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Biochemistry

इन विट्रो "बीआईएस -3-क्लोरोपिपेरिडिन द्वारा जी-चौगुनी डीएनए संरचनाओं का रासायनिक मानचित्रण"।

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65373
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2Institute of Organic Chemistry, Justus Liebig University Giessen

Summary

बीआईएस -3-क्लोरोपिपेरिडीन (बी-सीईपी) विट्रो में डीएनए टेम्प्लेट में जी-चौगुनी संरचनाओं की पहचान और विशेषता के लिए उपयोगी रासायनिक जांच हैं। यह प्रोटोकॉल बी-सीईपी के साथ जांच प्रतिक्रियाओं को करने और उच्च-रिज़ॉल्यूशन पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिक्रिया उत्पादों को हल करने की प्रक्रिया का विवरण देता है।

Abstract

जी-चौगुनी (जी 4 एस) जैविक रूप से प्रासंगिक, गैर-कैननिकल डीएनए संरचनाएं हैं जो जीन अभिव्यक्ति और बीमारियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। संभावित जी-चौगुनी बनाने वाले अनुक्रमों (पीक्यूएस) के भीतर डीएनए के इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिए सुलभ तरीकों की आवश्यकता होती है। बी-सीईपी अल्काइलेटिंग एजेंटों का एक वर्ग है जो न्यूक्लिक एसिड की उच्च-क्रम संरचना की जांच के लिए उपयोगी रासायनिक जांच साबित हुए हैं। यह पेपर एक नए रासायनिक मानचित्रण परख का वर्णन करता है जो गुआनिन के एन7 के साथ बी-सीईपी की विशिष्ट प्रतिक्रिया का फायदा उठाता है, इसके बाद अल्काइलेटेड जीएस पर प्रत्यक्ष स्ट्रैंड क्लीवेज होता है।

अर्थात्, जी 4 सिलवटों को अनफोल्डेड डीएनए रूपों से अलग करने के लिए, हम थ्रोम्बिन-बाइंडिंग एपटामर (टीबीए) की जांच करने के लिए बी-सीईपी 1 का उपयोग करते हैं, एक 15-मेर डीएनए जो जी 4 व्यवस्था को ग्रहण करने में सक्षम है। बी-सीईपी 1 के साथ बी-सीईपी-प्रतिक्रिया देने वाले गुआनिन की प्रतिक्रिया से ऐसे उत्पाद उत्पन्न होते हैं जिन्हें एकल-न्यूक्लियोटाइड स्तर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा हल किया जा सकता है। बी-सीईपी का उपयोग करके मैपिंग जी-चौगुनी बनाने वाले डीएनए अनुक्रमों के इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और शक्तिशाली उपकरण है, जो जी-टेट्राड्स के गठन में शामिल गुआनिन के सटीक स्थान को सक्षम करता है।

Introduction

विशिष्ट वाटसन-क्रिक डबल हेलिक्स के अलावा, न्यूक्लिक एसिड विभिन्न माध्यमिक संरचनाओं को अपना सकते हैं, जैसे कि वैकल्पिक जी-चौगुनी (जी 4) रूप, उनके गुआनिन-समृद्ध अनुक्रमों के कारण। जी 4 संरचना प्लानर टेट्रामर्स के गठन पर आधारित है, जिसे जी-टेट्राड्स कहा जाता है, जिसमें चार गुआनिन हूगस्टीन हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से बातचीत करते हैं। जी-टेट्राड्स को मोनोवेलेंट पिंजरों द्वारा स्टैक और आगे स्थिर किया जाता है जो गुआनिन कोर (चित्रा 1)1 के केंद्र में समन्वित होते हैं।

Figure 1
चित्र 1: जी-चौगुनी संरचना का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) जी-टेट्राड का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्लानर सरणी को हूगस्टीन बेस-पेयरिंग और एक केंद्रीय केशन (एम +) द्वारा स्थिर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कम से कम दो लगातार गुआनिन न्यूक्लियोटाइड के चार या अधिक रन वाले अनुक्रम संभावित जी-चौगुनी बनाने वाले अनुक्रम (पीक्यूएस) हैं जो जी-चौगुनी संरचनाओं में फोल्ड हो सकते हैं। पीक्यूएस कई अलग-अलग सेलुलर संदर्भों में स्थित हैं, जैसे कि टेलोमेरेस, जीन प्रमोटर, राइबोसोमल डीएनए और पुनर्संयोजन साइटों पर, और कईजैविक प्रक्रियाओं के विनियमन में शामिल हैं। इसलिए, मानव जीनोम में जी 4 एस की पहचान और प्रयोगात्मक सत्यापन, जो वर्तमान में मुख्य रूप से कम्प्यूटेशनल टूल के माध्यम से किया जाता है, एक जैविक रूप से प्रासंगिक मुद्दाहै। कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणियों का समर्थन करने या अप्रत्याशित जी 4 संरचनाओं का पता लगाने के लिए, डीएनए टेम्पलेट में जी 4 गठन की पहचान करने के लिए रासायनिक मानचित्रण पर आधारित एक सुलभ विधि यहां दिखाई गई है, जिससे जी-टेट्राड संरचना बनाने वाले गुआनिन की सटीक पहचान हो सकती है।

