Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
G-квадруплексы (G4) — это биологически значимые, неканонические структуры ДНК, которые играют важную роль в экспрессии генов и заболеваниях, представляя собой важные терапевтические мишени. Для характеристики ДНК in vitro в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях (PQS) требуются доступные методы. B-CeP — это класс алкилирующих агентов, которые оказались полезными химическими зондами для исследования структуры нуклеиновых кислот высшего порядка. В данной работе описывается новый химический картирующий анализ, использующий специфическую реакционную способность B-CeP с N7 гуанинов с последующим прямым расщеплением цепей в алкилированных Gs.
А именно, чтобы отличить складки G4 от развернутых форм ДНК, мы используем B-CeP 1 для зондирования тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4. Реакция B-CeP-реагирующих гуанинов с B-CeP 1 дает продукты, которые могут быть разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Картирование с использованием B-CePs является простым и мощным инструментом для характеристики in vitro последовательностей ДНК, образующих G-квадруплекс, что позволяет точно определить местоположение гуанинов, участвующих в образовании G-тетрад.
Введение
В дополнение к типичной двойной спирали Уотсона-Крика, нуклеиновые кислоты могут принимать различные вторичные структуры, такие как альтернативная форма G-квадруплекса (G4), из-за их богатых гуанином последовательностей. Структура G4 основана на образовании плоских тетрамеров, называемых G-тетрадами, в которых четыре гуанина взаимодействуют через водородные связи Хугстина. G-тетрады укладываются друг на друга и дополнительно стабилизируются одновалентными катионами, которые координируются в центре гуанинового ядра (рис. 1)1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка нуклеиновых кислот и химических зондов
- Нуклеиновые кислоты
ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотид под названием «TBA» представляет собой 15-мерную последовательность ДНК 5'-GGT-TGG-TGG-TGT-GGT-TGG-3', помеченную на 3'-конце флуорофором 5-карбоксифлуоресцеином (FAM) для обеспечения визуализации на геле. Немеченый олигонуклеотид "cTBA" представляет собой его комплементарную последовательность ДНК 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA и cTBA используются для получения трех различных структур, как показано в таблице 1.- Наконечники для автоклавов и пробирки по 0,5 мл для получения стерильных одноразовых материалов и избежани....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 2 показан репрезентативный результат проведенного химического картирования, как описано в протоколе, с B-CeP 1 на олигонуклеотиде TBA, свернутом в три различные структуры. TG-квадруплексное расположение TBA (G4-TBA) было получено путем сворачивания олигонуклеотида в BPE и в присутствии катиона K+, тогда как одноцепочечная форма той же последовательности TBA (ssTBA) была свернута в отсутствие калия. Двухцепочечная конструкция (dsTBA) была получена путем отжига TBA до ее .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно сворачиваются в богатых гуанином последовательностях ДНК и являются важными объектами исследований из-за их связи с генетическим контролем и заболеваниями. Химическое картирование с помощью B-CePs является полезным протоколом для характеристики ДНК G4s, который может быть использован для идентификации оснований гуанина, участвующих в образовании G-тетрад в физиологических солевых условиях.
Химическим зондо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эта работа была поддержана Департаментом фармацевтических и фармакологических наук Университета Падуи (PRIDJ-BIRD2019).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Акриламид/бис-акриламид раствор 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Персульфат аммония (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Аналитические весы | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Борная кислота | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Бромфенол синий Бриллиантовый синий R Sigma | Aldrich | B0149 | |
| динатрия гидрофосфат додекагидрат | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| ДНК олигонуклеотиды | Integrated DNA Technologies | синтез заказных последовательностей | |
| ЭДТА динатрия | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Формамид | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Гелевый имиджер | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Глицерин | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Микропробирки 0,5 мл | Sarstedt | 72.704 | |
| Хлорид калия | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Секвенирующий аппарат | Biometra | Model S2 | |
| Раствор для силанизации I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Моноосновной фосфат натрия | Carlo Erba | 480086 | |
| концентратор Speedvac | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Мочевина | Sigma Aldrich | 51456 | |
| УФ-ВИД спектрофотометр | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Ссылки
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
