Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65373
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2Institute of Organic Chemistry, Justus Liebig University Giessen

Summary

Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.

Abstract

G-квадруплексы (G4) — это биологически значимые, неканонические структуры ДНК, которые играют важную роль в экспрессии генов и заболеваниях, представляя собой важные терапевтические мишени. Для характеристики ДНК in vitro в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях (PQS) требуются доступные методы. B-CeP — это класс алкилирующих агентов, которые оказались полезными химическими зондами для исследования структуры нуклеиновых кислот высшего порядка. В данной работе описывается новый химический картирующий анализ, использующий специфическую реакционную способность B-CeP с N7 гуанинов с последующим прямым расщеплением цепей в алкилированных Gs.

А именно, чтобы отличить складки G4 от развернутых форм ДНК, мы используем B-CeP 1 для зондирования тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4. Реакция B-CeP-реагирующих гуанинов с B-CeP 1 дает продукты, которые могут быть разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Картирование с использованием B-CePs является простым и мощным инструментом для характеристики in vitro последовательностей ДНК, образующих G-квадруплекс, что позволяет точно определить местоположение гуанинов, участвующих в образовании G-тетрад.

Introduction

В дополнение к типичной двойной спирали Уотсона-Крика, нуклеиновые кислоты могут принимать различные вторичные структуры, такие как альтернативная форма G-квадруплекса (G4), из-за их богатых гуанином последовательностей. Структура G4 основана на образовании плоских тетрамеров, называемых G-тетрадами, в которых четыре гуанина взаимодействуют через водородные связи Хугстина. G-тетрады укладываются друг на друга и дополнительно стабилизируются одновалентными катионами, которые координируются в центре гуанинового ядра (рис. 1)1.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение G-квадруплексной структуры. (A) Схематическое изображение G-тетрады. Планарная решетка стабилизируется спариванием оснований по Хугстину и центральным катионом (M+). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Последовательности, содержащие четыре или более последовательных прогонов, по крайней мере, двух последовательных гуаниновых нуклеотидов, являются потенциальными G-квадруплекс-образующими последовательностями (PQS), которые могут сворачиваться в G-квадруплексные структуры. PQS расположены во многих различных клеточных контекстах, таких как теломеры, промоторы генов, рибосомная ДНК и рекомбинационные сайты, и участвуют в регуляции многих биологическихпроцессов. Таким образом, идентификация и экспериментальная проверка G4 в геноме человека, которая в настоящее время осуществляется в основном с помощью вычислительных инструментов, является биологически значимойпроблемой. Для поддержки вычислительных прогнозов или обнаружения непредсказанных структур G4 здесь показан доступный метод, основанный на химическом картировании, для идентификации образования G4 в матрице ДНК, позволяющий точно идентифицировать гуанины, образующие структуру G-тетрады.

В представленном химическом картированном анализе используется различная реакционная способность бис-3-хлорпиперидинов (B-CeP) с гуанинами после образования структур G4. Благодаря своей высокой реакционной способности с нуклеофилами 4,5,6,7,8,9, B-CeP являются алкилирующими агентами нуклеиновых кислот, обладающими способностью очень эффективно реагировать с положением N7гуаниновых нуклеотидов10. Алкилирование сопровождается депуринацией и расщеплением цепей в одноцепочечных и двухцепочечных конструкциях ДНК. Напротив, гуанины, участвующие в образовании G-тетрад в G4-расположениях, невосприимчивы к алкилированию B-CeP, так как положение N7 гуанинов вовлечено в водородные связи Хугстина. Эта специфическая реакционная способность B-CeP позволяет не только обнаруживать структуры G4, но и идентифицировать гуанины, образующие тетраду (тетрады), поскольку они могут быть выведены из их относительной защиты от алкилирования по сравнению с гуанинами в одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.

