Summary
Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) הן בדיקות כימיות שימושיות לזיהוי ואפיון מבני G-quadruplex בתבניות DNA במבחנה. פרוטוקול זה מפרט את ההליך לביצוע תגובות חיטוט עם B-CePs ולפתרון תוצרי תגובה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה.
Abstract
G-quadruplexes (G4s) הם מבני DNA רלוונטיים ביולוגית, לא קנוניים, הממלאים תפקיד חשוב בביטוי גנים ובמחלות, ומייצגים מטרות טיפוליות משמעותיות. נדרשות שיטות נגישות לאפיון במבחנה של DNA בתוך רצפים פוטנציאליים יוצרי G-quadruplex (PQS). B-CePs הם סוג של סוכני אלקילציה שהוכחו כבדיקות כימיות שימושיות לחקר המבנה מסדר גבוה יותר של חומצות גרעין. מאמר זה מתאר בדיקת מיפוי כימית חדשה המנצלת את התגובתיות הספציפית של B-CePs עם N7 של גואנינים, ואחריה פיצול גדילים ישיר ב-Gs האלקילציה.
כלומר, כדי להבדיל בין קפלי G4 לבין צורות דנ"א פתוחות, אנו משתמשים ב-B-CeP 1 כדי לחקור את האפטמר קושר התרומבין (TBA), דנ"א של 15 מר המסוגל להניח את סידור G4. תגובה של גואנינים מגיבי B-CeP עם B-CeP 1 מניבה מוצרים שניתן לפתור על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה (PAGE) ברמת נוקלאוטיד יחיד על ידי איתור צינורות אלקילציה בודדים ומחשוף גדילי DNA בגואנינים האלקילטים. מיפוי באמצעות B-CePs הוא כלי פשוט ורב-עוצמה לאפיון במבחנה של רצפי DNA יוצרי G-quadruplex, המאפשר מיקום מדויק של גואנינים המעורבים בהיווצרות G-tetrads.
Introduction
בנוסף לסליל הכפול הטיפוסי של ווטסון-קריק, חומצות גרעין יכולות לאמץ מבנים משניים שונים, כגון צורת G-quadruplex (G4) החלופית, בשל הרצפים העשירים בגואנין. מבנה G4 מבוסס על היווצרות טטרמרים מישוריים, הנקראים G-tetrads, שבהם ארבעה גואנינים מתקשרים באמצעות קשרי מימן Hoogsteen. G-tetrads מוערמים ומיוצבים עוד יותר על-ידי קטיונים חד-ערכיים המתואמים במרכז ליבת הגואנין (איור 1)1.
איור 1: ייצוג סכמטי של מבנה G-quadruplex. (A) ייצוג סכמטי של G-tetrad. המערך המישורי מיוצב על ידי זיווג בסיס Hoogsteen ועל ידי קטיון מרכזי (M+). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
רצפים עם ארבע ריצות או יותר של לפחות שני נוקלאוטידים עוקבים של גואנין הם רצפים פוטנציאליים יוצרי G-quadruplex (PQSs) שיכולים להתקפל במבני G-quadruplex. PQS ממוקמים בהקשרים תאיים רבים ושונים, כגון בטלומרים, מקדמי גנים, דנ"א ריבוזומלי ואתרי רקומבינציה, והם מעורבים בוויסות תהליכים ביולוגיים רבים2. לפיכך, הזיהוי והאימות הניסיוני של G4s בגנום האנושי, המבוצע כיום בעיקר באמצעות כלים חישוביים, הוא נושא רלוונטי מבחינה ביולוגית3. על מנת לתמוך בתחזיות חישוביות או לזהות מבני G4 בלתי צפויים, מוצגת כאן שיטה נגישה המבוססת על מיפוי כימי לזיהוי היווצרות G4 בתבנית DNA, המאפשרת זיהוי מדויק של גואנינים המרכיבים את מבנה G-tetrad.
