Summary
Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP'ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP'ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.
Abstract
G-dörtlüleri (G4'ler), gen ekspresyonu ve hastalıklarda önemli bir rol oynayan ve önemli terapötik hedefleri temsil eden, biyolojik olarak ilgili, kanonik olmayan DNA yapılarıdır. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler (PQS'ler) içinde DNA'nın in vitro karakterizasyonu için erişilebilir yöntemler gereklidir. B-CeP'ler, nükleik asitlerin yüksek dereceli yapısının araştırılması için yararlı kimyasal problar olduğu kanıtlanmış bir alkilleyici ajan sınıfıdır. Bu makale, guaninlerin N7'si ile B-CeP'lerin spesifik reaktivitesinden yararlanan yeni bir kimyasal haritalama testini ve ardından alkillenmiş Gs'de doğrudan iplik bölünmesini açıklamaktadır.
Yani, G4 kıvrımlarını katlanmamış DNA formlarından ayırt etmek için, G4 düzenlemesini üstlenebilen 15-mer'lik bir DNA olan trombin bağlayıcı aptameri (TBA) araştırmak için B-CeP 1'i kullanıyoruz. B-CeP'ye yanıt veren guaninlerin B-CeP 1 ile reaksiyonu, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülebilen ürünler verir. B-CeP'leri kullanarak haritalama, G-dörtlü oluşturan DNA dizilerinin in vitro karakterizasyonu için basit ve güçlü bir araçtır ve G-tetradların oluşumunda yer alan guaninlerin kesin konumunu sağlar.
Introduction
Tipik Watson-Crick çift sarmalına ek olarak, nükleik asitler, guanin açısından zengin dizileri nedeniyle alternatif G-dörtlü (G4) formu gibi çeşitli ikincil yapıları benimseyebilir. G4 yapısı, dört guaninin Hoogsteen hidrojen bağları yoluyla etkileşime girdiği G-tetradlar adı verilen düzlemsel tetramerlerin oluşumuna dayanır. G-tetradlar, guanin çekirdeğinin merkezinde koordine edilen monovalent katyonlarla istiflenir ve daha da stabilize edilir (Şekil 1)1.
Şekil 1: G-dörtlü yapısının şematik gösterimi. (A) Bir G-tetradının şematik gösterimi. Düzlemsel dizi, Hoogsteen baz eşleşmesi ve merkezi bir katyon (M+) ile stabilize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
En az iki ardışık guanin nükleotidinin dört veya daha fazla çalışmasına sahip diziler, G-dörtlü yapılarda katlanabilen potansiyel G-dörtlü oluşturan dizilerdir (PQS'ler). PQS'ler, telomerler, gen promotörleri, ribozomal DNA ve rekombinasyon bölgeleri gibi birçok farklı hücresel bağlamda bulunur ve birçok biyolojik sürecin düzenlenmesinde rol oynar2. Bu nedenle, şu anda esas olarak hesaplama araçları aracılığıyla gerçekleştirilen insan genomundaki G4'lerin tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması, biyolojik olarak ilgili bir konudur3. Hesaplamalı tahminleri desteklemek veya öngörülemeyen G4 yapılarını tespit etmek için, bir DNA şablonundaki G4 oluşumunu tanımlamak için kimyasal haritalamaya dayalı erişilebilir bir yöntem burada gösterilmektedir ve G-tetrad yapısını oluşturan guaninlerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar.
Rapor edilen kimyasal haritalama testi, G4 yapılarının oluşumunu takiben bis-3-kloropiperidinlerin (B-CeP'ler) guaninlerle farklı reaktivitesinden yararlanır. Nükleofiller 4,5,6,7,8,9 ile yüksek reaktiviteleri nedeniyle, B-CeP'ler, guanin nükleotidlerinin10 N7konumu ile çok verimli bir şekilde reaksiyona girme kabiliyetine sahip nükleik asit-alkilleyici ajanlardır. Alkilasyonu, tek ve çift sarmallı DNA yapılarında depurinasyon ve iplik bölünmesi takip eder. Aksine, G4 düzenlemelerinde G-tetradların oluşumunda yer alan guaninler, guaninlerin N7konumu Hoogsteen hidrojen bağlarında rol oynadığından, B-CeP alkilasyonuna karşı geçirimsizdir. B-CeP'lerin bu spesifik reaktivitesi, yalnızca G4 yapılarının saptanmasına değil, aynı zamanda tetrad(lar)ı oluşturan guaninlerin tanımlanmasına da izin verir, çünkü bunlar, tek ve çift sarmallı DNA'daki guaninlere kıyasla alkilasyondan göreceli korumalarından çıkarılabilir.