Протокол химического картирования представлен здесь с использованием B-CeP 1 (рис. 2A) в качестве зонда для характеристики тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4 в присутствии катионов калия11,12. Расположение G4 TBA (G4-TBA) напрямую сравнивается с двумя контрольными группами, а именно TBA в одноцепочечной форме (ssTBA) и TBA, отожженной до ее комплементарной последовательности с образованием двухцепочечной конструкции (dsTBA) (табл. 1). Продукты зондирующих реакций растворяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Визуализация на геле обеспечивается конъюгацией олигонуклеотида TBA с флуорофором на его 3'-конце (табл. 1). В этом протоколе показано, как сворачивать TBA в различных конформациях (G4 и контроль), а также как проводить зондирующие реакции с B-CeP с последующим PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка нуклеиновых кислот и химических зондов

  1. Нуклеиновые кислоты
    ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотид под названием «TBA» представляет собой 15-мерную последовательность ДНК 5'-GGT-TGG-TGG-TGT-GGT-TGG-3', помеченную на 3'-конце флуорофором 5-карбоксифлуоресцеином (FAM) для обеспечения визуализации на геле. Немеченый олигонуклеотид "cTBA" представляет собой его комплементарную последовательность ДНК 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA и cTBA используются для получения трех различных структур, как показано в таблице 1.
    1. Наконечники для автоклавов и пробирки по 0,5 мл для получения стерильных одноразовых материалов и избежания загрязнения.
    2. Готовят исходные растворы, растворяющие каждый олигонуклеотид в сверхчистой воде до конечной концентрации 100 мкМ. Точную концентрацию олигонуклеотидов определяют с помощью спектрофотометра в ультрафиолетовом диапазоне видимого диапазона (UV-Vis), используя коэффициент экстинкции при 260 нм, предоставленный производителем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты экстинкции: 164 300 М-1 см-1 и 138 600 М-1 см-1 были использованы для TBA и cTBA, соответственно.
    3. Храните исходные растворы TBA и cTBA при температуре -20 °C (в течение нескольких месяцев в этих условиях).
  2. Соединение B-CeP 1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение B-CeP 1 синтезируется, как сообщалось ранее6.
    1. Приготовьте исходный раствор B-CeP 1 при ~10 мМ. Взвесьте ~1 мг лиофилизированного соединения с помощью аналитических весов, расположенных в вытяжном шкафу, и растворите его в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО).
    2. Рассчитайте точную концентрацию соединения на основе фактического количества используемого соединения и ДМСО (d = 1,1 г/см3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда обращайтесь с соединением в перчатках (как при лиофилизации, так и при растворении в ДМСО)13,14.

Таблица 1: Олигонуклеотидные структуры, используемые в данном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

2. Сворачивание конструкций нуклеиновых кислот

  1. Подготовка буферов
    1. Приготовьте буферный раствор BPE (бифосфат-этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА], 5x: 2 мМ2PO 4, 6 мМ Na2 HPO 4, 1 мМNa2ЭДТА, pH7,4) и раствор 500 мМ KCl в сверхчистой воде. Отфильтруйте растворы через фильтры с размером пор 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте свежеприготовленные растворы. Буфер BPE можно хранить при температуре 4 °C до 15 дней.
  2. Сворачивание образцов G4-TBA, ssTBA и dsTBA методом повторного складывания
    ПРИМЕЧАНИЕ: Катионы калия необходимы для сворачивания структуры G4 (G4-TBA). Не добавляйте катионы калия в раствор для сворачивания органов управления ssTBA и dsTBA.
    1. Приготовьте 40 мкл 4 мкМ раствора G4-TBA в 1x BPE и 100 мМ KCl. Денатурируют раствор олигонуклеотида G4-TBA, нагревая пробирку до 95 °C в течение 5 мин, и медленно охлаждают ее до комнатной температуры (RT), чтобы TBA сложилась в G-квадруплексы.
    2. Приготовьте 40 мкл 4 мкМ раствора ssTBA в 1x BPE. Выполните процедуру термического складывания, как описано в шаге 2.2.1, чтобы сложить TBA в одноцепочечной форме.
    3. Приготовьте 40 мкл 4 мкМ раствора дцТБА путем смешивания эквимолярных количеств ТБА и цТБА в 1х BPE. Выполните процедуру термического складывания, как описано выше (шаг 2.2.1), для отжига TBA до его комплементарной последовательности cTBA и формирования двухцепочечной формы TBA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем каждого складного раствора зависит от количества образцов для зондирующих реакций, учитывая, что для каждого образца потребуется 5 мкл раствора 4 мкМ. Приготовьте немного избыточного объема каждого раствора, чтобы избежать ошибок при пипетировании.