בדיקת המיפוי הכימי המדווחת מנצלת את התגובתיות השונה של bis-3-chloropiperidines (B-CePs) עם גואנינים לאחר היווצרות מבני G4. בשל תגובתם הגבוהה לנוקלאופילים 4,5,6,7,8,9, B-CePs הם חומרים אלקילטים של חומצות גרעין עם היכולת להגיב ביעילות רבה עם מיקום N 7 של נוקלאוטידים גואנין10. אלקילציה מלווה בדפורינציה ובפיצול גדילים במבני DNA חד-גדיליים ודו-גדילים. נהפוך הוא, הגואנינים המעורבים בהיווצרות הטטרדות G בסידורי G4 אטומים לאלקילציה B-CeP, שכן מיקום N7 של גואנינים מעורב בקשרי המימן של Hoogsteen. תגובתיות ספציפית זו של B-CePs מאפשרת לא רק זיהוי של מבני G4, אלא גם זיהוי של הגואנינים המרכיבים את הטטרדים, כפי שניתן להסיק מהם מההגנה היחסית שלהם מפני אלקילציה בהשוואה לגואנינים בדנ"א חד-גדילי ודו-גדילי.
פרוטוקול המיפוי הכימי מדווח כאן באמצעות B-CeP 1 (איור 2A) כבדיקה לאפיון של אפטמר קושר טרומבין (TBA), דנ"א של 15 מר המסוגל להניח את סידור G4 בנוכחות קטיונים של אשלגן11,12. סידור G4 של TBA (G4-TBA) מושווה ישירות לשני פקדים, כלומר TBA בצורה חד-גדילית (ssTBA) ו-TBA מחושל לרצף המשלים שלו כדי ליצור את המבנה הדו-גדילי (dsTBA) (טבלה 1). תוצרים של תגובות חיטוט נפתרים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד ברזולוציה גבוהה (PAGE) ברמת הנוקלאוטיד היחיד על ידי איתור צינורות אלקילציה בודדים ומחשוף גדילי DNA בגואנינים האלקילטים. הדמיה על הג'ל מתאפשרת על ידי הצמדה של אוליגונוקלאוטיד TBA עם פלואורופור בקצה 3 אינץ' שלו (טבלה 1). פרוטוקול זה מראה כיצד לקפל TBA בקונפורמציות השונות שלו (G4 ובקרות), וכיצד לבצע תגובות חיטוט עם B-CePs ואחריו PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חומצת גרעין והכנת בדיקה כימית
- חומצות גרעין
הערה: אוליגונוקלאוטיד בשם "TBA" הוא רצף DNA של 15 מר 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' המסומן בקצה 3' על ידי פלואורופור 5-carboxyfluorescein (FAM) כדי לאפשר הדמיה על הג'ל. האוליגונוקלאוטיד הבלתי מסומן "cTBA" הוא רצף הדנ"א המשלים שלו 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA ו-cTBA משמשים להשגת שלושת המבנים השונים, כפי שמוצג בטבלה 1.- קצוות אוטוקלאבה וצינורות 0.5 מ"ל על מנת להשיג כלים חד פעמיים סטריליים ולמנוע זיהום.
- הכן תמיסות מלאי המסיסות כל אוליגונוקלאוטיד במים טהורים במיוחד לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. קבע את ריכוז האוליגונוקלאוטיד המדויק באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול נראה (UV-Vis), באמצעות מקדם ההכחדה ב -260 ננומטר שסופק על ידי היצרן.
הערה: מקדמי הכחדה: 164,300 M-1 cm-1 ו- 138,600 M-1 cm-1 שימשו עבור TBA ו- cTBA, בהתאמה. - אחסן פתרונות מלאי TBA ו- cTBA בטמפרטורה של -20°C (למשך חודשים בתנאים אלה).
- תרכובת B-CeP 1
הערה: התרכובת B-CeP 1 מסונתזת כפי שדווח בעבר6.- הכן את תמיסת המניות B-CeP 1 ב~ 10 mM. שקלו ~1 מ"ג של התרכובת הליופילית באמצעות איזון אנליטי הממוקם במכסה אדים והמיסו אותו ב-100% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
- חשב את ריכוז התרכובת המדויק בהתבסס על כמות התרכובת בפועל ו- DMSO (d = 1.1 גרם / ס"מ3) בשימוש.
הערה: יש לטפל בתרכובת עם כפפות בכל עת (הן כאשר היא עוברת ליופיליה והן כאשר היא מומסת ב-DMSO)13,14.
טבלה 1: מבנים אוליגונוקלאוטידים המשמשים בפרוטוקול זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
2. קיפול מבנים של חומצות גרעין
- הכנת מאגרים
- הכינו תמיסת חיץ BPE (חומצה ביפוספט-אתילאנדיאמיןטטראצטית [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7.4) ותמיסה של 500 mM KCl במים טהורים במיוחד. סנן את התמיסות דרך מסננים בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש בפתרונות טריים. ניתן לאחסן מאגר BPE ב- 4 °C למשך עד 15 ימים.