Kimyasal haritalama protokolü burada, potasyum katyonları 11,12 varlığında G4 düzenlemesini üstlenebilen bir 15-mer DNA olan trombin bağlayıcı aptamerin (TBA) karakterizasyonu için bir prob olarak B-CeP 1 (Şekil 2A) kullanılarak rapor edilmiştir. TBA'nın G4 düzenlemesi (G4-TBA), tek sarmallı formda TBA (ssTBA) ve çift sarmallı yapıyı (dsTBA) oluşturmak için tamamlayıcı dizisine tavlanmış TBA olmak üzere iki kontrol ile doğrudan karşılaştırılır (Tablo 1). Sondalama reaksiyonlarının ürünleri, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülür. Jel üzerinde görselleştirme, TBA oligonükleotidinin 3' ucunda bir florofor ile konjugasyonu ile sağlanır (Tablo 1). Bu protokol, TBA'nın farklı konformasyonlarında (G4 ve kontroller) nasıl katlanacağını ve B-CeP'ler ve ardından PAGE ile sondalama reaksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nükleik asit ve kimyasal prob hazırlama
- Nükleik asitler
NOT: "TBA" olarak adlandırılan oligonükleotid, jel üzerinde görselleştirmeyi sağlamak için florofor 5-karboksifloresein (FAM) tarafından 3'-ucunda etiketlenen 15-mer DNA dizisi 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'dür. Etiketlenmemiş oligonükleotid "cTBA", DNA tamamlayıcı dizisi 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'dür. TBA ve cTBA, Tablo 1'de gösterildiği gibi üç farklı yapıyı elde etmek için kullanılır.- Steril tek kullanımlık malzemeler elde etmek ve kontaminasyonu önlemek için otoklav uçları ve 0,5 mL tüpler.
- Her oligonükleotidi ultra saf suda 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona çözündüren stok çözeltileri hazırlayın. Üretici tarafından sağlanan 260 nm'de sönme katsayısını kullanarak ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrofotometre ile tam oligonükleotid konsantrasyonunu belirleyin.
NOT: Sönme katsayıları: TBA ve cTBA için sırasıyla 164.300 M-1 cm-1 ve 138.600 M-1 cm-1 kullanılmıştır. - TBA ve cTBA stok çözeltilerini -20 °C'de saklayın (bu koşullarda aylarca).
- Bileşik B-CeP 1
NOT: B-CeP 1 bileşiği, daha önce bildirildiği gibisentezlenir 6.- B-CeP 1 stok çözeltisini ~10 mM'de hazırlayın. Çeker ocakta bulunan analitik bir terazi kullanarak ~1 mg liyofilize bileşiği tartın ve %100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürün.
- Kullanılan gerçek bileşik miktarına ve DMSO'ya (d = 1.1 g/cm3) dayalı olarak tam bileşik konsantrasyonunu hesaplayın.
NOT: Bileşiği her zaman eldivenlerle kullanın (hem liyofilize edildiğinde hem de DMSO içinde çözündüğünde)13,14.
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan oligonükleotid yapıları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
2. Nükleik asit yapılarının katlanması
- Tamponların hazırlanması
- Bir BPE tampon çözeltisi (bifosfat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA], 5x: 2 mM NaH2PO4, 6mM Na2HPO 4, 1 mMNa2EDTA, pH 7.4) ve ultra saf suda 500 mM KCl'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltileri 0,22 μm gözenek boyutu filtrelerinden geçirin.
NOT: En iyi sonuçlar için taze hazırlanmış solüsyonlar kullanın. BPE tamponu 4 °C'de 15 güne kadar saklanabilir.
- Bir BPE tampon çözeltisi (bifosfat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA], 5x: 2 mM NaH2PO4, 6mM Na2HPO 4, 1 mMNa2EDTA, pH 7.4) ve ultra saf suda 500 mM KCl'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltileri 0,22 μm gözenek boyutu filtrelerinden geçirin.