रिपोर्ट की गई रासायनिक मानचित्रण परख जी 4 संरचनाओं के गठन के बाद गुआनिन के साथ बीआईएस -3-क्लोरोपिपेरिडिन (बी-सीईपी) की विभिन्न प्रतिक्रिया का फायदा उठाती है। न्यूक्लियोफाइल 4,5,6,7,8,9 के साथ उनकी उच्च प्रतिक्रिया के कारण, बी-सीईपी न्यूक्लिक एसिड-अल्काइलेटिंग एजेंट हैं जो गुआनिन न्यूक्लियोटाइड10 की एन7 स्थिति के साथ बहुत कुशलता से प्रतिक्रिया करने की क्षमता रखते हैं। अल्काइलेशन के बाद एकल और डबल-फंसे डीएनए संरचनाओं में डिप्यूरिनेशन और स्ट्रैंड क्लीवेज होता है। इसके विपरीत, जी 4 व्यवस्था में जी-टेट्राड्स के गठन में शामिल गुआनिन बी-सीईपी अल्काइलेशन के लिए अभेद्य हैं, क्योंकि गुआनिन की एन7 स्थिति को हूगस्टीन हाइड्रोजन बॉन्ड में फंसाया गया है। बी-सीईपी की यह विशिष्ट प्रतिक्रिया न केवल जी 4 संरचनाओं का पता लगाने की अनुमति देती है, बल्कि टेट्राड (एस) बनाने वाले गुआनिन की पहचान भी करती है, क्योंकि उन्हें एकल और डबल-फंसे डीएनए में गुआनिन की तुलना में अल्काइलेशन से उनकी सापेक्ष सुरक्षा से अनुमान लगाया जा सकता है।

रासायनिक मानचित्रण प्रोटोकॉल को यहां बी-सीईपी 1 (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके थ्रोम्बिन-बाइंडिंग एपटामर (टीबीए) के लक्षण वर्णन के लिए एक जांच के रूप में रिपोर्ट किया गया है, एक 15-मेर डीएनए पोटेशियम केशन11,12 की उपस्थिति में जी 4 व्यवस्था को ग्रहण करने में सक्षम है। टीबीए (जी 4-टीबीए) की जी 4 व्यवस्था की तुलना सीधे दो नियंत्रणों के साथ की जाती है, अर्थात् एकल-फंसे हुए रूप (एसएसटीबीए) में टीबीए और डबल-स्ट्रैंडेड कंस्ट्रक्शन (डीएसटीबीए) बनाने के लिए टीबीए को इसके पूरक अनुक्रम में लगाया जाता है (तालिका 1)। जांच प्रतिक्रियाओं के उत्पादों को एकल-न्यूक्लियोटाइड स्तर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा अल्काइलेटेड गुआनिन में व्यक्तिगत अल्काइलेशन जोड़ों और डीएनए स्ट्रैंड दरार का पता लगाकर हल किया जाता है। जेल पर विज़ुअलाइज़ेशन टीबीए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के संयुग्मन द्वारा इसके 3'-अंत में फ्लोरोफोरे के साथ सक्षम होता है (तालिका 1)। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि टीबीए को इसके विभिन्न अनुरूपताओं (जी 4 और नियंत्रण) में कैसे मोड़ना है, और पेज के बाद बी-सीईपी के साथ जांच प्रतिक्रियाएं कैसे करें।

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Protocol

1. न्यूक्लिक एसिड और रासायनिक जांच तैयारी

  1. न्यूक्लिक एसिड
    नोट: "टीबीए" नामक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 15-मेर डीएनए अनुक्रम 5'-जीजीटी-टीजीजी-टीजीटी-जीजीटी-टीजीटी-टीजीजी-3' है जिसे फ्लोरोफोर 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन (एफएएम) द्वारा 3'-अंत में लेबल किया गया है ताकि जेल पर विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम किया जा सके। बिना लेबल वाला ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड "सीटीबीए" इसका डीएनए पूरक अनुक्रम 5'-सीसीए-एसीसी-एसीए-सीसीए-एसीसी-एसीसी-3' है। टीबीए और सीटीबीए को तीन अलग-अलग संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जाता है, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है।
    1. बाँझ डिस्पोजेबल प्राप्त करने और संदूषण से बचने के लिए आटोक्लेव युक्तियाँ और 0.5 एमएल ट्यूब।
    2. अल्ट्राप्योर पानी में प्रत्येक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को 100 μM की अंतिम सांद्रता में घुलनशील करने वाले स्टॉक समाधान तैयार करें। निर्माता द्वारा प्रदान किए गए 260 एनएम पर विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करते हुए, पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ सटीक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: विलोपन गुणांक: क्रमशः टीबीए और सीटीबीए के लिए 164,300 एम -1 सेमी -1 और 138,600 एम -1 सेमी -1 का उपयोग किया गया था।
    3. टीबीए और सीटीबीए स्टॉक समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस (इन स्थितियों में महीनों के लिए) पर स्टोर करें।
  2. यौगिक बी-सीईपी 1
    नोट: यौगिक बी-सीईपी 1 को पहले रिपोर्ट किए गएअनुसार संश्लेषित किया गया है।
    1. ~ 10 एमएम पर बी-सीईपी 1 स्टॉक समाधान तैयार करें। फ्यूम हुड में स्थित विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके लियोफिलाइज्ड यौगिक के ~ 1 मिलीग्राम का वजन करें और इसे 100% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में घुलनशील करें।
    2. यौगिक की वास्तविक मात्रा और डीएमएसओ (डी = 1.1 ग्राम / सेमी3) के आधार पर सटीक यौगिक एकाग्रता की गणना करें।
      नोट: हर समय दस्ताने के साथ यौगिक को संभालें (दोनों जब लियोफिलाइज्ड और डीएमएसओ में भंग हो जाते हैं)13,14।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संरचनाएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

