsteen 수소 상호 작용은 프로브와의 반응을 손상시킵니다. 프로빙 반응의 산물은 DNA 염기서열 내에서 알킬화 부가물 및 절단 부위를 검출하는 데 많이 사용되는 실험실에서 접근할 수 있는 절차인 고분해능 PAGE(그림 2B)에 의해 분해됩니다. 또한, 형광단으로 표지된 DNA 염기서열을 사용하면 방사성 표지 핵산과 인터컬레이터를 사용한 기존 염색 단계를 피하고 안전한 조건에서 실험을 수행할 수 있습니다.
B-CeP 1 프로브는 고체 형태 및 비수용성 원액에서 매우 안정적이며 프로빙 반응을 수행하는 동안 몇 가지 문제만 발생할 수 있습니다. 프로토콜의 단점을 피하려면 DNA와 함께 부가물을 형성하는 데 사용할 수 있는 활성 프로브의 역가를 감소시킬 수 있는 경쟁 반응을 피하기 위해 프로빙 용액에 원치 않는 친핵체가 존재하지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 가장 일반적으로 사용되는 완충액은 트리스 염기를 포함하기 때문에, 우리는 독자에게 친핵성 1 차 아민이 B-CeP 1에 대한 그림 3에서 볼 수 있듯이 DNA 기질10의 구아닌의 반응성과 경쟁하는 프로브 친전자성 센터와 반응 할 수 있음을 상기시킵니다. 이는 프로토콜에 자세히 설명된 대로 인산염 완충액에서 프로빙 반응을 수행하는 근거입니다. 물과의 반응을 피하기 위해7 또한 모든 B-CeP 1 희석액을 신선하게 준비하여 핵산 기질과 즉시 반응시킬 것을 권장한다.
여기에 설명된 B-CeP에 의한 화학적 매핑은 G4s16의 초기 특성 분석을 위한 주류 분석을 나타내는 디메틸 설페이트(DMS) 발자국 프로토콜에 대한 편리한 대안입니다. 두 프로토콜은 기본적으로 동일한 정보, 즉 G4 구조의 형성과 G4 형태에 관계없이 G4에 관련된 구아닌의 식별을 제공합니다. 그러나 B-CeP를 사용한 화학 매핑은 DMS 풋프린트와 관련하여 프로토콜의 단순성이라는 주요 이점을 가지고 있습니다. 프로빙 반응 후, 여기에 설명된 프로토콜은 추가 단계가 필요하지 않은 반면, DMS 풋프린트는 프로브와 반응한 후 핫 피페리딘에 의한 후속 분할이 필요하며, 이는 추가적인 샘플 정제 및 완충액 교환을 의미합니다16. B-CeP를 사용한 프로토콜의 단계 수의 감소는 초기 DNA 기질의 소량 사용을 의미합니다. 마지막으로, 개념 증명으로서 TBA 서열과 함께 본원에 기술된 B-CeP에 의한 화학적 맵핑은 임의의 다른 잠재적인 G-사중-형성 서열에 적용할 수 있는 새로운 실험으로 이어질 것이다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 파도바 대학교 제약 및 약리학과(PRIDJ-BIRD2019)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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