- G4-TBA, ssTBA ve dsTBA numunelerinin ısıyla yeniden katlama prosedürü ile katlanması
NOT: G4 yapısını (G4-TBA) katlamak için potasyum katyonları gereklidir. Kontrollerin katlama çözeltisine potasyum katyonları eklemeyin ssTBA ve dsTBA.- 1x BPE ve 100 mM KCl'de 40 μL 4 μM G4-TBA çözeltisi hazırlayın. Tüpü 5 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtarak oligonükleotid G4-TBA çözeltisini denatüre edin ve TBA'nın G-dörtlülerine katlanmasını sağlamak için yavaşça oda sıcaklığına (RT) soğutun.
- 1x BPE'de 40 μL 4 μM ssTBA çözeltisi hazırlayın. TBA'yı tek sarmallı formda katlamak için adım 2.2.1'de belirtildiği gibi ısıyla yeniden katlama prosedürünü gerçekleştirin.
- 1x BPE'de eşmolar miktarlarda TBA ve cTBA'yı karıştırarak 40 μL'lik 4 μM dsTBA çözeltisi hazırlayın. TBA'nın tamamlayıcı dizisi cTBA'ya tavlanması ve TBA'nın çift sarmallı formunu oluşturması için yukarıda belirtildiği gibi ısıyla yeniden katlama prosedürünü gerçekleştirin (adım 2.2.1).
NOT: Her bir katlama çözeltisinin nihai hacmi, her bir numune için 5 μL 4 μM çözeltiye ihtiyaç duyulacağı göz önüne alındığında, sondalama reaksiyonları için numune sayısına dayanmaktadır. Pipetleme hatalarını önlemek için her çözeltiden biraz fazla hacim hazırlayın.
3. Reaksiyonların araştırılması
NOT: Sondalama reaksiyonları, ısıyla yeniden katlama prosedüründen hemen sonra yapılmalıdır.
- G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'nın katlama çözeltileri RT'ye soğuduğunda, kısa spinli bir santrifüjleme gerçekleştirin (RT'de 5-8 saniye boyunca 7.000 × g ) ve problama reaksiyonlarını başlatın.
- 21 adet boş 0,5 mL otoklavlanmış tüp hazırlayın. Bunları, Tablo 2'de bildirildiği gibi, laboratuvar numuneleri için rafta her biri yedi tüpten oluşan üç set halinde düzenleyin.
NOT: Her sütun seti, G4-TBA, ssTBA ve dsTBA olmak üzere üç farklı TBA katlama koşuluna karşılık gelir. Her sıra üç farklı inkübasyon süresine karşılık gelir. Kolon içindeki her hücre, son B-CeP 1 prob konsantrasyonuna karşılık gelir (Tablo 2). Tüpleri açıkça etiketlediğinizden emin olun. - Her tüpe 3 μL ultra saf su ekleyin.
- İlk setin her tüpüne 5 μL katlanmış G4-TBA ekleyin (adım 3.2). İkinci setin her tüpüne 5 μL katlanmış ssTBA ekleyin. Üçüncü setin her tüpüne 5 μL katlanmış dsTBA ekleyin.
- B-CeP 1 stok çözeltisini ultra saf suda 250 μM ve 25 μM'ye seyreltin.
NOT: B-CEP 1 kimyasal probunun dilüsyonları taze olarak hazırlanmalı ve su ile rekabet eden reaksiyonlardan kaçınmak için DNA substratı ile hemen reaksiyona sokulmalıdır. - Numunelere 2 μL uygun B-CeP 1 seyreltmesi (25 μM ve 250 μM) ekleyin. Bileşiğin yokluğunda farklı katlanmış TBA'ların analizi için bileşiği üç kontrol numunesinde (C) ultra saf su ile değiştirin. Tüm numuneleri 37 °C'de inkübe edin.
- 1 saat, 4 saat ve 15 saat inkübasyondan sonra, tüpleri bir sonraki adıma kadar -20 °C'ye yerleştirerek reaksiyonu durdurun.
NOT: Numuneler bu koşullarda birkaç gün saklanabilir. - Numuneleri vakumlu santrifüjde kurutun.