2. न्यूक्लिक एसिड संरचनाओं की तह

  1. बफर तैयार करना
    1. एक बीपीई बफर समाधान तैयार करें (बाइफॉस्फेट-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड [ईडीटीए], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na 2 HPO4, 1 mM Na2EDTA, pH7.4) और अल्ट्राप्योर पानी में 500 mM KCl का घोल। 0.22 μm छिद्र आकार फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
      नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, ताजा तैयार समाधान ों का उपयोग करें। बीपीई बफर को 15 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. हीट-रिफोल्डिंग प्रक्रिया द्वारा जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए नमूनों को मोड़ना
    नोट: जी 4 संरचना (जी 4-टीबीए) को मोड़ने के लिए पोटेशियम केशन आवश्यक हैं। नियंत्रण एसएसटीबीए और डीएसटीबीए के फोल्डिंग समाधान में पोटेशियम केशन न जोड़ें।
    1. 1x BPE और 100 mM KCl में G4-TBA के 4 μM घोल के 40 μL तैयार करें। ट्यूब को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड G4-TBA समाधान को निष्क्रिय करें और धीरे-धीरे इसे कमरे के तापमान (RT) तक ठंडा करें ताकि TBA को G-चौगुनी में मोड़ने की अनुमति मिल सके।
    2. 1x BPE में SSTBA के 4 μM समाधान के 40 μL तैयार करें। टीबीए को उसके एकल-फंसे हुए रूप में मोड़ने के लिए, चरण 2.2.1 में उल्लिखित हीट-रिफोल्डिंग प्रक्रिया करें।
    3. 1x BPE में TBA और cTBA की सममोलर मात्रा को मिलाकर dsTBA के 4 μM समाधान के 40 μL तैयार करें। टीबीए के लिए ऊपर उल्लिखित (चरण 2.2.1) के रूप में हीट-रिफोल्डिंग प्रक्रिया करें ताकि वह अपने पूरक अनुक्रम सीटीबीए को नष्ट कर सके और टीबीए के डबल-स्ट्रैंडेड रूप का निर्माण कर सके।
      नोट: प्रत्येक फोल्डिंग समाधान की अंतिम मात्रा जांच प्रतिक्रियाओं के लिए नमूनों की संख्या पर आधारित है, यह देखते हुए कि प्रत्येक नमूने के लिए 4 μM समाधान के 5 μL की आवश्यकता होगी। पाइपिंग त्रुटियों से बचने के लिए प्रत्येक समाधान की थोड़ी अतिरिक्त मात्रा तैयार करें।

3. प्रतिक्रियाओं की जांच

नोट: गर्मी-रिफोल्डिंग प्रक्रिया के तुरंत बाद प्रतिक्रियाओं की जांच की जानी चाहिए।

  1. जब जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए के फोल्डिंग समाधान आरटी में ठंडा हो जाते हैं, तो शॉर्ट-स्पिन सेंट्रीफ्यूजेशन (आरटी में 5-8 सेकंड के लिए 7,000 × ग्राम ) करें और जांच प्रतिक्रियाएं शुरू करें।
  2. 21 खाली 0.5 एमएल आटोक्लेव ट्यूब तैयार करें। उन्हें प्रयोगशाला नमूनों के लिए रैक में सात ट्यूबों के तीन सेटों में व्यवस्थित करें, जैसा कि तालिका 2 में बताया गया है।
    नोट: प्रत्येक कॉलम सेट तीन अलग-अलग टीबीए फोल्डिंग स्थितियों जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए से मेल खाती है। प्रत्येक पंक्ति तीन अलग-अलग इनक्यूबेशन समय से मेल खाती है। कॉलम के भीतर प्रत्येक सेल अंतिम बी-सीईपी 1 जांच एकाग्रता (तालिका 2) से मेल खाती है। ट्यूबों को स्पष्ट रूप से लेबल करना सुनिश्चित करें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 3 μL अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें।
  4. पहले सेट (चरण 3.2) की प्रत्येक ट्यूब में मुड़े हुए जी 4-टीबीए के 5 μL जोड़ें। दूसरे सेट की प्रत्येक ट्यूब में मुड़े हुए एसएसटीबीए के 5 μL जोड़ें। तीसरे सेट की प्रत्येक ट्यूब में 5 μL मुड़े हुए dsTBA जोड़ें।
  5. बी-सीईपी 1 स्टॉक समाधान को अल्ट्राप्योर पानी में 250 μM और 25 μM तक पतला करें।
    नोट: बी-सीईपी 1 रासायनिक जांच के कमजोर पड़ने को ताजा तैयार किया जाना चाहिए और पानी के साथ प्रतिस्पर्धी प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए डीएनए सब्सट्रेट के साथ तुरंत प्रतिक्रिया की जानी चाहिए।
  6. नमूने में उपयुक्त B-CeP 1 तनुकरण (25 μM और 250 μM) के 2 μL जोड़ें। यौगिक की अनुपस्थिति में अलग-अलग मुड़े हुए टीबीए के विश्लेषण के लिए तीन नियंत्रण नमूनों (सी) में यौगिक को अल्ट्राप्योर पानी से बदलें। सभी नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. 1 घंटे, 4 घंटे और 15 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूबों को अगले चरण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखकर प्रतिक्रिया को रोकें।
    नोट: नमूने कुछ दिनों के लिए इन स्थितियों में संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. एक वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में नमूने सुखाएं।
    नोट: पेज विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले सूखे नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर हफ्तों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं।