- הכינו תמיסת חיץ BPE (חומצה ביפוספט-אתילאנדיאמיןטטראצטית [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4, 6 mM Na2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7.4) ותמיסה של 500 mM KCl במים טהורים במיוחד. סנן את התמיסות דרך מסננים בגודל נקבוביות של 0.22 מיקרומטר.
- קיפול דגימות G4-TBA, ssTBA ו-dsTBA בהליך קיפול מחדש בחום
הערה: קטיונים של אשלגן נחוצים כדי לקפל את מבנה G4 (G4-TBA). אין להוסיף קטיונים של אשלגן בתמיסת הקיפול של הפקדים ssTBA ו-dsTBA.- הכינו 40 μL של תמיסת 4 מיקרומטר של G4-TBA ב-1x BPE וב-100 mM KCl. נטרלו את תמיסת האוליגונוקלאוטיד G4-TBA על ידי חימום הצינור ל-95°C למשך 5 דקות וקררו אותו לאט לטמפרטורת החדר (RT) כדי לאפשר ל-TBA להתקפל ל-G-quadruplexes.
- הכן 40 μL של תמיסת 4 מיקרומטר של ssTBA ב- 1x BPE. בצע את הליך הקיפול מחדש בחום, כאמור בשלב 2.2.1, כדי לקפל TBA בצורתו החד-גדילית.
- הכן 40 μL של תמיסת 4 מיקרומטר של dsTBA על ידי ערבוב כמויות שוות ערך של TBA ו- cTBA ב- 1x BPE. בצע את הליך הקיפול מחדש בחום כפי שהוזכר לעיל (שלב 2.2.1) עבור TBA כדי לאחות את הרצף המשלים שלו cTBA וליצור את הצורה הדו-גדילית של TBA.
הערה: הנפח הסופי של כל תמיסת קיפול מבוסס על מספר הדגימות עבור תגובות החיטוט, בהתחשב בכך שיהיה צורך ב- 5 μL של תמיסת 4 מיקרומטר עבור כל דגימה. הכינו מעט נפח עודף מכל פתרון כדי למנוע טעויות צנרת.
3. חיטוט בתגובות
הערה: חיטוט בתגובות חייב להיעשות מיד לאחר הליך קיפול מחדש בחום.
- כאשר פתרונות הקיפול של G4-TBA, ssTBA ו- dsTBA התקררו ל- RT, בצע צנטריפוגה בעלת סיבוב קצר (7,000 × גרם עבור 5-8 שניות ב- RT) והתחל את תגובות החיטוט.
- הכן 21 ריקים 0.5 מ"ל צינורות autoclaved. ארגן אותם בשלוש קבוצות של שבעה צינורות כל אחד במדף עבור דגימות מעבדה, כפי שמדווח בטבלה 2.
הערה: כל ערכת עמודות תואמת לשלושת תנאי הקיפול השונים של TBA G4-TBA, ssTBA ו- dsTBA. כל שורה מתאימה לשלושה זמני דגירה שונים. כל תא בתוך העמודה מתאים לריכוז הסופי של B-CeP 1 (טבלה 2). הקפד לתייג בבירור את הצינורות. - הוסף 3 μL של מים טהורים במיוחד בכל צינור.
- הוסף 5 μL של G4-TBA מקופל בכל צינור של הקבוצה הראשונה (שלב 3.2). הוסף 5 μL של ssTBA מקופל בכל צינור של הקבוצה השנייה. הוסף 5 μL של dsTBA מקופל בכל צינור של הקבוצה השלישית.
- דללו את תמיסת המלאי B-CeP 1 ל-250 מיקרומטר ו-25 מיקרומטר במים טהורים במיוחד.
הערה: דילולים של הגשושית הכימית B-CeP 1 חייבים להיות מוכנים טריים ולהגיב מיד עם מצע ה- DNA כדי למנוע תגובות מתחרות עם מים. - הוסף 2 μL של דילול B-CeP 1 המתאים (25 μM ו 250 μM) לדגימות. החליפו את התרכובת במים אולטרה-טהורים בשלוש דגימות הבקרה (C) לצורך ניתוח ה-TBA המקופלים באופן שונה בהיעדר התרכובת. לדגור על כל הדגימות ב 37 ° C.