NOT: Kurutulmuş numuneler, PAGE analizine geçmeden önce -20 °C'de haftalarca saklanabilir.
Tablo 2: Sondalama reaksiyonları için numuneler (yapılar, prob konsantrasyonları ve inkübasyon süresi). Her sütun kümesi, üç farklı TBA katlama koşuluna (G4-TBA, ssTBA ve dsTBA) karşılık gelir. Her sıra üç farklı inkübasyon süresine (1, 4, 15 saat) karşılık gelir. Kolon içindeki her hücre, son B-CeP 1 prob konsantrasyonuna (5 veya 50 μM) karşılık gelir. Her set için kontrol (C), bileşik yokluğunda daha uzun süre (15 saat) inkübe edilen farklı katlanmış TBA'ların bir örneğine karşılık gelir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
4. Yüksek çözünürlüklü SAYFA
- Denatüre edici poliakrilamid çözeltisinin hazırlanması
NOT: Önceden 500 mL %20 denatüre edici poliakrilamid jel çözeltisi hazırlayın. Her deney için bu çözeltinin yaklaşık 80 mL'si kullanılacaktır. Çözeltiyi RT'de saklamak için kehribar rengi bir cam şişe kullanın veya bir cam şişeyi alüminyum folyo ile kapatın.
DİKKAT: Poliakrilamid nörotoksiktir. Jel hazırlama ve dökmenin tüm aşamalarında eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Polimerize akrilamid'i kontamine malzemeler için uygun bir kutuya atın.- 1 L'lik bir beherde 210 g üre tartın. 250 mL %40 akrilamid/bisakrilamid (19/1) çözeltisi ve 50 mL 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM borat, 20 mM EDTA, pH 8) ekleyin.
- Beheri bir karıştırma plakasına yerleştirin ve çözeltiyi bir karıştırma çubuğuyla karıştırın. Sıçramayı ve kirlenmeyi önlemek için karıştırma sırasında kabı alüminyum folyo ile örtün.
- Üre tamamen eriyene ve çözelti berraklaşana kadar çözeltiyi karıştırın.
NOT: Bu adım birkaç saat sürebilir. Ürenin çözünmesini teşvik etmek için, istenen nihai hacmin ötesine geçmeden küçük bir su alikotu ekleyin. - Karıştırma çubuğunu çıkarın. Çözeltiyi bir silindire dökün ve 500 mL'lik kesin bir nihai hacme kadar su ekleyin.
- Jel aparatının kurulması
- İki plakayı (biri çentikli diğeri çentiksiz) %70 etanol ile temizleyin, kurumasını bekleyin ve ardından plakalara bir dimetildiklorosilan çözeltisi uygulayın.
NOT: Jel sandviç parçalara ayrıldığında jelin plakalardan birinden salınmasına yardımcı olmasına rağmen silanizasyon atlanabilir.
DİKKAT: Silanizasyon solüsyonunu eldivenlerle tutun ve bu solüsyonla plaka işlemini çeker ocakta gerçekleştirin. - 0.4 mm'lik ara parçaları uzun plakanın uzun kenarları boyunca yerleştirin, kısa plakayı diğerinin üzerine yerleştirin ve iki plakayı alttan hizalayın.
- Üst kısım hariç tüm kenarlar boyunca birden fazla kağıt bant katmanı yerleştirin.
- Döküm sırasında sızıntıları önlemek için, jelin dibine ek bir bant tabakası ekleyin.
- Cam sandviçin kenarlarını temiz kelepçelerle klipsleyin.amptedarikçinin talimatlarını izleyerek (farklı tedarikçiler biraz farklı aparatlar, sandviç kelepçeler ve contalar kullanır).
- İki plakayı (biri çentikli diğeri çentiksiz) %70 etanol ile temizleyin, kurumasını bekleyin ve ardından plakalara bir dimetildiklorosilan çözeltisi uygulayın.
- Jeli dökmek
NOT: Poliakrilamid polimerizasyonu sıcaklığa duyarlı olduğu için jeli RT'de (25 °C) dökün.- Bir behere 80 mL önceden hazırlanmış denatüre edici poliakrilamid çözeltisi (adım 4.1), 450 μL %10 m/V amonyum persülfat (APS) çözeltisi ve 45 μL tetrametiletilendiamin (TEMED) kullanımdan hemen önce dökün.