तालिका 2: जांच प्रतिक्रियाओं (संरचनाओं, जांच सांद्रता, और इनक्यूबेशन समय) के लिए नमूने। प्रत्येक कॉलम सेट तीन अलग-अलग टीबीए फोल्डिंग स्थितियों (जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए) से मेल खाता है। प्रत्येक पंक्ति तीन अलग-अलग इनक्यूबेशन समय (1, 4, 15 घंटे) से मेल खाती है। कॉलम के भीतर प्रत्येक सेल अंतिम बी-सीईपी 1 जांच एकाग्रता (5 या 50 μM) से मेल खाती है। प्रत्येक सेट के लिए नियंत्रण (सी) यौगिक की अनुपस्थिति में लंबे समय (15 घंटे) के लिए इनक्यूबेट किए गए अलग-अलग मुड़े हुए टीबीए के नमूने से मेल खाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

4. उच्च-रिज़ॉल्यूशन पृष्ठ

  1. विकृत पॉलीक्रिलामाइड समाधान की तैयारी
    नोट: 20% विकृत पॉलीक्रिलामाइड जेल समाधान के 500 एमएल अग्रिम तैयार करें। प्रत्येक प्रयोग के लिए इस समाधान के लगभग 80 एमएल का उपयोग किया जाएगा। आरटी पर समाधान को स्टोर करने के लिए एक एम्बर ग्लास बोतल का उपयोग करें या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कांच की बोतल को कवर करें।
    चेतावनी: पॉलीक्रिलामाइड न्यूरोटॉक्सिक है। जेल तैयार करने और डालने के सभी चरणों के दौरान, दस्ताने और एक लैब कोट पहनें। दूषित सामग्री के लिए एक उपयुक्त बॉक्स में पॉलीमराइज्ड एक्रिलामाइड को फेंक दें।
    1. 1 लीटर बीकर में 210 ग्राम यूरिया का वजन करें। 40% एक्रिलामाइड / बिसैक्रिलामाइड (19/1) समाधान के 250 एमएल और 10x टीबीई के 50 एमएल (890 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 890 एमएम बोरेट, 20 एमएम ईडीटीए, पीएच 8) जोड़ें।
    2. बीकर को एक स्टिर प्लेट पर रखें और घोल को एक सरगर्मी रॉड के साथ मिलाएं। छींटे और संदूषण को रोकने के लिए मिश्रण के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर को कवर करें।
    3. घोल को तब तक मिलाएं जब तक यूरिया पूरी तरह से घुल न जाए और घोल साफ न हो जाए।
      नोट: इस चरण में कई घंटे लग सकते हैं। यूरिया के विघटन को बढ़ावा देने के लिए, वांछित अंतिम मात्रा से परे जाने के बिना पानी का एक छोटा सा एलिकोट जोड़ें।
    4. हिलाने वाली छड़ को हटा दें। एक सिलेंडर में घोल डालें और 500 एमएल की सटीक अंतिम मात्रा में पानी जोड़ें।
  2. जेल उपकरण की स्थापना
    1. 70% इथेनॉल के साथ दो प्लेटों (एक नॉच और एक अननॉच्ड) को साफ करें, उन्हें सूखने दें, और फिर प्लेटों को डाइमिथाइलडाइक्लोरोसिलेन समाधान के साथ इलाज करें।
      नोट: सिलनाइजेशन को छोड़ा जा सकता है, हालांकि यह जेल सैंडविच को अलग करने पर प्लेटों में से एक से जेल की रिहाई में मदद करता है।
      सावधानी: दस्ताने के साथ सिलनाइजेशन समाधान को संभालें और फ्यूम हुड में इस समाधान के साथ प्लेट उपचार करें।
    2. लंबी प्लेट के लंबे किनारों के साथ 0.4 मिमी स्पेसर रखें, छोटी प्लेट को दूसरे के ऊपर रखें, और नीचे दो प्लेटों को संरेखित करें।
    3. शीर्ष को छोड़कर सभी किनारों के साथ पेपर टेप की कई परतें रखें।
    4. कास्टिंग के दौरान लीक से बचने के लिए, जेल के निचले भाग में टेप की एक अतिरिक्त परत जोड़ें।
    5. आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन करते हुए साफ क्लैंप के साथ ग्लास सैंडविच के किनारों को क्लिप करें (विभिन्न आपूर्तिकर्ता थोड़ा अलग उपकरण, सैंडविच क्लैंप और गैसकेट का उपयोग करते हैं)।
  3. जेल डालना
    नोट: आरटी (25 डिग्री सेल्सियस) पर जेल डालो, क्योंकि पॉलीक्रिलामाइड पोलीमराइजेशन तापमान-संवेदनशील है।
    1. एक बीकर में, उपयोग से तुरंत पहले पहले तैयार किए गए डिनेचरिंग पॉलीक्रिलामाइड समाधान (चरण 4.1), 10% एम / वी अमोनियम परसल्फेट (एपीएस) समाधान के 450 μL, और टेट्रामेथिलएथिलीनडायमाइन (TEMED) के 45 μL डालें।
    2. घोल को मिलाएं और 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके ग्लास प्लेटों के बीच तेजी से डालें। बुलबुले से बचते हुए, कांच की प्लेटों के बीच वांछित संख्या में कुओं के साथ कंघी पेश करें। यदि आवश्यक हो, तो सैंडविच को पूरी तरह से भरने के लिए जेल समाधान जोड़ें। कंघी पर चार क्लैंप रखें ताकि नीचे दबाया जा सके और कुओं के वितरण की अनुमति दी जा सके।
    3. जेल को कम से कम 45 मिनट के लिए पॉलीमराइज्ड होने दें।
  4. जेल चलाना
    1. पोलीमराइजेशन के बाद, सभी क्लैंप और पेपर टेप परतों को हटा दें। कंघी को धीरे-धीरे निकालें और आसुत जल से कुओं को अच्छी तरह से धो लें।
    2. ऊर्ध्वाधर जेल वैद्युतकणसंचलन तंत्र में जेल सैंडविच को सही ढंग से रखने के लिए विशिष्ट आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन करें।
    3. विआयनीकृत पानी में टीबीई रनिंग बफर (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM Borate, 2 mM EDTA, pH 8) तैयार करें और बफर के साथ शीर्ष और निचले दोनों जलाशयों को भरें।
    4. 50 डब्ल्यू पर कम से कम 30 मिनट के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन का पूर्व-रन करके प्लेटों को गर्म करें।
    5. अल्ट्राप्योर पानी में डिनेचरिंग जेल लोडिंग बफर (डीजीएलबी: 1 एम ट्रिस-एचसीएल, 80% फॉर्ममाइड, 50% ग्लिसरॉल, 0.05% ब्रोमोफेनॉल ब्लू) तैयार करें।
      नोट: जीएलबी जेल सिस्टम में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड नमूनों के आंदोलन को ट्रैक करने में मदद करता है और जेल के कुओं में नमूने लोड करने की अनुमति देता है। विकृत एजेंट फॉर्मामाइड की उपस्थिति डीएनए प्रजातियों को आकार के अनुसार अलग करने की अनुमति देती है, यहां तक कि एक गैर-विकृत पेज में भी।
    6. DGLB के 5 μL में सूखे नमूने (चरण 3.8 से नमूने) को पुन: निलंबित करें।
    7. नमूने लोड करने से पहले, कुओं से यूरिया निकालने के लिए ऊपरी बफर चैंबर में एक छोटी सिरिंज और टीबीई बफर का उपयोग करके कुओं को साफ करें।
      नोट: कुओं को सही ढंग से साफ करने के लिए इस चरण को कई बार दोहराएं, इस प्रकार व्याख्या करने में मुश्किल बैंड से बचें।
    8. नमूनों को साफ कुओं में लोड करें और लोडिंग के क्रम का एक नोट बनाएं।
    9. जेल वैद्युतकणसंचलन को 50 डब्ल्यू पर 2 घंटे के लिए चलाएं, या कम से कम तब तक चलाएं जब तक ब्रोमोफेनॉल ब्लू डाई जेल के नीचे 2/3 न चला जाए।
  5. जेल की इमेजिंग।
    1. वैद्युतकणसंचलन के बाद, बिजली की आपूर्ति बंद करें, ग्लास सैंडविच को हटा दें, और गिलास साफ करें।
    2. जेल इमेजर का उपयोग करके स्कैन करके एफएएम-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड बैंड की प्रतिदीप्ति का पता लगाएं।