- לאחר 1 שעות, 4 שעות ו -15 שעות של דגירה, עצור את התגובה על ידי מיקום הצינורות ב -20 ° C עד לשלב הבא.
הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בתנאים אלה למשך מספר ימים. - יבשו את הדגימות בצנטריפוגת ואקום.
הערה: ניתן לאחסן את הדגימות המיובשות בטמפרטורה של -20°C למשך שבועות לפני שממשיכים בניתוח PAGE.
טבלה 2: דגימות לתגובות החיטוט (מבנים, ריכוזי בדיקה וזמן דגירה). כל ערכת עמודות מתאימה לשלושת תנאי הקיפול השונים של TBA (G4-TBA, ssTBA ו-dsTBA). כל שורה מתאימה לשלושה זמני דגירה שונים (1, 4, 15 שעות). כל תא בתוך העמודה מתאים לריכוז הסופי של בדיקת B-CeP 1 (5 או 50 מיקרומטר). הבקרה (C) עבור כל קבוצה מתאימה למדגם של TBA מקופל שונה מודגר במשך זמן רב יותר (15 שעות) בהיעדר תרכובת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
4. דף ברזולוציה גבוהה
- הכנת תמיסת פוליאקרילאמיד דנטורינג
הערה: הכינו מראש 500 מ"ל של 20% תמיסת ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורינג. כ-80 מ"ל של תמיסה זו ישמשו לכל ניסוי. השתמש בבקבוק זכוכית ענבר או כסה בקבוק זכוכית ברדיד אלומיניום כדי לאחסן את התמיסה ב- RT.
זהירות: פוליאקרילאמיד הוא נוירוטוקסי. בכל שלבי הכנת הג'ל והמזיגה, יש ללבוש כפפות ומעיל מעבדה. יש להשליך אקרילאמיד פולימרי בקופסה מתאימה לחומרים מזוהמים.- שוקלים 210 גרם של אוריאה בכוס 1 L. הוסף 250 מ"ל של תמיסת 40% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (19/1) ו-50 מ"ל של 10x TBE (890 מ"מ Tris-HCl, 890 מ"מ בוראט, 20 מ"מ EDTA, pH 8).
- מניחים את הכד על צלחת ערבוב ומערבבים את התמיסה עם מוט ערבוב. כסו את הכד ברדיד אלומיניום במהלך הערבוב למניעת התזה וזיהום.
- מערבבים את התמיסה עד שהאוריאה מומסת לחלוטין והתמיסה ברורה.
הערה: שלב זה עשוי להימשך שעות רבות. כדי לקדם את המסת אוריאה, להוסיף aliquot קטן של מים מבלי ללכת מעבר נפח הסופי הרצוי. - מוציאים את מוט הערבוב. יוצקים את התמיסה בגליל ומוסיפים מים לנפח סופי מדויק של 500 מ"ל.
- הקמת מנגנון ג'ל
- נקו שתי צלחות (אחת מחורצת ואחת לא מחורצת) עם 70% אתנול, תנו להן להתייבש, ולאחר מכן טפלו בצלחות בתמיסת דימתילדיכלורוסילן.
הערה: ניתן לדלג על סילניזציה, אם כי היא מסייעת לשחרור הג'ל מאחת הצלחות כאשר מפרקים את כריך הג'ל.
זהירות: יש לטפל בתמיסת הסילניזציה עם כפפות ולבצע את הטיפול בפלטה עם תמיסה זו במכסה אדים. - הניחו את המרווחים בקוטר 0.4 מ"מ לאורך הקצוות הארוכים של הלוח הארוך, הניחו את הלוח הקצר על גבי הלוח השני ויישרו את שני הלוחות בתחתית.
- הניחו שכבות מרובות של נייר דבק לאורך כל הקצוות, למעט החלק העליון.
- כדי למנוע דליפות במהלך היציקה, הוסף שכבה נוספת של סרט דבק לתחתית הג'ל.
- מהדקים את דפנות כריך הזכוכית במלחציים נקיים בהתאם להוראות הספק (ספקים שונים משתמשים במכשירים מעט שונים, מהדקים ואטמים לסנדוויץ').
- נקו שתי צלחות (אחת מחורצת ואחת לא מחורצת) עם 70% אתנול, תנו להן להתייבש, ולאחר מכן טפלו בצלחות בתמיסת דימתילדיכלורוסילן.