- Çözeltiyi karıştırın ve 50 mL'lik bir şırınga kullanarak cam plakaların arasına hızla dökün. Kabarcıkları önleyerek tarağı cam plakalar arasına istenen sayıda kuyucukla sokun. Gerekirse sandviçi tamamen doldurmak için jel solüsyonu ekleyin. Aşağı bastırmak ve kuyuların eşit dağılımını sağlamak için tarağın üzerine dört kelepçe yerleştirin.
- Jelin en az 45 dakika polimerize olmasına izin verin.
- Jeli çalıştırmak
- Polimerizasyondan sonra, tüm kelepçeleri ve kağıt bant katmanlarını çıkarın. Tarağı yavaşça çıkarın ve kuyuları damıtılmış suyla iyice durulayın.
- Jel sandviçi dikey jel elektroforez aparatına doğru şekilde yerleştirmek için ilgili tedarikçinin talimatlarını izleyin.
- Deiyonize suda TBE çalışma tamponunu (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8) hazırlayın ve hem üst hem de alt rezervuarları tamponla doldurun.
- 50 W'ta en az 30 dakika boyunca jel elektroforezinin ön çalışmasını gerçekleştirerek plakaları ısıtın.
- Ultra saf suda denatüre edici jel yükleme tamponu (DGLB: 1 M Tris-HCl, %80 formamid, %50 gliserol, %0.05 bromofenol mavisi) hazırlayın.
NOT: GLB, oligonükleotid numunelerinin jel sistemine hareketinin izlenmesine yardımcı olur ve numunelerin jelin kuyucuklarına yüklenmesine izin verir. Denatüre edici ajan formamidin varlığı, DNA türlerinin denatüre olmayan bir PAGE'de bile boyutlarına göre ayrılmasına izin verir. - Kurutulmuş numuneleri (adım 3.8'deki numuneler) 5 μL DGLB içinde yeniden süspanse edin.
- Numuneleri yüklemeden önce, üreyi kuyulardan çıkarmak için küçük bir şırınga ve üst tampon odasındaki TBE tamponunu kullanarak kuyucukları temizleyin.
NOT: Kuyuları doğru bir şekilde temizlemek için bu adımı birkaç kez tekrarlayın, böylece yorumlanması zor bantlardan kaçının. - Numuneleri temiz kuyulara yükleyin ve yükleme sırasını not edin.
- Jel elektroforezini 50 W'ta 2 saat veya en azından bromofenol mavisi boya jelin 2/3'ünü akıtana kadar çalıştırın.
- Jelin görüntülenmesi
- Elektroforezden sonra güç kaynağını kapatın, cam sandviçi çıkarın ve bardakları temizleyin.
- Bir jel görüntüleyici kullanarak tarayarak FAM etiketli oligonükleotid bantlarının floresansını tespit edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2, üç farklı yapıda katlanmış TBA oligonükleotidi üzerinde B-CeP 1 ile protokolde açıklandığı gibi, gerçekleştirilen bir kimyasal haritalama testinin temsili bir sonucunu göstermektedir. TBA'nın G-dörtlü düzenlemesi (G4-TBA), oligonükleotidin BPE'de ve K+ katyon varlığında katlanmasıyla elde edilirken, aynı TBA dizisinin (ssTBA) tek sarmallı formu potasyum yokluğunda katlandı. Çift sarmallı yapı (dsTBA), TBA'nın BPE tamponundaki tamamlayıcı dizisine tavlanmasıyla hazırlandı. 5 veya 50 μM'lik bir nihai B-CeP 1 konsantrasyonu, 2 μM G4-TBA numunesi (Şekil 2B'nin sol şeritleri), ssTBA (Şekil 2B'nin merkezi şeritleri) ve dsTBA (Şekil 2B'nin sağ şeritleri) ile 1 saat, 4 saat ve 15 saat boyunca reaksiyona sokuldu. Ek kontroller, prob ile reaksiyona girmeyen DNA yapılarıdır. Üç farklı TBA kıvrımının dairesel dikroizm (CD) analizi, uygun yapılarını doğruladı (Ek Şekil S1). dsTBA'nın CD spektrumu aslında ~ 260-280 nm'de pozitif bir uzun dalga boyu bandı ve ~ 245 nm15'te negatif bir bant ile karakterize edildi ve tutarlı olarak B formunda bir DNA sarmalı ile karakterize edildi. ssTBA'nın K+ iyonlarının yokluğunda zayıf bir şekilde yapılandırıldığı bulunurken, G4-TBA, 260 nm'de negatif bir bant ve 290 nm'de pozitif bir bant ile karakterize edilen K+ iyonlarının varlığında anti-paralel bir G4'te katlanır15.