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Representative Results

चित्रा 2 एक रासायनिक मानचित्रण परख का एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है, जैसा कि तीन अलग-अलग संरचनाओं में मुड़े हुए टीबीए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड पर बी-सीईपी 1 के साथ प्रोटोकॉल में वर्णित है। टीबीए (जी 4-टीबीए) की जी-चौगुनी व्यवस्था बीपीई में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को मोड़कर और के + केशन की उपस्थिति में प्राप्त की गई थी, जबकि उसी टीबीए अनुक्रम (एसएसटीबीए) के एकल-फंसे हुए रूप को पोटेशियम की अनुपस्थिति में मोड़ दिया गया था। डबल-स्ट्रैंडेड कंस्ट्रक्ट (डीएसटीबीए) को बीपीई बफर में अपने पूरक अनुक्रम में टीबीए को एनीलिंग करके तैयार किया गया था। या तो B-CeP 1 की 5 या 50 μM अंतिम एकाग्रता को G4-TBA (चित्रा 2B के बाएं लेन), SSTBA (चित्रा 2B के केंद्रीय लेन), और DSTBA (चित्रा 2B के दाएं लेन) के 2 μM नमूनों के साथ 1 घंटे, 4 घंटे और 15 घंटे के लिए प्रतिक्रिया की गई थी। अतिरिक्त नियंत्रण डीएनए संरचनाएं हैं जो जांच के साथ प्रतिक्रिया नहीं करती हैं। तीन अलग-अलग टीबीए फोल्डिंग के परिपत्र द्विचरवाद (सीडी) विश्लेषण ने उनकी उचित संरचना (पूरक चित्रा एस 1) की पुष्टि की। डीएसटीबीए के सीडी स्पेक्ट्रम को वास्तव में ~ 260-280 एनएम पर एक सकारात्मक लंबी तरंग दैर्ध्य बैंड और ~ 245 एनएम15 पर एक नकारात्मक बैंड की विशेषता थी, जो लगातार अपने बी-फॉर्म में डीएनए हेलिक्स के साथ था। एसएसटीबीए को के + आयनों की अनुपस्थिति में खराब संरचित पाया गया था, जबकि जी 4-टीबीए के + आयनों की उपस्थिति में एक विरोधी समानांतर जी 4 में फोल्ड होता है, जो 260 एनएम पर एक नकारात्मक बैंड और 290 एनएम15 पर एक सकारात्मक बैंड की विशेषता है।