- יוצקים את הג'ל
הערה: יש לשפוך את הג'ל על RT (25°C), שכן פילמור פוליאקרילאמיד רגיש לטמפרטורה.- בכד, יש לשפוך 80 מ"ל של תמיסת פוליאקרילאמיד דנטורינג שהוכנה בעבר (שלב 4.1), 450 μL של תמיסת אמוניום פרסולפט (APS) 10% m/V ו-45 μL של טטרמתילאתילאנדיאמין (TEMED) מיד לפני השימוש.
- מערבבים את התמיסה ושופכים אותה במהירות בין לוחות הזכוכית באמצעות מזרק 50 מ"ל. הציגו את המסרק עם המספר הרצוי של בארות בין לוחות זכוכית, הימנעות בועות. מוסיפים תמיסת ג'ל כדי למלא את הכריך לחלוטין, במידת הצורך. הניחו ארבעה מלחציים על המסרק כדי ללחוץ כלפי מטה ולאפשר חלוקה אחידה של הבארות.
- תן לג'ל להתפלמר במשך 45 דקות לפחות.
- הפעלת הג'ל
- לאחר פילמור, להסיר את כל מלחציים ושכבות סרט נייר. מוציאים את המסרק לאט ושוטפים היטב את הבארות במים מזוקקים.
- בצע את ההוראות מהספק הספציפי כדי למקם כראוי את כריך הג'ל במנגנון אלקטרופורזה ג'ל אנכי.
- הכן את מאגר ההפעלה TBE (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM borate, 2 mM EDTA, pH 8) במים נטולי יונים, ומלא את המאגרים העליונים והתחתונים בחיץ.
- חממו את הצלחות על ידי ביצוע הפעלה מראש של אלקטרופורזה ג'ל במשך 30 דקות לפחות ב 50 W.
- הכינו חיץ העמסת ג'ל דנטורינג (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% פורממיד, 50% גליצרול, 0.05% ברומופנול כחול) במים טהורים במיוחד.
הערה: GLB מסייע לעקוב אחר תנועת דגימות האוליגונוקלאוטיד למערכת הג'ל ומאפשר לטעון את הדגימות לבארות הג'ל. נוכחותו של חומר הדנטורינג פורממיד מאפשרת למיני DNA להיפרד בהתאם לגודל, אפילו ב- PAGE שאינו דנטורינג. - השהה מחדש את הדגימות המיובשות (דגימות משלב 3.8) ב- 5 μL של DGLB.
- לפני טעינת הדגימות, נקו את הבארות באמצעות מזרק קטן וחיץ TBE בתא החיץ העליון כדי להסיר את האוריאה מהבארות.
הערה: חזור על שלב זה מספר פעמים כדי לנקות במדויק את הבארות, ובכך להימנע מרצועות קשות לפענוח. - טען את הדגימות לתוך בארות נקי ולרשום את סדר הטעינה.
- הפעל את אלקטרופורזה ג'ל במשך 2 שעות ב 50 W, או לפחות עד צבע כחול ברומופנול יש לרוץ 2/3 במורד הג'ל.
- הדמיה של הג'ל
- לאחר אלקטרופורזה, כבו את ספק הכוח, הסירו את כריך הזכוכית ונקו את הכוסות.
- זהה את הפלואורסצנטיות של פסי אוליגונוקלאוטידים המסומנים בתווית FAM על ידי סריקה באמצעות מכונת צילום ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מראה תוצאה מייצגת של בדיקת מיפוי כימי שבוצעה, כפי שמתואר בפרוטוקול עם B-CeP 1 על אוליגונוקלאוטיד TBA המקופל בשלושה מבנים שונים. סידור G-quadruplex של TBA (G4-TBA) התקבל על ידי קיפול האוליגונוקלאוטיד ב-BPE ובנוכחות קטיון K+, בעוד שהצורה החד-גדילית של אותו רצף TBA (ssTBA) קופלה בהיעדר אשלגן. המבנה הדו-גדילי (dsTBA) הוכן על ידי חישול TBA לרצף המשלים שלו במאגר BPE. ריכוז סופי של 5 או 50 מיקרומטר של B-CeP 1 הגיב עם דגימות של 2 מיקרומטר של G4-TBA (נתיבים שמאליים של איור 2B), ssTBA (נתיבים מרכזיים של איור 2B) ו-dsTBA (נתיבים ימניים של איור 2B) במשך שעה, 4 שעות ו-15 שעות. בקרות נוספות הן מבני הדנ"א שאינם מגיבים עם הגשוש. ניתוח דיכרואיזם מעגלי (CD) של שלושת קיפולי ה-TBA השונים אישר את המבנה הנכון שלהם (איור משלים S1). ספקטרום ה-CD של dsTBA אופיין למעשה בפס חיובי באורך גל ארוך ב~260-280 ננומטר ובפס שלילי ב~245 ננומטר15, באופן עקבי עם סליל הדנ"א בצורתו B. ה-ssTBA נמצא בעל מבנה גרוע בהיעדר יוני K+, בעוד ש-G4-TBA מתקפל ב-G4 אנטי-מקבילי בנוכחות יוני K+, המאופיין בפס שלילי ב-260 ננומטר ופס חיובי ב-290 ננומטר15.
תוצאות ה-PAGE ברזולוציה גבוהה שדווחו באיור 2B מספקות תצוגה מקיפה של התגובות תלויות הזמן והריכוז של B-CeP 1 כלפי G4-TBA, ssTBA ו-dsTBA, וחושפות בבירור תבנית אלקילציה שונה במידה ניכרת עבור G4-TBA בהשוואה למה שנצפה עבור מבני ssTBA ו-dsTBA. להקות הנודדות עם ניידות נמוכה יותר מהדגימות הלא מטופלות (C) עקביות עם אלקילציה של מצע DNA. במקרה של מצע G4-TBA, רק מצע אלקילציה אחד נצפה בבירור, בהתאם לנוכחות של גואנין אחד בלבד (G8) הזמין לאלקילציה (מספור הגואנינים באיור 2C). נהפוך הוא, מספר אדדוקטים נבדלים כאשר המצע הוא ssTBA או dsTBA, כאשר כל הגואנינים בעלי מיקום N7 חופשיים לבדיקה. במקום זאת, להקות הנודדות מהר יותר מיוחסות לתוצרים של מחשוף גדילים. במקרה של מצע G4-TBA, הגואנינים (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15) המעורבים בטטרדות G-quadruplex חסינים בפני אלקילציה, בעוד G8 מושפע ממחשוף כשלב הבא של אלקילציה. במבנים ssTBA ו-dsTBA, כל הגואנינים רגישים למחשוף, כפי שמודגם על ידי הפסים הרבים שזוהו, אשר הופכים בהדרגה אינטנסיביים יותר בזמני דגירה ארוכים יותר.
פרוטוקול זה מאפשר הבחנה בין הגואנינים המעורבים ביצירת טטרדות G-quadruplex לבין הגואנינים שאינם מעורבים בסידור כזה, ובכך מבהיר את מבנה G4-TBA (איור 2C).
חסרון אפשרי של הניסוי הוא נוכחות של נוקלאופילים לא רצויים בסביבת התגובה. לדוגמה, נוקלאופילים שמקורם במלחים במאגר התגובה מתחרים עם הדנ"א על התגובה עם B-CePs, מה שמוביל לתגובה לא יעילה של הגשושית עם המצע. איור 3 מראה את התוצאות של תגובות החיטוט שבוצעו במאגר Tris, אשר מכיל את בסיס Tris הנוקלאופילי. B-CeP 1 (5 ו-50 מיקרומטר) מגיב עם דגימות של 2 מיקרומטר של G4-TBA (הנתיבים השמאליים של איור 3), ssTBA (הנתיבים המרכזיים של איור 3) ו-dsTBA (הנתיבים הימניים של איור 3) במשך שעה, 4 שעות, 15 שעות ו-24 שעות. בתנאים אלה, תגובתיות הגשושית כלפי כל שלושת מצעי הדנ"א פוחתת בבירור. עבור דגימות G4-TBA, אנו יכולים לצפות רק בהיווצרות של adducts מבלי לזהות מחשוף גדיל. במקרים של ssTBA ו-dsTBA, רק לאחר 24 שעות ניתן להשוות את פיצול הדנ"א לזה שנצפה לאחר 15 שעות דגירה באיור 2B. תגובתיות התחרות הבלתי רצויה של B-CePs עם Tris מובילה לחוסר מידע מבני של חומצות גרעין.