3. Зондирующие реакции

ПРИМЕЧАНИЕ: Зондирующие реакции должны быть выполнены сразу после процедуры термического складывания.

  1. Когда фальцовочные растворы G4-TBA, ssTBA и dsTBA остынут до RT, проводят центрифугирование с коротким отжимом (7 000 × г в течение 5-8 с при RT) и начинают зондирующие реакции.
  2. Подготовьте 21 пустую автоклавную пробирку объемом 0,5 мл. Организуйте их в три набора по семь пробирок в каждом на стойке для лабораторных образцов, как указано в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый набор столбцов соответствует трем различным условиям свертывания TBA: G4-TBA, ssTBA и dsTBA. Каждый ряд соответствует трем различным срокам инкубации. Каждая ячейка в столбце соответствует конечной концентрации зонда B-CeP 1 (табл. 2). Убедитесь, что на тюбиках есть четкая маркировка.
  3. Добавьте в каждую пробирку по 3 мкл сверхчистой воды.
  4. Добавьте 5 мкл свернутого G4-TBA в каждую пробирку первого набора (шаг 3.2). Добавьте 5 мкл свернутого ssTBA в каждую пробирку второго набора. Добавьте 5 мкл свернутого dsTBA в каждую пробирку третьего набора.
  5. Разбавьте исходный раствор B-CeP 1 до 250 мкМ и 25 мкМ в сверхчистой воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения химического зонда B-CeP 1 должны быть свежеприготовленными и немедленно вступить в реакцию с субстратом ДНК, чтобы избежать конкурирующих реакций с водой.
  6. Добавьте к образцам 2 мкл соответствующего разведения B-CeP 1 (25 мкМ и 250 мкМ). Замените соединение сверхчистой водой в трех контрольных образцах (С) для анализа по-разному свернутых TBA в отсутствие соединения. Инкубируют все образцы при температуре 37 °C.
  7. Через 1 ч, 4 ч и 15 ч инкубации остановите реакцию, поместив пробирки при -20 °C до следующего этапа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить в этих условиях в течение нескольких дней.
  8. Высушите образцы в вакуумной центрифуге.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные образцы можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких недель, прежде чем приступить к анализу PAGE.

Таблица 2: Образцы для зондирующих реакций (структуры, концентрации зондов и время инкубации). Каждый набор столбцов соответствует трем различным условиям свертывания TBA (G4-TBA, ssTBA и dsTBA). Каждый ряд соответствует трем различным срокам инкубации (1, 4, 15 ч). Каждая ячейка в колонке соответствует конечной концентрации зонда B-CeP 1 (5 или 50 мкМ). Контроль (С) для каждого набора соответствует образцу по-разному сложенных ТБА, инкубированных в течение более длительного времени (15 ч) в отсутствие соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