चित्रा 2 बी में रिपोर्ट किए गए उच्च-रिज़ॉल्यूशन पेज परिणाम जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए के प्रति बी-सीईपी 1 के समय और एकाग्रता-निर्भर प्रतिक्रियाओं का एक व्यापक दृश्य प्रदान करते हैं, जो स्पष्ट रूप से एसएसटीबीए और डीएसटीबीए संरचनाओं की तुलना में जी 4-टीबीए के लिए एक स्पष्ट रूप से अलग अल्काइलेशन पैटर्न का खुलासा करते हैं। अनुपचारित नमूने (सी) की तुलना में कम गतिशीलता के साथ पलायन करने वाले बैंड डीएनए सब्सट्रेट अल्काइलेशन के अनुरूप हैं। जी 4-टीबीए सब्सट्रेट के मामले में, क्षारीकरण के लिए उपलब्ध केवल एक गुआनिन (जी 8) की उपस्थिति के अनुसार केवल एक अल्काइलेशन जोड़ स्पष्ट रूप से देखा जाता है (चित्रा 2 सी में गुआनिन की संख्या)। इसके विपरीत, सब्सट्रेट या तो एसएसटीबीए या डीएसटीबीए होने पर कई जोड़ों को अलग किया जाता है, जिसमें एन7 स्थिति रखने वाले सभी गुआनिन की जांच करने के लिए स्वतंत्र होता है। तेजी से पलायन करने वाले बैंड को स्ट्रैंड क्लीवेज के उत्पादों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। जी 4-टीबीए सब्सट्रेट के मामले में, जी-चौगुनी टेट्राड्स में शामिल गुआनिन (जी 1, जी 2, जी 5, जी 6, जी 10, जी 11, जी 14, जी 15) अल्काइलेशन के लिए अभेद्य हैं, जबकि जी 8 अल्काइलेशन के निम्नलिखित चरण के रूप में दरार से प्रभावित होता है। एसएसटीबीए और डीएसटीबीए संरचनाओं में, सभी गुआनिन दरार के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जैसा कि पता लगाए गए कई बैंडों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, जो लंबे समय तक उत्तरोत्तर अधिक तीव्र हो जाते इनक्यूबेशन।

यह प्रोटोकॉल जी-चौगुनी टेट्राड्स के गठन में शामिल गुआनिन और गुआनिन के बीच भेदभाव की अनुमति देता है जो इस तरह की व्यवस्था में शामिल नहीं हैं, इस प्रकार जी 4-टीबीए संरचना (चित्रा 2 सी) को स्पष्ट करते हैं।

प्रयोग का एक संभावित दोष प्रतिक्रिया वातावरण में अवांछित न्यूक्लियोफाइल की उपस्थिति है। उदाहरण के लिए, प्रतिक्रिया बफर में लवण से प्राप्त न्यूक्लियोफाइल बी-सीईपी के साथ प्रतिक्रिया के लिए डीएनए के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं, जिससे सब्सट्रेट के साथ जांच की अक्षम प्रतिक्रिया होती है। चित्रा 3 ट्रिस बफर में किए गए जांच प्रतिक्रियाओं के परिणामों को दर्शाता है, जिसमें न्यूक्लियोफिलिक ट्रिस बेस होता है। B-CeP 1 (5 और 50 μM) को G4-TBA (चित्रा 3 के बाएं लेन), SSTBA (चित्रा 3 के केंद्रीय लेन), और DSTBA (चित्रा 3 के दाएं लेन) के 2 μM नमूनों के साथ 1 घंटे, 4 घंटे, 15 घंटे और 24 घंटे के लिए प्रतिक्रिया की जाती है। इन स्थितियों में, सभी तीन डीएनए सब्सट्रेट्स की ओर जांच की प्रतिक्रिया स्पष्ट रूप से कम हो जाती है। जी 4-टीबीए नमूनों के लिए, हम स्ट्रैंड क्लीवेज का पता लगाए बिना केवल जोड़ों के गठन का निरीक्षण कर सकते हैं। एसएसटीबीए और डीएसटीबीए के मामलों में, केवल 24 घंटे के बाद डीएनए विखंडन चित्र 2 बी में 15 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद देखे गए के बराबर है। ट्रिस के साथ बी-सीईपी की अवांछित प्रतिस्पर्धी प्रतिक्रिया न्यूक्लिक एसिड संरचनात्मक जानकारी की कमी की ओर ले जाती है।

Figure 2
चित्र 2: बीपीई बफर में बी-सीईपी 1 द्वारा टीबीए जी-चौगुनी संरचना का रासायनिक मानचित्रण। (ए) बी-सीईपी 1 की रासायनिक संरचना। (बी) बीपीई बफर में बी-सीईपी 1 और टीबीए के बीच जांच प्रतिक्रियाओं का समय और एकाग्रता निर्भरता। जी-चौगुनी व्यवस्था (जी 4-टीबीए), एकल-फंसे हुए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (एसएसटीबीए) को प्राप्त करने के लिए टीबीए के एलिकोट को तीन अलग-अलग स्थितियों में मोड़ा गया था, और टीबीए को डबल-स्ट्रैंडेड कंस्ट्रक्शन (डीएसटीबीए) बनाने के लिए इसके पूरक अनुक्रम में लगाया गया था। टीबीए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को जेल सिस्टम पर विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए फ्लोरोफोरे (एफएएम) के साथ 3'-एंड पर लेबल किया गया था। जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए के एलिकोट (2 μM) को बीपीई बफर में 5 या 50 μM अंतिम एकाग्रता पर B-CeP 1 के साथ इलाज किया गया और संकेतित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। जांच प्रतिक्रियाओं के परिणाम का विश्लेषण उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिनेचरिंग पेज (20% पॉलीक्रिलामाइड [पीएए], 7 एम यूरिया, 1 एक्स टीबीई) द्वारा किया गया था। "सी" प्रत्येक टीबीए निर्माण के नियंत्रण नमूने को इंगित करता है। (सी) जी 4-टीबीए की जी-चौगुनी व्यवस्था और टीबीए अनुक्रम में गुआनिन की संख्या का कार्टून। एकमात्र गुआनिन जो जी 4 संरचना में शामिल नहीं था, इस प्रकार बी-सीईपी 1 के साथ प्रतिक्रिया करता है, लाल रंग में हाइलाइट किया गया है। हरा तारा फ्लोरोफोरे एफएएम का प्रतिनिधित्व करता है। संक्षेप: टीबीए = थ्रोम्बिन-बाइंडिंग एपटामर; बी-सीईपी 1 = बीआईएस -3-क्लोरोपिपेरिडीन 1; बीपीई = बाइफॉस्फेट-ईडीटीए; जी = गुआनिन; जी 4 = गुआनिन चौगुनी; एसएस = एकल-फंसे हुए; डीएस = डबल-फंसे हुए; एफएएम = 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन; पीएए = पॉलीक्रिलामाइड; पेज = पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; टीबीई = ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ट्रिस बफर की उपस्थिति में अक्षम रासायनिक मानचित्रण। ट्रिस बफर में बी-सीईपी 1 और टीबीए के बीच जांच प्रतिक्रियाओं की समय और एकाग्रता निर्भरता। जी-चौगुनी व्यवस्था (जी 4-टीबीए), एकल-फंसे हुए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (एसएसटीबीए) को प्राप्त करने के लिए टीबीए के एलिकोट को तीन अलग-अलग स्थितियों में मोड़ा गया था, और टीबीए को डबल-स्ट्रैंडेड कंस्ट्रक्शन (डीएसटीबीए) बनाने के लिए इसके पूरक अनुक्रम में लगाया गया था। टीबीए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को जेल सिस्टम पर विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए फ्लोरोफोरे (एफएएम) के साथ 3'-एंड पर लेबल किया गया था। G4-TBA, SSTBA और DSTBA के एलिकोट (2 μM) को B-CeP 1 के साथ 10 mM Tris-HCl बफर में 5 या 50 μM अंतिम सांद्रता पर इलाज किया गया और संकेतित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। जांच प्रतिक्रियाओं के परिणाम का विश्लेषण उच्च-रिज़ॉल्यूशन डिनेचरिंग पेज (20% पीएए, 7 एम यूरिया, 1 एक्स टीबीई) द्वारा किया गया था। "सी" प्रत्येक टीबीए निर्माण के नियंत्रण नमूने को इंगित करता है। जांच प्रतिक्रियाओं के दौरान बफर के रूप में उपयोग किए जाने वाले ट्रिस की न्यूक्लियोफिलिसिटी कम संकेतों और संरचनात्मक जानकारी के नुकसान की ओर ले जाती है। संक्षेप: टीबीए = थ्रोम्बिन-बाइंडिंग एपटामर; बी-सीईपी 1 = बीआईएस -3-क्लोरोपिपेरिडीन 1; बीपीई = बाइफॉस्फेट-ईडीटीए; जी = गुआनिन; जी 4 = गुआनिन चौगुनी; एसएस = एकल-फंसे हुए; डीएस = डबल-फंसे हुए; एफएएम = 5-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन; पीएए = पॉलीक्रिलामाइड; पेज = पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन; टीबीई = ट्रिस-बोरेट-ईडीटीए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: जी 4-टीबीए, एसएसटीबीए और डीएसटीबीए के सीडी स्पेक्ट्रा। तीन अलग-अलग संरचनाओं की उचित तह के बाद, सीडी स्पेक्ट्रा 25 डिग्री सेल्सियस पर दर्ज किया गया था। डीएसटीबीए का सीडी स्पेक्ट्रम, ~ 260-280 एनएम पर सकारात्मक लंबी तरंग दैर्ध्य बैंड और ~ 245 एनएम16 पर एक नकारात्मक बैंड की विशेषता है, डीएनए हेलिक्स के बी-फॉर्म के अनुरूप है। एसएसटीबीए की तुलना में, जिसे के + आयनों की अनुपस्थिति में खराब संरचित पाया गया था, जी 4-टीबीए के + आयनों की उपस्थिति में एक विरोधी-समानांतर जी 4 में फोल्ड हो जाता है, जो 260 एनएम पर एक नकारात्मक बैंड और 290 एनएम15 पर एक सकारात्मक बैंड की विशेषता है। संक्षेप: टीबीए = थ्रोम्बिन-बाइंडिंग एपटामर; बी-सीईपी 1 = बीआईएस -3-क्लोरोपिपेरिडीन 1; बीपीई = बाइफॉस्फेट-ईडीटीए; जी = गुआनिन; जी 4 = गुआनिन चौगुनी; एसएस = एकल-फंसे हुए; डीएस = डबल-स्ट्रैंडेड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जी-चौगुनी न्यूक्लिक एसिड माध्यमिक संरचनाएं हैं जो आमतौर पर गुआनिन युक्त डीएनए अनुक्रमों के भीतर मुड़ती हैं, और आनुवंशिक नियंत्रण और बीमारियों के साथ उनके संबंध के कारण महत्वपूर्ण शोध लक्ष्य हैं। बी-सीईपी द्वारा रासायनिक मानचित्रण डीएनए जी 4 के लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी प्रोटोकॉल है, जिसका उपयोग शारीरिक नमक स्थितियों के तहत जी-टेट्राड्स के गठन में शामिल गुआनिन ठिकानों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली रासायनिक जांच बी-सीईपी 1 (चित्रा 2 ए) है, जो विशेष रूप से ग्वानिन न्यूक्लियोबेस के एन7 के साथ प्रतिक्रिया करके, जी-चौगुनी टेट्राड्स के गठन में शामिल गुआनिन और गुआनिन के बीच भेदभाव कर सकती है जो इस तरह की व्यवस्था में शामिल नहीं हैं। वास्तव में, जी-टेट्राड्स (चित्रा 1) में गुआनिन के बीच हूगस्टीन हाइड्रोजन इंटरैक्शन जांच के साथ प्रतिक्रिया को खराब करता है। जांच प्रतिक्रियाओं के उत्पादों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन पेज (चित्रा 2 बी) द्वारा हल किया जाता है, जो डीएनए अनुक्रमों के भीतर अल्काइलेशन जोड़ों और दरार साइटों का पता लगाने के लिए अत्यधिक उपयोग की जाने वाली एक प्रयोगशाला-सुलभ प्रक्रिया है। इसके अलावा, फ्लोरोफोरे के साथ लेबल किए गए डीएनए अनुक्रम का उपयोग उपयोगकर्ताओं को सुरक्षित परिस्थितियों में प्रयोग करने की अनुमति देता है, रेडियोधर्मी रूप से लेबल किए गए न्यूक्लिक एसिड और इंटरकेलेटर के साथ पारंपरिक धुंधला कदम से बचता है।

बी-सीईपी 1 जांच ठोस रूप में और गैर-जलीय स्टॉक समाधान में बहुत स्थिर है, और जांच प्रतिक्रिया करते समय केवल कुछ समस्याएं हो सकती हैं। प्रोटोकॉल में कमियों से बचने के लिए, प्रतिस्पर्धी प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए जांच समाधानों में अवांछित न्यूक्लियोफाइल की उपस्थिति से बचना बहुत महत्वपूर्ण है जो डीएनए के साथ जोड़ बनाने के लिए उपलब्ध सक्रिय जांच के टिटर को कम कर सकते हैं। जैसा कि सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले बफर में ट्रिस बेस होता है, हम पाठक को याद दिलाते हैं कि इसका न्यूक्लियोफिलिक प्राथमिक अमाइन डीएनए सब्सट्रेट10 के गुआनिन की प्रतिक्रिया शीलता से प्रतिस्पर्धा करने वाले जांच इलेक्ट्रोफिलिक केंद्र के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, जैसा कि बी-सीईपी 1 के लिए चित्रा 3 में दिखाया गया है। यह फॉस्फेट बफर में जांच प्रतिक्रियाओं को करने का तर्क है, जैसा कि प्रोटोकॉल में विस्तृत है। पानी7 के साथ प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए, हम यह भी सलाह देते हैं कि बी-सीईपी 1 के सभी कमजोर पड़ने ताजा तैयार किए जाते हैं और तुरंत न्यूक्लिक एसिड सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया करते हैं।

यहां वर्णित बी-सीईपी द्वारा रासायनिक मानचित्रण डाइमिथाइल सल्फेट (डीएमएस) पदचिह्न प्रोटोकॉल का एक सुविधाजनक विकल्प है, जो जी 4 एस16 के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए मुख्यधारा परख का प्रतिनिधित्व करता है। दो प्रोटोकॉल मूल रूप से एक ही जानकारी देते हैं, अर्थात् जी 4 संरचना का गठन और जी 4 रचना की परवाह किए बिना जी 4 में शामिल गुआनिन की पहचान। हालांकि, बी-सीईपी के साथ रासायनिक मानचित्रण में डीएमएस पदचिह्न के संबंध में एक महत्वपूर्ण लाभ है- प्रोटोकॉल की सादगी। जांच प्रतिक्रियाओं के बाद, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता नहीं है, जबकि डीएमएस पदचिह्न को जांच के साथ प्रतिक्रिया के बाद गर्म पिपेरिडीन द्वारा बाद में दरार की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है अतिरिक्त नमूना शुद्धिकरण और बफर एक्सचेंज16। बी-सीईपी के साथ प्रोटोकॉल में चरणों की संख्या में कमी का अर्थ है प्रारंभिक डीएनए सब्सट्रेट की छोटी मात्रा का उपयोग। अंत में, बी-सीईपी द्वारा रासायनिक मानचित्रण, जिसे यहां टीबीए अनुक्रम के साथ अवधारणा के प्रमाण के रूप में वर्णित किया गया है, किसी भी अन्य संभावित जी-चौगुनी बनाने वाले अनुक्रम पर लागू होने वाले नए प्रयोगों को जन्म देगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम फार्मास्युटिकल और फार्माकोलॉजिकल साइंसेज विभाग, पडोवा विश्वविद्यालय (पीआरआईडीजे -BIRD2019) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

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References

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जैव रसायन अंक 195
<em>इन विट्रो</em> <em>"बीआईएस</em> -3-क्लोरोपिपेरिडिन द्वारा जी-चौगुनी डीएनए संरचनाओं का रासायनिक मानचित्रण"।
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Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

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