איור 2: מיפוי כימי של מבנה TBA G-quadruplex על ידי B-CeP 1 במאגר BPE. (A) המבנה הכימי של B-CeP 1. (B) תלות בזמן ובריכוז של תגובות החיטוט בין B-CeP 1 ו-TBA במאגר BPE. אליציטוטים של TBA קופלו בשלושה תנאים שונים על מנת לקבל את סידור G-quadruplex (G4-TBA), אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי (ssTBA), ו-TBA חונך לרצף המשלים שלו כדי ליצור את המבנה הדו-גדילי (dsTBA). אוליגונוקלאוטיד TBA סומן בקצה 3' עם פלואורופור (FAM) כדי לאפשר הדמיה על מערכת הג'ל. Aliquots (2 μM) של G4-TBA, ssTBA ו- dsTBA טופלו ב- B-CeP 1 בריכוז סופי של 5 או 50 מיקרומטר במאגר BPE והודגרו ב- 37 ° C למשך הזמן שצוין. התוצאה של תגובות החיטוט נותחה על ידי PAGE דנטורינג ברזולוציה גבוהה (20% פוליאקרילאמיד [PAA], 7 M אוריאה, 1x TBE). "C" מציין את מדגם הבקרה של כל מבנה TBA. (C) קריקטורה של סידור G-quadruplex של G4-TBA ומספור הגואנינים ברצף TBA. הגואנין היחיד שלא היה מעורב במבנה G4, ובכך הגיב עם B-CeP 1, מסומן באדום. הכוכב הירוק מייצג את הפלואורופור FAM. קיצורים: TBA = אפטמר קושר טרומבין; B-CeP 1 = bis-3-chloropiperidine 1; BPE = biphosphate-EDTA; G = גואנין; G4 = גואנין מרובע; ss = חד-גדילי; ds = דו-גדילי; FAM = 5-carboxyfluorescein; PAA = פוליאקרילאמיד; PAGE = אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד; TBE = Tris-borate-EDTA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיפוי כימי לא יעיל בנוכחות חיץ טריס. תלות בזמן ובריכוז של תגובות החיטוט בין B-CeP 1 ו-TBA במאגר Tris. אליציטוטים של TBA קופלו בשלושה תנאים שונים על מנת לקבל את סידור G-quadruplex (G4-TBA), אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי (ssTBA), ו-TBA חונך לרצף המשלים שלו כדי ליצור את המבנה הדו-גדילי (dsTBA). אוליגונוקלאוטיד TBA סומן בקצה 3' עם פלואורופור (FAM) כדי לאפשר הדמיה על מערכת הג'ל. Aliquots (2 μM) של G4-TBA, ssTBA ו- dsTBA טופלו ב- B-CeP 1 בריכוז סופי של 5 או 50 מיקרומטר במאגר Tris-HCl של 10 mM והודגרו ב- 37 ° C למשך הזמן שצוין. התוצאה של תגובות החיטוט נותחה על ידי דף דנטורינג ברזולוציה גבוהה (20% PAA, 7 M אוריאה, 1x TBE). "C" מציין את מדגם הבקרה של כל מבנה TBA. הנוקלאופיליות של טריס המשמשת כחיץ במהלך תגובות החיטוט מובילה לאותות נמוכים יותר ולאובדן מידע מבני. קיצורים: TBA = אפטמר מחייב טרומבין; B-CeP 1 = bis-3-chloropiperidine 1; BPE = biphosphate-EDTA; G = גואנין; G4 = גואנין מרובע; ss = חד-גדילי; ds = דו-גדילי; FAM = 5-carboxyfluorescein; PAA = פוליאקרילאמיד; PAGE = אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד; TBE = Tris-borate-EDTA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: ספקטרום תקליטורים של G4-TBA, ssTBA ו-dsTBA. לאחר קיפול נכון של שלושת המבנים השונים, ספקטרום CD הוקלטו ב 25 ° C. ספקטרום ה-CD של dsTBA, המאופיין בפסי אורך גל ארוכים חיוביים ב~260-280 ננומטר ובפס שלילי ב~245 ננומטר16, תואם לצורת B של סליל הדנ"א. בהשוואה ל-ssTBA, שנמצא בעל מבנה גרוע בהיעדר יוני K+, G4-TBA מתקפל ב-G4 אנטי-מקבילי בנוכחות יוני K+, המאופיין בפס שלילי ב-260 ננומטר ופס חיובי ב-290 ננומטר15. קיצורים: TBA = אפטמר מחייב טרומבין; B-CeP 1 = bis-3-chloropiperidine 1; BPE = biphosphate-EDTA; G = גואנין; G4 = גואנין מרובע; ss = חד-גדילי; DS = דו-גדילי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G-quadruplexes הם מבנים משניים של חומצות גרעין המתקפלים בדרך כלל בתוך רצפי DNA עשירים בגואנין, והם מטרות מחקר משמעותיות בגלל הקשר שלהם עם בקרה גנטית ומחלות. מיפוי כימי על ידי B-CePs הוא פרוטוקול שימושי לאפיון DNA G4s, אשר יכול לשמש לזיהוי בסיסי גואנין המעורבים בהיווצרות G-tetrads בתנאי מלח פיזיולוגיים.
הגשושית הכימית שמשתמשים בה בפרוטוקול הזה היא B-CeP 1 (איור 2A), אשר, על-ידי תגובה ספציפית עם N7 של גרעיני גואנין, יכולה להבחין בין הגואנינים שמעורבים בהיווצרות הטטרדות G-quadruplex לבין הגואנינים שאינם מעורבים בסידור כזה. למעשה, אינטראקציות מימן Hoogsteen בין הגואנינים ב-G-tetrads (איור 1) פוגעות בתגובה עם הגשושית. תוצרים של תגובות חיטוט נפתרים על-ידי PAGE ברזולוציה גבוהה (איור 2B), הליך נגיש במעבדה המשמש מאוד לזיהוי תעלות אלקילציה ואתרי מחשוף בתוך רצפי דנ"א. יתר על כן, השימוש ברצף DNA המסומן בפלואורופור מאפשר למשתמשים לבצע את הניסוי בתנאים בטוחים, תוך הימנעות מחומצות גרעין המסומנות רדיואקטיבית ומשלב הצביעה הקונבנציונלי עם אינטרקלטורים.
הגשושית B-CeP 1 יציבה מאוד בצורה מוצקה ובתמיסת מלאי לא מימית, ורק בעיות מעטות יכולות להתרחש בעת ביצוע תגובת החיטוט. כדי למנוע חסרונות בפרוטוקול, חשוב מאוד להימנע מנוכחות של נוקלאופילים לא רצויים בתמיסות החיטוט כדי להימנע מתגובות מתחרות שעלולות להפחית את הטיטר של הגשושית הפעילה הזמינה ליצירת האדוקט עם הדנ"א. מאחר שרוב המאגרים הנפוצים מכילים בסיס טריס, אנו מזכירים לקורא שהאמין הראשוני הנוקלאופילי שלו יכול להגיב עם המרכז האלקטרופילי של הגשושית שמתחרה בתגובתיות של הגואנינים של מצע הדנ"א10, כפי שמוצג באיור 3 עבור B-CeP 1. זהו הרציונל לביצוע תגובות החיטוט בחיץ פוספטים, כמפורט בפרוטוקול. כדי למנוע תגובות עם מים7, אנו ממליצים גם שכל הדילולים של B-CeP 1 יהיו מוכנים טריים ויגיבו באופן מיידי עם מצע חומצת הגרעין.
המיפוי הכימי על ידי B-CePs המתואר כאן הוא חלופה נוחה לפרוטוקול טביעת הרגל של דימתיל סולפט (DMS), המייצג את הבדיקה המיינסטרימית לאפיון הראשוני של G4s16. שני הפרוטוקולים נותנים בעצם את אותו מידע, כלומר היווצרות מבנה G4 וזיהוי הגואנינים המעורבים ב- G4, ללא קשר לקונפורמציה G4. עם זאת, למיפוי הכימי עם B-CePs יש יתרון מרכזי ביחס לטביעת רגל DMS - פשטות הפרוטוקול. לאחר תגובות החיטוט, הפרוטוקול המתואר כאן אינו זקוק לצעדים נוספים, בעוד שטביעת רגל DMS זקוקה לפיצול לאחר מכן על ידי פיפרידין חם לאחר תגובה עם הגשוש, מה שמרמז על טיהור דגימה נוסף והחלפת חיץ16. הפחתת מספר השלבים בפרוטוקול עם B-CePs מרמזת על שימוש בכמויות קטנות יותר של מצע ה- DNA הראשוני. לבסוף, המיפוי הכימי על ידי B-CePs, המתואר כאן עם רצף TBA כהוכחת היתכנות, יוביל לניסויים חדשים החלים על כל רצף פוטנציאלי אחר ליצירת G-quadruplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעי התרופות והפרמקולוגיות, אוניברסיטת פדובה (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