Şekil 2B'de rapor edilen yüksek çözünürlüklü PAGE sonuçları, B-CeP 1'in G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'ya karşı zamana ve konsantrasyona bağlı reaksiyonlarının kapsamlı bir görünümünü sağlar ve ssTBA ve dsTBA yapıları için gözlemlenenlere kıyasla G4-TBA için belirgin şekilde farklı bir alkilasyon modelini açıkça ortaya koymaktadır. İşlem görmemiş örneklerden (C) daha düşük hareketlilikle göç eden bantlar, DNA substrat alkilasyonu ile tutarlıdır. G4-TBA substratı durumunda, alkilasyon için mevcut olan sadece bir guaninin (G8) varlığına göre sadece bir alkilasyon eklentisi açıkça gözlenir (Şekil 2C'de guaninlerin numaralandırılması). Aksine, substrat ssTBA veya dsTBA olduğunda, tüm guaninler problanmak için serbest N7 pozisyonuna sahip olduğunda çoklu eklentiler ayırt edilir. Daha hızlı göç eden bantlar bunun yerine iplik bölünmesinin ürünlerine atfedilir. G4-TBA substratı durumunda, G-dörtlü tetradlarda yer alan guaninler (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15) alkilasyona karşı geçirimsizdir, oysa G8 alkilasyonun bir sonraki adımı olarak bölünmeden etkilenir. ssTBA ve dsTBA yapılarında, tüm guaninler, daha uzun inkübasyon sürelerinde giderek daha yoğun hale gelen, tespit edilen çok sayıda bantla gösterildiği gibi, bölünmeye karşı hassastır.
Bu protokol, G-dörtlü tetradların oluşumunda yer alan guaninler ile bu tür bir düzenlemeye dahil olmayan guaninler arasında ayrım yapılmasına izin verir, böylece G4-TBA yapısını aydınlatır (Şekil 2C).
Deneyin olası bir dezavantajı, reaksiyon ortamında istenmeyen nükleofillerin varlığıdır. Örneğin, reaksiyon tamponundaki tuzlardan türetilen nükleofiller, B-CeP'ler ile reaktivite için DNA ile rekabet eder ve bu da probun substrat ile verimsiz reaksiyonuna yol açar. Şekil 3, nükleofilik Tris bazını içeren Tris tamponunda gerçekleştirilen sondalama reaksiyonlarının sonuçlarını göstermektedir. B-CeP 1 (5 ve 50 μM), 1 saat, 4 saat, 15 saat ve 24 saat boyunca 2 μM G4-TBA (Şekil 3'ün sol şeritleri), ssTBA (Şekil 3'ün orta şeritleri) ve dsTBA (Şekil 3'ün sağ şeritleri) örnekleri ile reaksiyona sokulur. Bu koşullarda, probun her üç DNA substratına karşı reaktivitesi açıkça azalır. G4-TBA örnekleri için, iplik bölünmesini tespit etmeden sadece eklenti oluşumunu gözlemleyebiliriz. ssTBA ve dsTBA vakalarında, sadece 24 saat sonra, Şekil 2B'de 15 saatlik inkübasyondan sonra gözlemlenenle karşılaştırılabilir DNA parçalanmasıdır. B-CeP'lerin Tris ile istenmeyen rekabet reaktivitesi, nükleik asit yapısal bilgisinin eksikliğine yol açar.
Şekil 2: BPE tamponunda B-CeP 1 ile bir TBA G-dörtlü yapısının kimyasal haritalanması. (A) B-CEP 1'in kimyasal yapısı. (B) BPE tamponunda B-CeP 1 ve TBA arasındaki sondalama reaksiyonlarının zaman ve konsantrasyon bağımlılığı. TBA'nın alikotları, G-dörtlü düzenlemeyi (G4-TBA), tek sarmallı oligonükleotidi (ssTBA) elde etmek için üç farklı koşulda katlandı ve TBA, çift sarmallı yapıyı (dsTBA) oluşturmak için tamamlayıcı dizisine tavlandı. TBA oligonükleotidi, jel sistemi üzerinde görselleştirmeyi sağlamak için 3' ucunda bir florofor (FAM) ile etiketlendi. G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'nın alikotları (2 μM), BPE tamponunda 5 veya 50 μM nihai konsantrasyonda B-CeP 1 ile muamele edildi ve belirtilen süre boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Sondalama reaksiyonlarının sonucu, yüksek çözünürlüklü denatüre edici PAGE (%20 poliakrilamid [PAA], 7 M üre, 1x TBE) ile analiz edildi. "C", her TBA yapısının kontrol örneğini gösterir. (C) G4-TBA'nın G-dörtlü düzenlemesinin karikatürü ve TBA dizisindeki guaninlerin numaralandırılması. G4 yapısında yer almayan, dolayısıyla B-CeP 1 ile reaksiyona giren tek guanin kırmızı ile vurgulanmıştır. Yeşil yıldız, florofor FAM'ı temsil eder. Kısaltmalar: TBA = trombin bağlayıcı aptamer; B-CeP 1 = bis-3-kloropiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin dörtlüsü; ss = tek telli; ds = çift sarmallı; FAM = 5-karboksifloresein; PAA = poliakrilamid; SAYFA = poliakrilamid jel elektroforezi; TBE = Tris-borat-EDTA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tris tamponu varlığında verimsiz kimyasal haritalama. Tris tamponunda B-CeP1 ve TBA arasındaki sondalama reaksiyonlarının zaman ve konsantrasyon bağımlılığı. TBA'nın alikotları, G-dörtlü düzenlemeyi (G4-TBA), tek sarmallı oligonükleotidi (ssTBA) elde etmek için üç farklı koşulda katlandı ve TBA, çift sarmallı yapıyı (dsTBA) oluşturmak için tamamlayıcı dizisine tavlandı. TBA oligonükleotidi, jel sistemi üzerinde görselleştirmeyi sağlamak için 3' ucunda bir florofor (FAM) ile etiketlendi. G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'nın alikotları (2 μM), 10 mM Tris-HCl tamponunda 5 veya 50 μM nihai konsantrasyonda B-CeP 1 ile muamele edildi ve belirtilen süre boyunca 37 ° C'de inkübe edildi. Sondalama reaksiyonlarının sonucu, yüksek çözünürlüklü denatüre edici PAGE (%20 PAA, 7 M üre, 1x TBE) ile analiz edildi. "C", her TBA yapısının kontrol örneğini gösterir. Sondalama reaksiyonları sırasında tampon olarak kullanılan Tris'in nükleofilikliği, daha düşük sinyallere ve yapısal bilgi kaybına yol açar. Kısaltmalar: TBA = trombin bağlayıcı aptamer; B-CeP 1 = bis-3-kloropiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin dörtlüsü; ss = tek telli; ds = çift sarmallı; FAM = 5-karboksifloresein; PAA = poliakrilamid; SAYFA = poliakrilamid jel elektroforezi; TBE = Tris-borat-EDTA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'nın CD spektrumları. Üç farklı yapının uygun şekilde katlanmasından sonra, CD spektrumları 25 °C'de kaydedildi. ~260-280 nm'de pozitif uzun dalga boyu bantları ve ~245 nm16'da negatif bir bant ile karakterize edilen dsTBA'nın CD spektrumu, DNA sarmalının bir B-formu ile tutarlıdır. K+ iyonlarının yokluğunda zayıf bir şekilde yapılandırıldığı tespit edilen ssTBA ile karşılaştırıldığında, G4-TBA, K+ iyonlarının varlığında anti-paralel bir G4'te katlanır, 260 nm'de negatif bir bant ve 290 nm'de pozitif bir bant ile karakterize edilir15. Kısaltmalar: TBA = trombin bağlayıcı aptamer; B-CeP 1 = bis-3-kloropiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin dörtlüsü; ss = tek telli; ds = çift sarmallı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G-dörtlüleri, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde katlanan nükleik asit ikincil yapılarıdır ve genetik kontrol ve hastalıklarla ilişkileri nedeniyle önemli araştırma hedefleridir. B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, fizyolojik tuz koşulları altında G-tetradların oluşumunda rol oynayan guanin bazlarını tanımlamak için kullanılabilen DNA G4'lerin karakterizasyonu için yararlı bir protokoldür.
Bu protokolde kullanılan kimyasal prob, guanin nükleobazlarının N7'siile spesifik olarak reaksiyona girerek, G-dörtlü tetradların oluşumunda yer alan guaninler ile böyle bir düzenlemede yer almayan guaninler arasında ayrım yapabilen B-CeP 1'dir (Şekil 2A). Aslında, G-tetradlarındaki guaninler arasındaki Hoogsteen hidrojen etkileşimleri (Şekil 1) prob ile reaksiyonu bozar. Sondalama reaksiyonlarının ürünleri, DNA dizileri içindeki alkilasyon eklentilerini ve bölünme bölgelerini tespit etmek için yüksek oranda kullanılan, laboratuvarda erişilebilir bir prosedür olan yüksek çözünürlüklü PAGE (Şekil 2B) ile çözülür. Ayrıca, bir florofor ile etiketlenmiş bir DNA dizisinin kullanılması, kullanıcıların radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleik asitlerden ve interkalatörlerle geleneksel boyama adımından kaçınarak deneyi güvenli koşullarda gerçekleştirmelerine olanak tanır.
B-CeP 1 probu, katı formda ve susuz stok çözeltisinde çok kararlıdır ve problama reaksiyonu gerçekleştirilirken sadece birkaç sorun ortaya çıkabilir. Protokoldeki sakıncalardan kaçınmak için, DNA ile eklentiyi oluşturmak için mevcut olan aktif probun titresini azaltabilecek rakip reaksiyonlardan kaçınmak için sondalama çözeltilerinde istenmeyen nükleofillerin varlığından kaçınmak çok önemlidir. En yaygın olarak kullanılan tamponlar Tris bazı içerdiğinden, okuyucuya, nükleofilik birincil amininin, B-CeP 1 için Şekil 3'te gösterildiği gibi, DNA substratı10'un guaninlerinin reaktivitesiyle rekabet eden prob elektrofilik merkezi ile reaksiyona girebileceğini hatırlatırız. Bu, protokolde detaylandırıldığı gibi, sondalama reaksiyonlarını fosfat tamponunda gerçekleştirmenin mantığıdır. Su7 ile reaksiyonlardan kaçınmak için, B-CeP 1'in tüm dilüsyonlarının taze olarak hazırlanmasını ve nükleik asit substratı ile anında reaksiyona sokulmasını öneririz.
Burada açıklanan B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, G4s16'nın ilk karakterizasyonu için ana tahlili temsil eden dimetil sülfat (DMS) ayak izi protokolüne uygun bir alternatiftir. İki protokol temelde aynı bilgileri, yani G4 yapısının oluşumu ve G4 konformasyonundan bağımsız olarak G4'te yer alan guaninlerin tanımlanması gibi bilgileri verir. Bununla birlikte, B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, DMS ayak izi açısından önemli bir avantaja sahiptir - protokolün basitliği. Problama reaksiyonlarından sonra, burada açıklanan protokol ek adımlara ihtiyaç duymazken, DMS ayak izi, prob ile reaksiyondan sonra sıcak piperidin tarafından müteakip bölünmeye ihtiyaç duyar, bu da ek numune saflaştırma ve tampon değişimianlamına gelir 16. B-CeP'ler ile protokoldeki adım sayısındaki azalma, ilk DNA substratının daha küçük miktarlarının kullanılması anlamına gelir. Son olarak, burada bir kavram kanıtı olarak TBA dizisi ile açıklanan B-CeP'lerin kimyasal haritalaması, diğer herhangi bir potansiyel G-dörtlü oluşturan diziye uygulanabilir yeni deneylere yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Padova Üniversitesi Farmasötik ve Farmakolojik Bilimler Bölümü (PRIDJ-BIRD2019) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