4. СТРАНИЦА с высоким разрешением

  1. Приготовление денатурирующего раствора полиакриламида
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее приготовьте 500 мл 20% денатурирующего раствора полиакриламидного геля. Для каждого эксперимента будет использовано около 80 мл этого раствора. Используйте бутылку из янтарного стекла или накройте стеклянную бутылку алюминиевой фольгой для хранения раствора в RT.
    ВНИМАНИЕ: Полиакриламид нейротоксичен. На всех этапах приготовления и заливки геля надевайте перчатки и лабораторный халат. Выбросьте полимеризованный акриламид в соответствующую коробку для загрязненных материалов.
    1. Взвесьте 210 г мочевины в стакане объемом 1 л. Добавьте 250 мл 40% раствора акриламида/бисакриламида (19/1) и 50 мл 10x клещевого энцефалита (890 мМ Tris-HCl, 890 мМ борат, 20 мМ ЭДТА, pH 8).
    2. Поместите стакан на пластину для перемешивания и перемешайте раствор с помощью мешалки. Накройте стакан алюминиевой фольгой во время смешивания, чтобы предотвратить разбрызгивание и загрязнение.
    3. Перемешивайте раствор до полного растворения мочевины и прозрачности раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять много часов. Чтобы ускорить растворение мочевины, добавьте небольшую аликвоту воды, не выходя за пределы желаемого конечного объема.
    4. Снимите стержень мешалки. Перелейте раствор в цилиндр и добавьте воды до точного конечного объема 500 мл.
  2. Настройка гелевого аппарата
    1. Очистите две пластины (одну с насечкой и одну без насечки) 70% этиловым спиртом, дайте им высохнуть, а затем обработайте пластины раствором диметилдихлорсилана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Силанизацию можно пропустить, хотя она помогает высвобождению геля из одной из пластин при разборке гелевого сэндвича.
      ВНИМАНИЕ: Работайте с раствором силанизации в перчатках и проводите обработку пластин этим раствором в вытяжном шкафу.
    2. Поместите распорки 0,4 мм вдоль длинных краев длинной пластины, поместите короткую пластину поверх другой и совместите две пластины внизу.
    3. Наклейте несколько слоев бумажной ленты по всем краям, кроме верхней.
    4. Чтобы избежать протечек при отливке, добавьте дополнительный слой скотча на дно геля.
    5. Закрепите боковые стороны стеклянного сэндвича чистыми зажимами, следуя инструкциям поставщика (разные поставщики используют немного разные приспособления, зажимы для сэндвичей и прокладки).
  3. Заливка геля
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заливайте гель при RT (25 °C), так как полимеризация полиакриламида чувствительна к температуре.
    1. Непосредственно перед применением в стакан наливают 80 мл заранее приготовленного денатурирующего раствора полиакриламида (шаг 4.1), 450 мкл 10% раствора персульфата аммония (APS) и 45 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED).
    2. Смешайте раствор и быстро вылейте его между стеклянными пластинами с помощью шприца объемом 50 мл. Введите расческу с нужным количеством углублений между стеклянными пластинами, избегая пузырей. При необходимости добавьте гелевый раствор, чтобы заполнить бутерброд полностью. Поместите четыре зажима на гребень, чтобы прижать и обеспечить равномерное распределение лунок.
    3. Дайте гелю полимеризоваться не менее 45 минут.
  4. Запуск геля
    1. После полимеризации снимите все зажимы и слои бумажной ленты. Медленно снимите гребень и тщательно промойте лунки дистиллированной водой.
    2. Следуйте инструкциям конкретного поставщика, чтобы правильно поместить гелевый сэндвич в вертикальный аппарат гель-электрофореза.
    3. Приготовьте проточный буфер для клещевого КЛЕФА (1x: 89 мМ Tris-HCl, 89 мМ борат, 2 мМ ЭДТА, pH 8) в деионизированной воде и заполните буфером верхний и нижний резервуары.
    4. Разогрейте пластины, выполнив предварительный прогон гель-электрофореза не менее 30 мин при мощности 50 Вт.
    5. Приготовьте денатурирующий гелевый загрузочный буфер (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% формамид, 50% глицерин, 0,05% бромфеноловый синий) в сверхчистой воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: GLB помогает отслеживать движение образцов олигонуклеотидов в гелевую систему и позволяет загружать образцы в лунки геля. Присутствие денатурирующего агента формамида позволяет разделять виды ДНК в соответствии с размером, даже в неденатурирующем PAGE.
    6. Суспендант высушенных образцов (образцы из этапа 3.8) в 5 мкл ГЛБ.
    7. Перед загрузкой образцов очистите лунки с помощью небольшого шприца и буфера КЛЕЩ в верхней буферной камере, чтобы удалить мочевину из лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг несколько раз, чтобы точно очистить лунки, тем самым избегая полос, которые трудно интерпретировать.
    8. Загрузите образцы в чистые лунки и запишите порядок загрузки.
    9. Выполняйте гель-электрофорез в течение 2 ч при мощности 50 Вт или, по крайней мере, до тех пор, пока бромфеноловый синий краситель не заполнит гель на 2/3.
  5. Визуализация геля
    1. После электрофореза отключите питание, снимите стеклянный сэндвич и очистите стаканы.
    2. Обнаружение флуоресценции олигонуклеотидных полос, меченных FAM, путем сканирования с помощью гелевого тепловизора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 2 показан репрезентативный результат проведенного химического картирования, как описано в протоколе, с B-CeP 1 на олигонуклеотиде TBA, свернутом в три различные структуры. TG-квадруплексное расположение TBA (G4-TBA) было получено путем сворачивания олигонуклеотида в BPE и в присутствии катиона K+, тогда как одноцепочечная форма той же последовательности TBA (ssTBA) была свернута в отсутствие калия. Двухцепочечная конструкция (dsTBA) была получена путем отжига TBA до ее комплементарной последовательности в буфере BPE. Конечную концентрацию B-CeP 1 в 5 или 50 мкМ реагировали с образцами G4-TBA объемом 2 мкМ (левая полоса на рисунке 2B), ssTBA (центральные полосы на рисунке 2B) и dsTBA (правая полоса на рисунке 2B) в течение 1 ч, 4 ч и 15 ч. Дополнительные элементы контроля — это конструкции ДНК, не вступившие в реакцию с зондом. Круговой дихроизм (КД) трех различных складок TBA подтвердил их правильную структуру (дополнительный рисунок S1). Спектр CD dsTBA характеризовался положительной длинноволновой полосой на длине волны ~260-280 нм и отрицательной полосой на длине волны ~245 нм15, что согласуется с спиралью ДНК в ее B-форме. Было обнаружено, что ssTBA плохо структурирована в отсутствие ионов K+, в то время как G4-TBA сворачивается в антипараллельном G4 в присутствии ионов K+, характеризующемся отрицательной полосой на 260 нм и положительной полосой на 290нм15.

Результаты PAGE с высоким разрешением, представленные на рисунке 2B , дают всестороннее представление о зависящих от времени и концентрации реакциях B-CeP 1 на G4-TBA, ssTBA и dsTBA, ясно демонстрируя заметно отличающуюся картину алкилирования для G4-TBA по сравнению с тем, что наблюдалось для конструкций ssTBA и dsTBA. Полосы, мигрирующие с меньшей подвижностью, чем необработанные образцы (С), согласуются с алкилированием субстрата ДНК. В случае субстрата G4-TBA четко виден только один аддукт алкилирования, в соответствии с присутствием только одного гуанина (G8), доступного для алкилирования (нумерация гуанинов на рисунке 2C). Напротив, множественные аддукты различаются, когда субстратом является либо ssTBA, либо dsTBA, при этом все гуанины, обладающие положением N7, свободны для зондирования. Более быстро мигрирующие полосы приписываются продуктам расщепления прядей. В случае субстрата G4-TBA гуанины (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15), участвующие в тетрадах G-квадруплекса, невосприимчивы к алкилированию, в то время как G8 подвержен расщеплению как последующему этапу алкилирования. В конструкциях ssTBA и dsTBA все гуанины восприимчивы к расщеплению, о чем свидетельствуют многочисленные обнаруженные полосы, которые становятся все более интенсивными при более длительном инкубационном периоде.

Этот протокол позволяет проводить различие между гуанинами, участвующими в образовании тетрад G-квадруплекса, и гуанинами, которые не вовлечены в такое расположение, тем самым проясняя структуру G4-TBA (рис. 2C).

Возможным недостатком эксперимента является наличие нежелательных нуклеофилов в реакционной среде. Например, нуклеофилы, происходящие из солей в реакционном буфере, конкурируют с ДНК за реакционную способность с B-CeP, что приводит к неэффективной реакции зонда с субстратом. На рисунке 3 показаны результаты зондирующих реакций, выполненных в буфере Tris, который содержит нуклеофильное основание Tris. B-CeP 1 (5 и 50 мкМ) реагируют с 2 мкМ образцами G4-TBA (левые полосы на рисунке 3), ssTBA (центральные полосы на рисунке 3) и dsTBA (правые полосы на рисунке 3) в течение 1 ч, 4 ч, 15 ч и 24 ч. В этих условиях реакционная способность зонда по отношению ко всем трем субстратам ДНК явно снижена. Для образцов G4-TBA мы можем наблюдать только образование аддуктов без обнаружения расщепления прядей. В случаях ssTBA и dsTBA только через 24 ч фрагментация ДНК сопоставима с той, которая наблюдается после 15 ч инкубации на рисунке 2B. Нежелательная конкурирующая реакционная способность B-CeP с Tris приводит к отсутствию структурной информации о нуклеиновых кислотах.

Figure 2
Рисунок 2: Химическое картирование структуры G-квадруплекса TBA с помощью B-CeP 1 в буфере BPE. (A) Химическая структура B-CeP 1. (B) Зависимость зондирующих реакций между B-CeP 1 и TBA во времени и концентрации в буфере BPE. Аликвоты TBA складывали в трех различных условиях, чтобы получить G-квадруплексное расположение (G4-TBA), одноцепочечный олигонуклеотид (ssTBA), и TBA, отжигали до его комплементарной последовательности с образованием двухцепочечной конструкции (dsTBA). Олигонуклеотид TBA был помечен на 3'-конце флуорофором (FAM) для обеспечения визуализации на гелевой системе. Аликвоты (2 мкМ) G4-TBA, ssTBA и dsTBA обрабатывали B-CeP 1 при конечной концентрации 5 или 50 мкМ в буфере BPE и инкубировали при 37 °C в течение указанного времени. Результаты зондирующих реакций анализировали с помощью денатурирующей PAGE с высоким разрешением (20% полиакриламида [PAA], 7 М мочевины, 1x КЭ). «C» обозначает контрольный образец каждой конструкции TBA. (C) Карикатура на G-квадруплексное расположение G4-TBA и нумерация гуанинов в последовательности TBA. Единственный гуанин, который не был вовлечен в структуру G4 и, таким образом, реагируя с B-CeP 1, выделен красным цветом. Зеленая звезда обозначает флуорофор FAM. Сокращения: TBA = тромбин-связывающий аптамер; B-CeP 1 = бис-3-хлорпиперидин 1; BPE = бифосфат-ЭДТА; G = гуанин; G4 = квадруплекс гуанина; ss = одноцепочечный; ds = двухцепочечный; FAM = 5-карбоксифлуоресцеин; PAA = полиакриламид; PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле; КЛЕЩ = Трис-борат-ЭДТА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Неэффективное химическое картирование в присутствии трис-буфера. Зависимость зондирующих реакций между B-CeP 1 и TBA во времени и концентрации в Tris-буфере. Аликвоты TBA складывали в трех различных условиях, чтобы получить G-квадруплексное расположение (G4-TBA), одноцепочечный олигонуклеотид (ssTBA), и TBA, отжигали до его комплементарной последовательности с образованием двухцепочечной конструкции (dsTBA). Олигонуклеотид TBA был помечен на 3'-конце флуорофором (FAM) для обеспечения визуализации на гелевой системе. Аликвоты (2 мкМ) G4-TBA, ssTBA и dsTBA обрабатывали B-CeP 1 при конечной концентрации 5 или 50 мкМ в 10 мМ буфере Tris-HCl и инкубировали при 37 °C в течение указанного времени. Результаты зондирующих реакций анализировали с помощью денатурирующего PAGE высокого разрешения (20% PAA, 7 M мочевины, 1x КЭ). «C» обозначает контрольный образец каждой конструкции TBA. Нуклеофильность Tris, используемого в качестве буфера во время зондирующих реакций, приводит к снижению сигналов и потере структурной информации. Сокращения: TBA = тромбин-связывающий аптамер; B-CeP 1 = бис-3-хлорпиперидин 1; BPE = бифосфат-ЭДТА; G = гуанин; G4 = квадруплекс гуанина; ss = одноцепочечный; ds = двухцепочечный; FAM = 5-карбоксифлуоресцеин; PAA = полиакриламид; PAGE = электрофорез в полиакриламидном геле; КЛЕЩ = Трис-борат-ЭДТА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Спектры CD G4-TBA, ssTBA и dsTBA. После правильного сворачивания трех различных структур спектры CD регистрировались при 25 °C. Спектр CD dsTBA, характеризующийся положительными длинноволновыми полосами на длине волны ~260-280 нм и отрицательной полосой на длине волны ~245нм16, согласуется с В-формой спирали ДНК. По сравнению с ssTBA, которая, как было обнаружено, плохо структурирована в отсутствие ионов K+, G4-TBA сворачивается в антипараллельном G4 в присутствии ионов K+, характеризующемся отрицательной полосой на длине волны 260 нм и положительной полосой на длине волны 290нм15. Сокращения: TBA = тромбин-связывающий аптамер; B-CeP 1 = бис-3-хлорпиперидин 1; BPE = бифосфат-ЭДТА; G = гуанин; G4 = квадруплекс гуанина; ss = одноцепочечный; ds = двухцепочечный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно сворачиваются в богатых гуанином последовательностях ДНК и являются важными объектами исследований из-за их связи с генетическим контролем и заболеваниями. Химическое картирование с помощью B-CePs является полезным протоколом для характеристики ДНК G4s, который может быть использован для идентификации оснований гуанина, участвующих в образовании G-тетрад в физиологических солевых условиях.

Химическим зондом, используемым в этом протоколе, является B-CeP 1 (рис. 2A), который, специфически реагируя с N7 нуклеотидных оснований гуанина, может различать гуанины, участвующие в образовании тетрад G-квадруплекса, и гуанины, которые не вовлечены в такое расположение. На самом деле, водородные взаимодействия Хугстина между гуанинами в G-тетрадах (рис. 1) ухудшают реакцию с зондом. Продукты зондирующих реакций разрешаются с помощью PAGE с высоким разрешением (рис. 2B), доступной в лаборатории процедуры, широко используемой для обнаружения аддуктов алкилирования и сайтов расщепления в последовательностях ДНК. Кроме того, использование последовательности ДНК, меченной флуорофором, позволяет проводить эксперимент в безопасных условиях, избегая радиоактивно меченых нуклеиновых кислот и обычного этапа окрашивания интеркаляторами.

Зонд B-CeP 1 очень стабилен в твердой форме и в неводном исходном растворе, и при выполнении реакции зондирования может возникнуть лишь несколько проблем. Чтобы избежать недостатков в протоколе, очень важно избегать присутствия нежелательных нуклеофилов в зондирующих растворах, чтобы избежать конкурирующих реакций, которые могут уменьшить титр активного зонда, доступного для формирования аддукта с ДНК. Поскольку наиболее часто используемые буферы содержат основание Tris, мы напоминаем читателю, что его нуклеофильный первичный амин может реагировать с электрофильным центром зонда, конкурируя с реакционной способностью гуанинов субстратаДНК 10, как показано на рисунке 3 для B-CeP 1. Это является обоснованием для проведения зондирующих реакций в фосфатном буфере, как подробно описано в протоколе. Чтобы избежать реакций с водой7, мы также рекомендуем, чтобы все разведения B-CeP1 были свежеприготовленными и мгновенно вступали в реакцию с субстратом нуклеиновой кислоты.

Описанное здесь химическое картирование с помощью B-CeP является удобной альтернативой протоколу футпринта диметилсульфата (DMS), который представляет собой основной анализ для первоначальной характеристики G4s16. Оба протокола дают в основном одну и ту же информацию, а именно формирование структуры G4 и идентификацию гуанинов, участвующих в G4, независимо от конформации G4. Тем не менее, химическое картирование с помощью B-CeP обладает ключевым преимуществом в отношении ДМС — простотой протокола. После зондирующих реакций описанный здесь протокол не требует дополнительных действий, в то время как ДМС требует последующего расщепления горячим пиперидином после реакции с зондом, что подразумевает дополнительную очистку образца и замену буфера16. Сокращение количества шагов в протоколе с B-CeP подразумевает использование меньших количеств исходного субстрата ДНК. Наконец, химическое картирование с помощью B-CeP, описанное здесь с последовательностью TBA в качестве доказательства концепции, приведет к новым экспериментам, применимым к любой другой потенциальной последовательности, образующей G-квадруплекс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Департаментом фармацевтических и фармакологических наук Университета Падуи (PRIDJ-BIRD2019).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
  3. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
  4. Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
  5. Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
  6. Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
  7. Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
  8. Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
  9. Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
  10. Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
  11. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
  12. Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
  13. Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
  14. Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
  15. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  16. Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).

Tags

Биохимия выпуск 195
<em>In Vitro</em> Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами <em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Dal Lago, C.,… More

Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter