Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Kjemisk kartlegging av G-quadruplex DNA-strukturer av Bis-3-kloropiperidiner

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65373
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2Institute of Organic Chemistry, Justus Liebig University Giessen

Summary

Bis-3-kloropiperidiner (B-CePs) er nyttige kjemiske prober for å identifisere og karakterisere G-quadruplex strukturer i DNA-maler in vitro. Denne protokollen beskriver prosedyren for å utføre sonderingsreaksjoner med B-CePs og for å løse reaksjonsprodukter ved høyoppløselig polyakrylamidgelelektroforese.

Abstract

G-quadruplexes (G4s) er biologisk relevante, ikke-kanoniske DNA-strukturer som spiller en viktig rolle i genuttrykk og sykdommer, som representerer betydelige terapeutiske mål. Tilgjengelige metoder er nødvendige for in vitro-karakterisering av DNA innenfor potensielle G-quadruplex-formende sekvenser (PQS). B-CePs er en klasse av alkyleringsmidler som har vist seg å være nyttige kjemiske prober for undersøkelse av høyere ordens struktur av nukleinsyrer. Dette papiret beskriver en ny kjemisk kartleggingsanalyse som utnytter den spesifikke reaktiviteten til B-CePs med N7 av guaniner, etterfulgt av direkte strengspaltning ved de alkylerte Gs.

For å skille G4-folder fra utfoldede DNA-former, bruker vi B-CeP 1 til å undersøke trombinbindende aptamer (TBA), et 15-mer DNA som er i stand til å anta G4-arrangementet. Reaksjon av B-CeP-responderende guaniner med B-CeP 1 gir produkter som kan løses ved høyoppløselig polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) på et enkeltnukleotidnivå ved å lokalisere individuelle alkyleringsaddukter og DNA-strengspaltning ved de alkylerte guaninene. Kartlegging ved hjelp av B-CePs er et enkelt og kraftig verktøy for in vitro-karakterisering av G-quadruplex-dannende DNA-sekvenser, noe som muliggjør den nøyaktige plasseringen av guaniner involvert i dannelsen av G-tetrads.

Introduction

I tillegg til den typiske Watson-Crick dobbeltspiralen, kan nukleinsyrer vedta forskjellige sekundære strukturer, slik som den alternative G-quadruplex (G4) formen, på grunn av deres guaninrike sekvenser. G4-strukturen er basert på dannelsen av plane tetramere, kalt G-tetrads, hvor fire guaniner interagerer gjennom Hoogsteen hydrogenbindinger. G-tetrads stables og stabiliseres videre av monovalente kationer som koordineres i midten av guaninkjernen (figur 1)1.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av en G-quadruplex struktur. (A) Skjematisk fremstilling av en G-tetrad. Den plane matrisen stabiliseres av Hoogsteen-baseparing og av et sentralt kation (M+). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sekvenser med fire eller flere kjøringer av minst to påfølgende guaninnukleotider er potensielle G-quadruplex-dannende sekvenser (PQS) som kan foldes i G-quadruplex strukturer. PQS er lokalisert i mange forskjellige cellulære sammenhenger, for eksempel ved telomerer, genpromotorer, ribosomalt DNA og rekombinasjonssteder, og er involvert i reguleringen av mange biologiske prosesser2. Derfor er identifisering og eksperimentell validering av G4s i det menneskelige genom, som for tiden utføres primært gjennom beregningsverktøy, et biologisk relevant problem3. For å støtte beregningsmessige prediksjoner eller oppdage uforutsette G4-strukturer, vises en tilgjengelig metode basert på kjemisk kartlegging for å identifisere G4-dannelsen i en DNA-mal her, noe som muliggjør presis identifisering av guaniner som danner G-tetradstrukturen.

Den rapporterte kjemiske kartleggingsanalysen utnytter den forskjellige reaktiviteten til bis-3-kloropiperidiner (B-CePs) med guaniner etter dannelsen av G4-strukturer. På grunn av deres høye reaktivitet med nukleofiler 4,5,6,7,8,9, er B-CePs nukleinsyre-alkyleringsmidler med evnen til å reagere meget effektivt med N7-posisjonenav guaninnukleotider10. Alkylering etterfølges av rensing og strengspaltning i enkelt- og dobbeltstrengede DNA-konstruksjoner. Tvert imot er guaniner involvert i dannelsen av G-tetrads i G4-arrangementer ugjennomtrengelige for B-CeP-alkylering, da N7-posisjonen til guaniner er involvert i Hoogsteen-hydrogenbindingene. Denne spesifikke reaktiviteten til B-CePs tillater ikke bare deteksjon av G4-strukturer, men også identifisering av guaninene som danner tetrad (e), da de kan utledes fra deres relative beskyttelse mot alkylering sammenlignet med guaniner i enkelt- og dobbeltstrenget DNA.

Den kjemiske kartleggingsprotokollen er rapportert her ved hjelp av B-CeP 1 (figur 2A) som en sonde for karakterisering av trombinbindende aptamer (TBA), et 15-mer DNA som er i stand til å anta G4-arrangementet i nærvær av kaliumkationer11,12. G4-arrangementet av TBA (G4-TBA) sammenlignes direkte med to kontroller, nemlig TBA i enkeltstrenget form (ssTBA) og TBA glødet til sin komplementære sekvens for å danne den dobbeltstrengede konstruksjonen (dsTBA) (tabell 1). Produkter av sonderingsreaksjoner løses ved høyoppløselig polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) på enkeltnukleotidnivå ved å lokalisere individuelle alkyleringsaddukter og DNA-strengspaltning ved de alkylerte guaninene. Visualisering på gelen muliggjøres ved konjugering av TBA-oligonukleotidet med en fluorofor i 3'-enden (tabell 1). Denne protokollen viser hvordan man bretter TBA i sine forskjellige konformasjoner (G4 og kontroller), og hvordan man utfører sonderingsreaksjoner med B-CePs etterfulgt av PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nukleinsyre og kjemisk sondeforberedelse

  1. Nukleinsyrer
    MERK: Oligonukleotidet kalt "TBA" er 15-mer DNA-sekvensen 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' merket ved 3'-enden av fluoroforen 5-karboksyfluorescein (FAM) for å muliggjøre visualisering på gelen. Det umerkede oligonukleotidet "cTBA" er dets DNA-komplementære sekvens 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA og cTBA er benyttet for å oppnå de tre ulike strukturene, som vist i tabell 1.
    1. Autoklavspisser og 0,5 ml rør for å oppnå sterile engangsartikler og unngå forurensning.
    2. Forbered stamløsninger som solubiliserer hvert oligonukleotid i ultrarent vann til en endelig konsentrasjon på 100 μM. Bestem den eksakte oligonukleotidkonsentrasjonen med et ultrafiolett synlig (UV-Vis) spektrofotometer ved bruk av ekstinksjonskoeffisienten ved 260 nm levert av produsenten.
      MERK: Ekstinksjonskoeffisienter: 164 300 M-1 cm-1 og 138 600 M-1 cm-1 ble brukt for henholdsvis TBA og cTBA.
    3. Oppbevar TBA og cTBA lagerløsninger ved -20 °C (i flere måneder under disse forholdene).
  2. Forbindelse B-CeP 1
    MERK: Forbindelsen B-CeP 1 er syntetisert som tidligere rapportert6.
    1. Forbered B-CeP 1-stamløsningen ved ~10 mM. Vei ~ 1 mg av den lyofiliserte forbindelsen ved hjelp av en analytisk balanse plassert i en avtrekkshette og oppløselig den i 100% dimetylsulfoksid (DMSO).
    2. Beregn den nøyaktige konsentrasjonen av forbindelser basert på den faktiske mengden forbindelse og DMSO (d = 1,1 g / cm3) som brukes.
      MERK: Håndter forbindelsen med hansker til enhver tid (både når lyofilisert og når den er oppløst i DMSO)13,14.

Tabell 1: Oligonukleotidstrukturer brukt i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

2. Folding av nukleinsyrekonstruksjoner

  1. Forberedelse av buffere
    1. Forbered en BPE-bufferløsning (bifosfat-etylendiamintetraeddiksyre [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4, 6mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7,4) og en oppløsning på 500 mM KCl i ultrarent vann. Filtrer løsningene gjennom 0,22 μm porestørrelsesfiltre.
      MERK: For best resultat, bruk nylagde løsninger. BPE-buffer kan oppbevares ved 4 °C i opptil 15 dager.
  2. Folding av G4-TBA-, ssTBA- og dsTBA-prøver ved varmefoldingsprosedyren
    MERK: Kaliumkationer er nødvendige for å brette G4-strukturen (G4-TBA). Ikke tilsett kaliumkationer i foldeløsningen til kontrollene ssTBA og dsTBA.
    1. Forbered 40 μL av en 4 μM-løsning av G4-TBA i 1x BPE og 100 mM KCl. Denaturer oligonukleotidet G4-TBA-løsningen ved å varme opp røret til 95 ° C i 5 minutter og avkjøl det sakte ned til romtemperatur (RT) for å la TBA brette seg i G-quadruplexes.
    2. Forbered 40 μL av en 4 μM løsning av ssTBA i 1x BPE. Utfør varmefoldingsprosedyren, som nevnt i trinn 2.2.1, for å brette TBA i sin enkeltstrengede form.
    3. Forbered 40 μL av en 4 μM-løsning av dsTBA ved å blande ekvimolære mengder TBA og cTBA i 1x BPE. Utfør varmefoldingsprosedyren som nevnt ovenfor (trinn 2.2.1) for TBA å gløde til sin komplementære sekvens cTBA og danne den dobbeltstrengede formen av TBA.
      MERK: Det endelige volumet av hver foldeløsning er basert på antall prøver for sonderingsreaksjonene, tatt i betraktning at 5 μL 4 μM oppløsning vil være nødvendig for hver prøve. Forbered litt overflødig volum av hver løsning for å unngå pipetteringsfeil.

3. Sonderende reaksjoner

MERK: Sonderingsreaksjoner må gjøres umiddelbart etter varmefoldingsprosedyren.

  1. Når foldeløsningene til G4-TBA, ssTBA og dsTBA er avkjølt til RT, utfør en sentrifugering med kort spinn (7000 × g i 5-8 s ved RT) og start sonderingsreaksjonene.
  2. Klargjør 21 tomme 0,5 ml autoklaverte rør. Organiser dem i tre sett med syv rør hver i stativet for laboratorieprøver, som rapportert i tabell 2.
    MERK: Hvert kolonnesett tilsvarer de tre forskjellige TBA-foldebetingelsene G4-TBA, ssTBA og dsTBA. Hver rad tilsvarer tre forskjellige inkubasjonstider. Hver celle i kolonnen tilsvarer den endelige B-CeP 1-probekonsentrasjonen (tabell 2). Sørg for å merke rørene tydelig.
  3. Tilsett 3 μL ultrarent vann i hvert rør.
  4. Tilsett 5 μL brettet G4-TBA i hvert rør i det første settet (trinn 3.2). Tilsett 5 μL brettet ssTBA i hvert rør i det andre settet. Tilsett 5 μL brettet dsTBA i hvert rør i det tredje settet.
  5. Fortynn B-CeP 1-stamløsningen til 250 μM og 25 μM i ultrarent vann.
    MERK: Fortynninger av den kjemiske sonden B-CeP 1 må tilberedes og umiddelbart reageres med DNA-substratet for å unngå konkurrerende reaksjoner med vann.
  6. Tilsett 2 μL av passende B-CeP 1-fortynning (25 μM og 250 μM) til prøvene. Erstatt forbindelsen med ultrarent vann i de tre kontrollprøvene (C) for analyse av de forskjellige foldede TBAene i fravær av forbindelsen. Inkuber alle prøvene ved 37 °C.
  7. Etter 1 time, 4 timer og 15 timer med inkubasjon, stopp reaksjonen ved å plassere rørene ved -20 ° C til neste trinn.
    MERK: Prøvene kan lagres under disse forholdene i et par dager.
  8. Tørk prøvene i en vakuumsentrifuge.
    MERK: De tørkede prøvene kan lagres ved -20 °C i flere uker før du fortsetter med PAGE-analysen.

Tabell 2: Prøver for sonderingsreaksjonene (strukturer, probekonsentrasjoner og inkubasjonstid). Hvert kolonnesett tilsvarer de tre forskjellige TBA-foldebetingelsene (G4-TBA, ssTBA og dsTBA). Hver rad tilsvarer tre forskjellige inkubasjonstider (1, 4, 15 timer). Hver celle i kolonnen tilsvarer den endelige B-CeP 1-sondekonsentrasjonen (5 eller 50 μM). Kontrollen (C) for hvert sett tilsvarer en prøve av de forskjellig brettede TBAene som inkuberes i lengre tid (15 timer) i fravær av forbindelse. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

4. SIDE med høy oppløsning

  1. Fremstilling av denaturerende polyakrylamidoppløsning
    NOTAT: Forbered på forhånd 500 ml 20% denaturerende polyakrylamidgeloppløsning. Rundt 80 ml av denne løsningen vil bli brukt til hvert eksperiment. Bruk en gulbrun glassflaske eller dekk en glassflaske med aluminiumsfolie for å lagre løsningen på RT.
    FORSIKTIG: Polyakrylamid er nevrotoksisk. Under alle trinn av gelforberedelse og helling, bruk hansker og laboratoriefrakk. Kast polymerisert akrylamid i en egnet boks for forurensede materialer.
    1. Vei 210 g urea i et 1 l beger. Tilsett 250 ml 40 % akrylamid/bisakrylamid (19/1) oppløsning og 50 ml 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM borat, 20 mM EDTA, pH 8).
    2. Legg begeret på en rørplate og bland løsningen med en omrørestang. Dekk begeret med aluminiumsfolie under blanding for å forhindre sprut og forurensning.
    3. Bland løsningen til urea er helt oppløst og oppløsningen er klar.
      MERK: Dette trinnet kan ta mange timer. For å fremme oppløsningen av urea, tilsett en liten aliquot av vann uten å gå utover ønsket sluttvolum.
    4. Fjern omrøringsstangen. Hell løsningen i en sylinder og tilsett vann til et nøyaktig sluttvolum på 500 ml.
  2. Oppsett av gelapparat
    1. Rengjør to plater (en hakket og en uhakket) med 70% etanol, la dem tørke, og behandle deretter platene med en dimetyldiklorsilanoppløsning.
      MERK: Silanisering kan hoppes over, selv om det hjelper frigjøringen av gelen fra en av platene når gelsandwichen tas fra hverandre.
      FORSIKTIG: Håndter silaniseringsløsningen med hansker og utfør platebehandlingen med denne løsningen i en avtrekkshette.
    2. Plasser 0,4 mm avstandsstykker langs langkantene på den lengre platen, plasser kortplaten oppå den andre, og juster de to platene nederst.
    3. Plasser flere lag med papirbånd langs alle kantene bortsett fra toppen.
    4. For å unngå lekkasjer under støping, legg til et ekstra lag tape på bunnen av gelen.
    5. Klips sidene av glasssandwichen med rene klemmer etter leverandørens instruksjoner (forskjellige leverandører bruker litt forskjellige apparater, sandwichklemmer og pakninger).
  3. Hell gelen
    MERK: Hell gelen ved RT (25 °C), siden polyakrylamidpolymerisasjon er temperaturfølsom.
    1. I et begerglass, hell 80 ml av den tidligere tilberedte denaturerende polyakrylamidoppløsningen (trinn 4.1), 450 μL av en 10% m / V ammoniumpersulfat (APS) løsning og 45 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) umiddelbart før bruk.
    2. Bland oppløsningen og hell den raskt ned mellom glassplatene ved hjelp av en 50 ml sprøyte. Introduser kammen med ønsket antall brønner mellom glassplatene, unngå bobler. Tilsett gelløsning for å fylle smørbrødet helt, om nødvendig. Plasser fire klemmer på kammen for å trykke ned og tillate jevn fordeling av brønnene.
    3. La gelen polymerisere i minst 45 min.
  4. Kjører gelen
    1. Etter polymerisasjonen, fjern alle klemmer og papirbåndlag. Fjern kammen sakte og skyll brønnene grundig med destillert vann.
    2. Følg instruksjonene fra den spesifikke leverandøren for å plassere gelsandwichen riktig i det vertikale gelelektroforeseapparatet.
    3. Forbered TBE løpende buffer (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8) i avionisert vann og fyll både topp- og bunnreservoarene med bufferen.
    4. Varm opp platene ved å utføre en pre-run av gelelektroforesen i minst 30 minutter ved 50 W.
    5. Forbered denatureringsgellastbuffer (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% formamid, 50% glyserol, 0,05% bromfenolblå) i ultrarent vann.
      MERK: GLB bidrar til å spore oligonukleotidprøvenes bevegelse inn i gelsystemet og gjør det mulig å laste prøvene inn i gelens brønner. Tilstedeværelsen av denatureringsmiddelet formamid tillater DNA-arter å skille etter størrelse, selv i en ikke-denaturerende SIDE.
    6. Resuspender de tørkede prøvene (prøver fra trinn 3.8) i 5 mikrol DGLB.
    7. Før prøvene legges inn, rengjør brønnene med en liten sprøyte og TBE-bufferen i det øvre bufferkammeret for å fjerne urea fra brønnene.
      MERK: Gjenta dette trinnet flere ganger for å rengjøre brønnene nøyaktig, og unngå dermed bånd som er vanskelige å tolke.
    8. Legg prøvene i de rene brønnene og noter rekkefølgen på lastingen.
    9. Kjør gelelektroforesen i 2 timer ved 50 W, eller i det minste til bromfenolblått fargestoff har kjørt 2/3 ned i gelen.
  5. Avbildning av gelen
    1. Etter elektroforese, slå av strømforsyningen, fjern glasssandwichen og rengjør brillene.
    2. Oppdag fluorescensen av FAM-merkede oligonukleotidbånd ved å skanne ved hjelp av et gelbildeapparat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser et representativt resultat av utført kjemisk kartleggingsanalyse, som beskrevet i protokollen med B-CeP 1 på TBA-oligonukleotidet foldet i tre forskjellige strukturer. G-quadruplex-arrangementet av TBA (G4-TBA) ble oppnådd ved å brette oligonukleotidet i BPE og i nærvær av K + -kationen, mens den enkeltstrengede formen av den samme TBA-sekvensen (ssTBA) ble foldet i fravær av kalium. Den dobbeltstrengede konstruksjonen (dsTBA) ble fremstilt ved å gløde TBA til sin komplementære sekvens i BPE-buffer. Enten en 5 eller 50 μM endelig konsentrasjon av B-CeP 1 ble reagert med 2 μM prøver av G4-TBA (venstre felt i figur 2B), ssTBA (sentrale baner i figur 2B) og dsTBA (høyre felt i figur 2B) i 1 time, 4 timer og 15 timer. Ytterligere kontroller er DNA-konstruksjonene som ikke reagerte med sonden. Sirkulær dikroisme (CD) analyse av de tre forskjellige TBA-foldingene bekreftet riktig struktur (tilleggsfigur S1). CD-spekteret til dsTBA var faktisk preget av et positivt langt bølgelengdebånd ved ~ 260-280 nm og et negativt bånd ved ~ 245 nm15, konsekvent med en DNA-heliks i sin B-form. SSTBA ble funnet å være dårlig strukturert i fravær av K + -ioner, mens G4-TBA bretter seg i en anti-parallell G4 i nærvær av K + -ioner, karakterisert ved et negativt bånd ved 260 nm og et positivt bånd ved 290 nm15.

De høyoppløselige PAGE-resultatene rapportert i figur 2B gir en omfattende oversikt over tids- og konsentrasjonsavhengige reaksjoner av B-CeP 1 mot G4-TBA, ssTBA og dsTBA, og avslører tydelig et markant forskjellig alkyleringsmønster for G4-TBA i forhold til det som ble observert for ssTBA- og dsTBA-konstruksjonene. Bånd som migrerer med lavere mobilitet enn de ubehandlede prøvene (C) er konsistente med DNA-substratalkylering. Når det gjelder G4-TBA-substratet, observeres bare en alkyleringsaddukt tydelig, i henhold til tilstedeværelsen av bare en guanin (G8) tilgjengelig for alkylering (nummerering av guaniner i figur 2C). Tvert imot skilles flere addukter når substratet er enten ssTBA eller dsTBA, med alle guaniner som har N7-posisjonen fri til å bli undersøkt. Raskere migrerende bånd tilskrives i stedet produktene av trådspaltning. Når det gjelder G4-TBA-substratet, er guaninene (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15) involvert i G-quadruplex tetrads ugjennomtrengelige for alkylering, mens G8 påvirkes av spaltning som et følgende trinn av alkylering. I ssTBA- og dsTBA-konstruksjonene er alle guaniner utsatt for spaltning, som demonstrert av de mange båndene som oppdages, som blir gradvis mer intense ved lengre inkubasjonstider.

Denne protokollen tillater diskriminering mellom guaninene som er involvert i dannelsen av G-quadruplex tetrads og guaninene som ikke er involvert i et slikt arrangement, og dermed belyser G4-TBA-strukturen (figur 2C).

En mulig ulempe ved forsøket er tilstedeværelsen av uønskede nukleofiler i reaksjonsmiljøet. For eksempel konkurrerer nukleofiler avledet fra salter i reaksjonsbufferen med DNA for reaktiviteten med B-CePs, noe som fører til ineffektiv reaksjon av sonden med substratet. Figur 3 viser resultatene av sonderingsreaksjonene utført i Tris-buffer, som inneholder den nukleofile Tris-basen. B-CeP 1 (5 og 50 μM) reageres med 2 μM-prøver av G4-TBA (venstre felt i figur 3), ssTBA (sentrale baner i figur 3) og dsTBA (høyre felt i figur 3) i 1 time, 4 timer, 15 timer og 24 timer. Under disse forholdene er sondens reaktivitet mot alle tre DNA-substratene tydelig redusert. For G4-TBA-prøvene kan vi bare observere dannelsen av addukter uten å oppdage strengspaltning. I tilfeller av ssTBA og dsTBA er DNA-fragmenteringen først etter 24 timer sammenlignbar med den som er observert etter 15 timers inkubasjon i figur 2B. Den uønskede konkurrerende reaktiviteten til B-CePs med Tris fører til mangel på nukleinsyrestrukturinformasjon.

Figure 2
Figur 2: Kjemisk kartlegging av en TBA G-quadruplex struktur med B-CeP 1 i BPE buffer. (A) Kjemisk struktur av B-CeP 1. (B) Tids- og konsentrasjonsavhengighet av probingreaksjonene mellom B-CeP 1 og TBA i BPE-buffer. Aliquots av TBA ble foldet i tre forskjellige forhold for å oppnå G-quadruplex-arrangementet (G4-TBA), det enkeltstrengede oligonukleotidet (ssTBA) og TBA glødet til sin komplementære sekvens for å danne den dobbeltstrengede konstruksjonen (dsTBA). TBA-oligonukleotidet ble merket i 3'-enden med en fluorofor (FAM) for å muliggjøre visualisering på gelsystemet. Alikoter (2 μM) av G4-TBA, ssTBA og dsTBA ble behandlet med B-CeP 1 ved enten 5 eller 50 μM endelig konsentrasjon i BPE-buffer og inkubert ved 37 °C for den angitte tiden. Utfallet av sonderingsreaksjonene ble analysert ved høyoppløselig denaturering PAGE (20% polyakrylamid [PAA], 7 M urea, 1x TBE). "C" indikerer kontrollprøven for hver TBA-konstruksjon. (C) Tegneserie av G-quadruplex-arrangementet av G4-TBA og nummerering av guaniner i TBA-sekvensen. Den eneste guanin som ikke var involvert i G4-strukturen, og dermed reagerer med B-CeP 1, er uthevet i rødt. Den grønne stjernen representerer fluoroforen FAM. Forkortelser: TBA = trombinbindende aptamer; B-CeP 1 = bis-3-kloropiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkeltstrenget; ds = dobbeltstrenget; FAM = 5-karboksyfluorescein; PAA = polyakrylamid; SIDE = polyakrylamidgelelektroforese; TBE = Tris-borat-EDTA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ineffektiv kjemisk kartlegging i nærvær av Tris-buffer. Tids- og konsentrasjonsavhengighet av probingreaksjonene mellom B-CeP 1 og TBA i Tris-buffer. Aliquots av TBA ble foldet i tre forskjellige forhold for å oppnå G-quadruplex-arrangementet (G4-TBA), det enkeltstrengede oligonukleotidet (ssTBA) og TBA glødet til sin komplementære sekvens for å danne den dobbeltstrengede konstruksjonen (dsTBA). TBA-oligonukleotid ble merket i 3'-enden med en fluorofor (FAM) for å muliggjøre visualisering på gelsystemet. Aliquots (2 μM) av G4-TBA, ssTBA og dsTBA ble behandlet med B-CeP 1 ved enten en 5 eller 50 μM endelig konsentrasjon i 10 mM Tris-HCl buffer og inkubert ved 37 °C for den angitte tiden. Utfallet av sonderingsreaksjonene ble analysert ved høyoppløselig denaturering PAGE (20% PAA, 7 M urea, 1x TBE). "C" indikerer kontrollprøven for hver TBA-konstruksjon. Nukleofilisiteten til Tris som brukes som buffer under sonderingsreaksjonene fører til lavere signaler og tap av strukturell informasjon. Forkortelser: TBA = trombinbindende aptamer; B-CeP 1 = bis-3-kloropiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkeltstrenget; ds = dobbeltstrenget; FAM = 5-karboksyfluorescein; PAA = polyakrylamid; SIDE = polyakrylamidgelelektroforese; TBE = Tris-borat-EDTA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: CD-spektra av G4-TBA, ssTBA og dsTBA. Etter riktig folding av de tre forskjellige strukturene ble CD-spektra registrert ved 25 °C. CD-spekteret til dsTBA, karakterisert ved positive lange bølgelengdebånd ved ~ 260-280 nm og et negativt bånd ved ~ 245 nm16, er konsistent med en B-form av DNA-helixen. I forhold til ssTBA, som ble funnet å være dårlig strukturert i fravær av K + -ioner, bretter G4-TBA seg i en anti-parallell G4 i nærvær av K + -ioner, karakterisert ved et negativt bånd ved 260 nm og et positivt bånd ved 290 nm15. Forkortelser: TBA = trombinbindende aptamer; B-CeP 1 = bis-3-kloropiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA; G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkeltstrenget; ds = dobbeltstrenget. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

G-quadruplexes er nukleinsyre sekundære strukturer som vanligvis brettes innenfor guaninrike DNA-sekvenser, og er betydelige forskningsmål på grunn av deres tilknytning til genetisk kontroll og sykdommer. Kjemisk kartlegging av B-CePs er en nyttig protokoll for karakterisering av DNA G4s, som kan brukes til å identifisere guaninbasene som er involvert i dannelsen av G-tetrads under fysiologiske saltforhold.

Den kjemiske sonden som brukes i denne protokollen er B-CeP 1 (figur 2A), som ved å reagere spesifikt med N7 av guaninnukleobaser, kan diskriminere mellom guaninene som er involvert i dannelsen av G-quadruplex tetrads og guaninene som ikke er involvert i et slikt arrangement. Faktisk svekker Hoogsteens hydrogeninteraksjoner mellom guaninene i G-tetrads (figur 1) reaksjonen med sonden. Produkter av sonderende reaksjoner løses ved høyoppløselig PAGE (figur 2B), en laboratorietilgjengelig prosedyre som er svært brukt til å oppdage alkyleringsaddukter og spaltningssteder i DNA-sekvenser. Videre tillater bruken av en DNA-sekvens merket med en fluorofor brukere å utføre eksperimentet under trygge forhold, unngå radioaktivt merkede nukleinsyrer og det konvensjonelle fargetrinnet med interkalatorer.

B-CeP 1-sonden er meget stabil i fast form og i ikke-vandig stamløsning, og bare få problemer kan oppstå under sonderingsreaksjonen. For å unngå ulemper i protokollen er det svært viktig å unngå tilstedeværelse av uønskede nukleofiler i sonderingsløsningene for å unngå konkurrerende reaksjoner som kan redusere titeren til den aktive sonden som er tilgjengelig for å danne addukten med DNA. Siden de mest brukte bufferne inneholder Tris-base, minner vi leseren om at dets nukleofile primære amin kan reagere med sondens elektrofile senter som konkurrerer ut reaktiviteten til guaninene til DNA-substratet10, som vist i figur 3 for B-CeP 1. Dette er begrunnelsen for å utføre sonderingsreaksjonene i fosfatbuffer, som beskrevet i protokollen. For å unngå reaksjoner med vann7, anbefaler vi også at alle fortynninger av B-CeP 1 tilberedes og umiddelbart reageres med nukleinsyresubstratet.

Den kjemiske kartleggingen av B-CePs beskrevet her er et praktisk alternativ til fotavtrykkprotokollen for dimetylsulfat (DMS), som representerer den vanlige analysen for den første karakteriseringen av G4s16. De to protokollene gir i utgangspunktet den samme informasjonen, nemlig dannelsen av G4-strukturen og identifiseringen av guaninene som er involvert i G4, uavhengig av G4-konformasjonen. Den kjemiske kartleggingen med B-CePs har imidlertid en viktig fordel med hensyn til DMS-fotavtrykk - protokollens enkelhet. Etter sonderingsreaksjonene trenger protokollen beskrevet her ikke ytterligere trinn, mens DMS-fotavtrykk trenger påfølgende spaltning av varmt piperidin etter reaksjon med sonden, noe som antyder ytterligere prøverensing og bufferutveksling16. Reduksjonen i antall trinn i protokollen med B-CePs innebærer bruk av mindre mengder av det opprinnelige DNA-substratet. Til slutt vil den kjemiske kartleggingen av B-CePs, beskrevet her med TBA-sekvensen som et proof-of-concept, føre til nye eksperimenter som gjelder for enhver annen potensiell G-quadruplex-formingssekvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Institutt for farmasøytiske og farmakologiske vitenskap, Universitetet i Padova (PRIDJ-BIRD2019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
  3. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
  4. Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
  5. Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
  6. Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
  7. Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
  8. Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
  9. Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
  10. Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
  11. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
  12. Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
  13. Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
  14. Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
  15. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  16. Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).

Tags

Biokjemi utgave 195
<em>In vitro</em> Kjemisk kartlegging av G-quadruplex DNA-strukturer av Bis-3-kloropiperidiner <em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Dal Lago, C.,… More

Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter