Summary
Bis-3-kloropiperidiner (B-CePs) är användbara kemiska prober för att identifiera och karakterisera G-quadruplex-strukturer i DNA-mallar in vitro. Detta protokoll beskriver proceduren för att utföra sonderande reaktioner med B-CePs och för att lösa reaktionsprodukter genom högupplösande polyakrylamidgelelektrofores.
Abstract
G-quadruplexer (G4s) är biologiskt relevanta, icke-kanoniska DNA-strukturer som spelar en viktig roll i genuttryck och sjukdomar, och representerar betydande terapeutiska mål. Tillgängliga metoder krävs för in vitro-karakterisering av DNA inom potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser (PQS). B-CePs är en klass av alkylerande medel som har visat sig vara användbara kemiska sonder för undersökning av nukleinsyrors högre ordningsstruktur. Denna artikel beskriver en ny kemisk kartläggningsanalys som utnyttjar den specifika reaktiviteten hos B-CePs med N7 av guaniner, följt av direkt strängklyvning vid de alkylerade Gs.
För att skilja G4-veck från ovikta DNA-former använder vi nämligen B-CeP 1 för att undersöka den trombinbindande aptameren (TBA), ett 15-mer-DNA som kan anta G4-arrangemanget. Reaktion mellan B-CeP-reagerande guaniner och B-CeP 1 ger produkter som kan lösas upp genom högupplösande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) på en enda nukleotidnivå genom att lokalisera enskilda alkyleringsaddukter och DNA-strängklyvning vid de alkylerade guaninerna. Kartläggning med hjälp av B-CePs är ett enkelt och kraftfullt verktyg för in vitro-karakterisering av G-quadruplex-bildande DNA-sekvenser, vilket möjliggör exakt lokalisering av guaniner som är involverade i bildandet av G-tetrader.
Introduction
Förutom den typiska Watson-Crick-dubbelhelixen kan nukleinsyror anta olika sekundära strukturer, såsom den alternativa G-quadruplex-formen (G4), på grund av deras guaninrika sekvenser. G4-strukturen är baserad på bildandet av plana tetramerer, kallade G-tetrader, där fyra guaniner interagerar genom Hoogsteen vätebindningar. G-tetrader staplas och stabiliseras ytterligare av monovalenta katjoner som samordnas i mitten av guaninkärnan (figur 1)1.
Figur 1: Schematisk representation av en G-quadruplexstruktur. (A) Schematisk representation av en G-tetrad. Den plana matrisen stabiliseras av Hoogsteen-basparning och av en central katjon (M+). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Sekvenser med fyra eller fler körningar av minst två på varandra följande guaninnukleotider är potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser (PQS) som kan veckas i G-quadruplexstrukturer. PQS finns i många olika cellulära sammanhang, såsom vid telomerer, genpromotorer, ribosomalt DNA och rekombinationsställen, och är involverade i regleringen av många biologiska processer2. Därför är identifiering och experimentell validering av G4s i det mänskliga genomet, som för närvarande främst utförs genom beräkningsverktyg, en biologiskt relevant fråga3. För att stödja beräkningsförutsägelser eller upptäcka oförutsedda G4-strukturer visas här en tillgänglig metod baserad på kemisk kartläggning för att identifiera G4-bildningen i en DNA-mall, vilket möjliggör exakt identifiering av guaniner som bildar G-tetradstrukturen.
Den rapporterade kemiska kartläggningsanalysen utnyttjar den olika reaktiviteten hos bis-3-kloropiperidiner (B-CePs) med guaniner efter bildandet av G4-strukturer. På grund av sin höga reaktivitet med nukleofiler 4,5,6,7,8,9 är B-CeP nukleinsyraalkylerande medel med förmågan att reagera mycket effektivt med N7-positionen hos guaninnukleotider 10. Alkylering följs av avurinering och strängklyvning i enkel- och dubbelsträngade DNA-konstruktioner. Tvärtom är guaniner som är involverade i bildandet av G-tetraderna i G4-arrangemang ogenomträngliga för B-CeP-alkylering, eftersom guaninernas N7-positionär inblandad i Hoogsteen-vätebindningarna. Denna specifika reaktivitet hos B-CePs möjliggör inte bara detektion av G4-strukturer, utan också identifiering av de guaniner som bildar tetraden eller tetraderna, eftersom de kan härledas från deras relativa skydd mot alkylering jämfört med guaniner i enkel- och dubbelsträngat DNA.
Det kemiska kartläggningsprotokollet rapporteras här med användning av B-CeP 1 (Figur 2A) som en sond för karakterisering av trombinbindande aptamer (TBA), ett 15-mer-DNA som kan anta G4-arrangemanget i närvaro av kaliumkatjoner11,12. G4-arrangemanget av TBA (G4-TBA) jämförs direkt med två kontroller, nämligen TBA i enkelsträngad form (ssTBA) och TBA glödgad till sin komplementära sekvens för att bilda den dubbelsträngade konstruktionen (dsTBA) (tabell 1). Produkter av sonderande reaktioner löses upp med högupplösande polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) på enkelnukleotidnivå genom att lokalisera enskilda alkyleringsaddukter och DNA-strängklyvning vid de alkylerade guaninerna. Visualisering på gelen möjliggörs genom konjugering av TBA-oligonukleotiden med en fluorofor i dess 3'-ände (tabell 1). Detta protokoll visar hur man viker TBA i dess olika konformationer (G4 och kontroller), och hur man utför sonderingsreaktioner med B-CePs följt av PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av nukleinsyra och kemisk sond
- Nukleinsyror
OBS: Oligonukleotiden med namnet "TBA" är 15-mer DNA-sekvensen 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' märkt i 3'-änden av fluoroforen 5-karboxyfluorescein (FAM) för att möjliggöra visualisering på gelen. Den omärkta oligonukleotiden "cTBA" är dess DNA-komplementära sekvens 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. TBA och cTBA används för att erhålla de tre olika strukturerna, som visas i tabell 1.- Autoklavspetsar och 0,5 ml rör för att få sterila engångsartiklar och undvika kontaminering.
- Bered stamlösningar som löser varje oligonukleotid i ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 100 μM. Bestäm den exakta oligonukleotidkoncentrationen med en ultraviolett synlig (UV-Vis) spektrofotometer med hjälp av extinktionskoefficienten vid 260 nm som anges av tillverkaren.
OBS: Extinktionskoefficienter: 164 300 M-1 cm-1 och 138 600 M-1 cm-1 användes för TBA respektive cTBA. - Förvara TBA- och cTBA-stamlösningar vid -20 °C (i månader under dessa förhållanden).
- Förening B-CeP 1
OBS: Föreningen B-CeP 1 syntetiseras som tidigare rapporterats6.- Bered stamlösningen B-CeP 1 vid ~10 mM. Väg ~1 mg av den frystorkade föreningen med hjälp av en analysvåg placerad i ett dragskåp och solubilisera den i 100 % dimetylsulfoxid (DMSO).
- Beräkna den exakta koncentrationen av föreningen baserat på den faktiska mängden förening och DMSO (d = 1,1 g/cm3) som används.
OBS: Hantera föreningen med handskar hela tiden (både när den är frystorkad och när den är upplöst i DMSO)13,14.
Tabell 1: Oligonukleotidstrukturer som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
2. Veckning av nukleinsyrakonstruktioner
- Beredning av buffertar
- Bered en BPE-buffertlösning (bifosfat-etylendiamintetraättiksyra [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4,6 mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7,4) och en lösning av 500 mM KCl i ultrarent vatten. Filtrera lösningarna genom filter med en porstorlek på 0,22 μm.
OBS: För bästa resultat, använd nyberedda lösningar. BPE-bufferten kan förvaras vid 4 °C i upp till 15 dagar.
- Bered en BPE-buffertlösning (bifosfat-etylendiamintetraättiksyra [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO 4,6 mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7,4) och en lösning av 500 mM KCl i ultrarent vatten. Filtrera lösningarna genom filter med en porstorlek på 0,22 μm.
- Vikning av G4-TBA-, ssTBA- och dsTBA-prover genom värmevikningsproceduren
OBS: Kaliumkatjoner är nödvändiga för att vika G4-strukturen (G4-TBA). Tillsätt inte kaliumkatjoner i vikningslösningen för kontrollerna ssTBA och dsTBA.- Bered 40 μl av en 4 μM lösning av G4-TBA i 1 x BPE och 100 mM KCl. Denaturera oligonukleotiden G4-TBA-lösningen genom att värma röret till 95 °C i 5 minuter och kyl det långsamt ner till rumstemperatur (RT) så att TBA kan veckas till G-quadruplexer.
- Bered 40 μl av en 4 μM lösning av ssTBA i 1 x BPE. Utför värmevikningsproceduren, som nämns i steg 2.2.1, för att vika TBA i dess enkelsträngade form.
- Bered 40 μL av en 4 μM lösning av dsTBA genom att blanda ekvimolära mängder TBA och cTBA i 1x BPE. Utför värmeveckningsproceduren som nämnts ovan (steg 2.2.1) för att TBA ska glödgas till sin komplementära sekvens cTBA och bilda den dubbelsträngade formen av TBA.
Anm.: Den slutliga volymen för varje vikningslösning baseras på antalet prover för sondreaktionerna, med tanke på att 5 μL 4 μM lösning kommer att behövas för varje prov. Förbered lite överskottsvolym av varje lösning för att undvika pipetteringsfel.
3. Sonderande reaktioner
OBS: Sonderingsreaktioner måste göras omedelbart efter värmevikningsproceduren.
- När vikningslösningarna av G4-TBA, ssTBA och dsTBA har svalnat till RT, utför en centrifugering med kort spinn (7 000 × g i 5-8 s vid RT) och starta sondreaktionerna.
- Förbered 21 tomma 0.5 ml autoklaverade rör. Organisera dem i tre uppsättningar med sju rör vardera i stället för labbprover, enligt tabell 2.
OBS: Varje kolumnuppsättning motsvarar de tre olika TBA-vikningsförhållandena G4-TBA, ssTBA och dsTBA. Varje rad motsvarar tre olika inkubationstider. Varje cell i kolonnen motsvarar den slutliga koncentrationen av B-CeP 1-sonden (tabell 2). Se till att tydligt märka rören. - Tillsätt 3 μL ultrarent vatten i varje rör.
- Tillsätt 5 μl vikt G4-TBA i varje rör i den första uppsättningen (steg 3.2). Tillsätt 5 μl vikt ssTBA i varje rör i den andra uppsättningen. Tillsätt 5 μL vikt dsTBA i varje rör i den tredje uppsättningen.
- Späd stamlösningen B-CeP 1 till 250 μM och 25 μM i ultrarent vatten.
OBS: Utspädningar av den kemiska sonden B-CeP 1 måste beredas på nytt och omedelbart reagera med DNA-substratet för att undvika konkurrerande reaktioner med vatten. - Tillsätt 2 μl av lämplig B-CeP 1-utspädning (25 μM och 250 μM) till proverna. Ersätt föreningen med ultrarent vatten i de tre kontrollproverna (C) för analys av de olikveckade TBA:erna i frånvaro av föreningen. Inkubera alla provexemplar vid 37 °C.
- Efter 1 timme, 4 timmar och 15 timmars inkubation stoppas reaktionen genom att rören placeras vid -20 °C fram till nästa steg.
OBS: Proverna kan förvaras under dessa förhållanden i ett par dagar. - Torka proverna i en vakuumcentrifug.
OBS: De torkade proverna kan förvaras vid -20 °C i veckor innan du fortsätter med PAGE-analysen.
Tabell 2: Prover för sondreaktionerna (strukturer, sondkoncentrationer och inkubationstid). Varje kolumnuppsättning motsvarar de tre olika TBA-vikningsvillkoren (G4-TBA, ssTBA och dsTBA). Varje rad motsvarar tre olika inkubationstider (1, 4, 15 timmar). Varje cell i kolonnen motsvarar den slutliga B-CeP 1-sondkoncentrationen (5 eller 50 μM). Kontrollen (C) för varje uppsättning motsvarar ett prov av de olikveckade TBA:erna som inkuberats under den längre tiden (15 timmar) i frånvaro av förening. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
4. Högupplöst SIDA
- Beredning av den denaturerande polyakrylamidlösningen
OBS: Förbered i förväg 500 ml 20 % denaturerande polyakrylamidgellösning. Cirka 80 ml av denna lösning kommer att användas för varje experiment. Använd en bärnstensfärgad glasflaska eller täck en glasflaska med aluminiumfolie för att förvara lösningen på RT.
VARNING: Polyakrylamid är neurotoxiskt. Under alla steg av gelberedning och hällning, använd handskar och en labbrock. Kassera polymeriserad akrylamid i en lämplig låda för kontaminerade material.- Väg upp 210 g urea i en 1 L bägare. Tillsätt 250 ml 40 % akrylamid/bisakrylamidlösning (19/1) och 50 ml 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM borat, 20 mM EDTA, pH 8).
- Placera bägaren på en omrörningsplatta och blanda lösningen med en omrörarstav. Täck bägaren med aluminiumfolie under blandning för att förhindra stänk och kontaminering.
- Blanda lösningen tills urean är helt upplöst och lösningen är klar.
OBS: Det här steget kan ta många timmar. För att främja upplösningen av urea, tillsätt en liten alikvot vatten utan att överskrida den önskade slutliga volymen. - Ta bort omrörarstaven. Häll lösningen i en cylinder och tillsätt vatten till en exakt slutvolym på 500 ml.
- Installation av gelapparat
- Rengör två plattor (en skårad och en oskårad) med 70 % etanol, låt dem torka och behandla sedan plattorna med en dimetyldiklorsilanlösning.
OBS: Silanisering kan hoppas över, även om det hjälper till att frigöra gelén från en av plattorna när gelsmörgåsen tas isär.
VARNING: Hantera silaniseringslösningen med handskar och utför plattbehandlingen med denna lösning i ett dragskåp. - Placera 0.4 mm distanserna längs långsidorna på den längre plattan, placera den korta plattan ovanpå den andra och rikta in de två plattorna i botten.
- Lägg flera lager papperstejp längs alla kanter utom toppen.
- För att undvika läckage under gjutningen, lägg till ett extra lager tejp i botten av gelen.
- Kläm fast sidorna på glassandwichen med rena clamps enligt leverantörens instruktioner (olika leverantörer använder lite olika apparater, sandwich clamps och packningar).
- Rengör två plattor (en skårad och en oskårad) med 70 % etanol, låt dem torka och behandla sedan plattorna med en dimetyldiklorsilanlösning.
- Hälla upp gelén
OBS: Häll gelen vid RT (25 °C), eftersom polyakrylamidpolymerisation är temperaturkänslig.- Häll 80 ml av den tidigare beredda denaturerande polyakrylamidlösningen (steg 4.1), 450 μl 10 % m/V ammoniumpersulfatlösning (APS) och 45 μl tetrametyletylendiamin (TEMED) i en bägare omedelbart före användning.
- Blanda lösningen och häll snabbt ner den mellan glasplattorna med en 50 ml spruta. För in kammen med önskat antal brunnar mellan glasplattorna och undvik bubblor. Tillsätt gellösning för att fylla smörgåsen helt, om det behövs. Placera fyra clamps på kammen för att trycka ner och möjliggöra jämn fördelning av brunnarna.
- Låt gelen polymerisera i minst 45 min.
- Kör gelen
- Efter polymerisationen, ta bort alla klämmor och papperstejplager. Ta bort kammen långsamt och skölj brunnarna noggrant med destillerat vatten.
- Följ instruktionerna från den specifika leverantören för att korrekt placera gelsandwichen i den vertikala gelelektroforesapparaten.
- Förbered TBE-körbuffert (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8) i avjoniserat vatten och fyll både de övre och nedre reservoarerna med bufferten.
- Värm upp plattorna genom att utföra en förkörning av gelelektroforesen i minst 30 minuter vid 50 W.
- Förbered denaturerande gelladdningsbuffert (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80 % formamid, 50 % glycerol, 0,05 % bromfenolblått) i ultrarent vatten.
OBS: GLB hjälper till att spåra oligonukleotidprovernas rörelse in i gelsystemet och gör det möjligt att ladda proverna i gelens brunnar. Förekomsten av denatureringsmedlet formamid gör det möjligt för DNA-arter att separera efter storlek, även i en icke-denaturerande PAGE. - Återsuspendera de torkade proverna (proverna från steg 3.8) i 5 μl DGLB.
- Innan proverna laddas, rengör brunnarna med en liten spruta och TBE-bufferten i den övre buffertkammaren för att avlägsna urea från brunnarna.
OBS: Upprepa detta steg flera gånger för att rengöra brunnarna noggrant och på så sätt undvika band som är svåra att tolka. - Ladda proverna i de rena brunnarna och anteckna laddningsordningen.
- Kör gelelektroforesen i 2 timmar vid 50 W, eller åtminstone tills det bromfenolblå färgämnet har runnit 2/3 ner i gelen.
- Avbildning av gelen
- Efter elektrofores, stäng av strömförsörjningen, ta bort glassmörgåsen och rengör glasögonen.
- Detektera fluorescensen hos de FAM-märkta oligonukleotidbanden genom att skanna med hjälp av en gelkamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar ett representativt resultat av en kemisk kartläggningsanalys utförd, enligt beskrivningen i protokollet med B-CeP 1 på TBA-oligonukleotiden veckad i tre olika strukturer. G-quadruplex-arrangemanget av TBA (G4-TBA) erhölls genom att vecka oligonukleotiden i BPE och i närvaro av K+-katjonen, medan den enkelsträngade formen av samma TBA-sekvens (ssTBA) veckades i frånvaro av kalium. Den dubbelsträngade konstruktionen (dsTBA) framställdes genom att glödga TBA till dess komplementära sekvens i BPE-bufferten. Antingen en slutlig koncentration på 5 eller 50 μM av B-CeP 1 reagerades med 2 μM-prover av G4-TBA (vänster körfält i figur 2B), ssTBA (centrala körfält i figur 2B) och dsTBA (höger körfält i figur 2B) i 1 timme, 4 timmar och 15 timmar. Ytterligare kontroller är att DNA-konstruktionerna inte reagerade med sonden. Cirkulär dikroismanalys (CD) av de tre olika TBA-veckningarna bekräftade deras korrekta struktur (tilläggsfigur S1). CD-spektrumet för dsTBA karakteriserades i själva verket av ett positivt långt våglängdsband vid ~260-280 nm och ett negativt band vid ~245 nm15, i överensstämmelse med DNA-helixen i dess B-form. SSTBA visade sig vara dåligt strukturerad i frånvaro av K+-joner, medan G4-TBA veckar sig i en antiparallell G4 i närvaro av K+-joner, kännetecknad av ett negativt band vid 260 nm och ett positivt band vid 290 nm15.
De högupplösta PAGE-resultaten som rapporteras i figur 2B ger en heltäckande bild av de tids- och koncentrationsberoende reaktionerna av B-CeP 1 mot G4-TBA, ssTBA och dsTBA, vilket tydligt avslöjar ett markant annorlunda alkyleringsmönster för G4-TBA jämfört med vad som observerades för ssTBA- och dsTBA-konstruktionerna. Band som migrerar med lägre rörlighet än de obehandlade proverna (C) överensstämmer med DNA-substratalkylering. När det gäller G4-TBA-substratet observeras endast en alkyleringsaddukt tydligt, enligt närvaron av endast en guanin (G8) tillgänglig för alkylering (numrering av guaniner i figur 2C). Tvärtom särskiljs multipla addukter när substratet är antingen ssTBA eller dsTBA, där alla guaniner som har N7-positionen är fria att undersökas. Snabbare migrerande band tillskrivs istället produkterna av strängklyvning. När det gäller G4-TBA-substratet är guaninerna (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15) som är involverade i G-quadruplex-tetrader ogenomträngliga för alkylering, medan G8 påverkas av klyvning som ett efterföljande steg i alkyleringen. I ssTBA- och dsTBA-konstruktionerna är alla guaniner känsliga för klyvning, vilket framgår av de många band som detekterats, vilka blir progressivt mer intensiva vid längre inkubationstider.
Detta protokoll tillåter diskriminering mellan de guaniner som är involverade i bildandet av G-quadruplex-tetraderna och de guaniner som inte är inblandade i ett sådant arrangemang, vilket belyser G4-TBA-strukturen (Figur 2C).
En möjlig nackdel med experimentet är närvaron av oönskade nukleofiler i reaktionsmiljön. Till exempel konkurrerar nukleofiler som härrör från salter i reaktionsbufferten med DNA om reaktiviteten med B-CePs, vilket leder till ineffektiv reaktion av sonden med substratet. Figur 3 visar resultaten av de sonderingsreaktioner som utförts i Tris-buffert, som innehåller den nukleofila Tris-basen. B-CeP 1 (5 och 50 μM) reageras med 2 μM-prover av G4-TBA (vänster körfält i figur 3), ssTBA (centrala körfält i figur 3) och dsTBA (höger körfält i figur 3) i 1 timme, 4 timmar, 15 timmar och 24 timmar. Under dessa förhållanden är sondens reaktivitet mot alla tre DNA-substrat tydligt reducerad. För G4-TBA-proverna kan vi endast observera bildandet av addukter utan att detektera strängklyvning. När det gäller ssTBA och dsTBA är DNA-fragmenteringen jämförbar med den som observerats efter 15 timmars inkubation i figur 2B först efter 24 timmar. Den oönskade konkurrerande reaktiviteten hos B-CePs med Tris leder till brist på strukturell information om nukleinsyra.
Figur 2: Kemisk kartläggning av en TBA G-quadruplex-struktur med B-CeP 1 i BPE-buffert. (A) Kemisk struktur för B-CeP 1. (B) Tids- och koncentrationsberoende av sondreaktionerna mellan B-CeP 1 och TBA i BPE-buffert. Alikvoter av TBA veckades under tre olika betingelser för att erhålla G-quadruplex-arrangemanget (G4-TBA), den enkelsträngade oligonukleotiden (ssTBA) och TBA glödgades till sin komplementära sekvens för att bilda den dubbelsträngade konstruktionen (dsTBA). TBA-oligonukleotiden märktes i 3'-änden med en fluorofor (FAM) för att möjliggöra visualisering på gelsystemet. Alikvoter (2 μM) av G4-TBA, ssTBA och dsTBA behandlades med B-CeP 1 vid antingen en slutlig koncentration på 5 eller 50 μM i BPE-bufferten och inkuberades vid 37 °C under den angivna tiden. Resultatet av sondreaktionerna analyserades med högupplöst denaturering PAGE (20% polyakrylamid [PAA], 7 M urea, 1x TBE). "C" anger kontrollexemplet för varje TBA-konstruktion. (C) Tecknad film av G-quadruplex-arrangemanget av G4-TBA och numrering av guaniner i TBA-sekvensen. Den enda guanin som inte var involverad i G4-strukturen, och därmed reagerade med B-CeP 1, är markerad i rött. Den gröna stjärnan representerar fluoroforen FAM. Förkortningar: TBA = trombinbindande aptamer; B-CeP 1 = bis-3-klorpipiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA, G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkelsträngad; ds = dubbelsträngad; FAM = 5-karboxifluorescein; PAA = polyakrylamid; PAGE = polyakrylamidgelelektrofores; TBE = Tris-borat-EDTA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ineffektiv kemisk kartläggning i närvaro av Tris-buffert. Tids- och koncentrationsberoende av sonderingsreaktionerna mellan B-CeP 1 och TBA i Tris-buffert. Alikvoter av TBA veckades under tre olika betingelser för att erhålla G-quadruplex-arrangemanget (G4-TBA), den enkelsträngade oligonukleotiden (ssTBA) och TBA glödgades till sin komplementära sekvens för att bilda den dubbelsträngade konstruktionen (dsTBA). TBA-oligonukleotid märktes i 3'-änden med en fluorofor (FAM) för att möjliggöra visualisering på gelsystemet. Alikvoter (2 μM) av G4-TBA, ssTBA och dsTBA behandlades med B-CeP 1 vid antingen en slutlig koncentration på 5 eller 50 μM i en 10 mM Tris-HCl-buffert och inkuberades vid 37 °C under den angivna tiden. Utfallet av sondreaktionerna analyserades med högupplöst denaturerande PAGE (20% PAA, 7 M urea, 1x TBE). "C" anger kontrollexemplet för varje TBA-konstruktion. Nukleofiliciteten hos Tris som används som buffert under sonderingsreaktionerna leder till lägre signaler och en förlust av strukturell information. Förkortningar: TBA = trombinbindande aptamer; B-CeP 1 = bis-3-klorpipiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA, G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkelsträngad; ds = dubbelsträngad; FAM = 5-karboxifluorescein; PAA = polyakrylamid; PAGE = polyakrylamidgelelektrofores; TBE = Tris-borat-EDTA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur S1: CD-spektra av G4-TBA, ssTBA och dsTBA. Efter korrekt vikning av de tre olika strukturerna registrerades CD-spektra vid 25 °C. CD-spektrumet för dsTBA, som kännetecknas av positiva långa våglängdsband vid ~260-280 nm och ett negativt band vid ~245 nm16, överensstämmer med en B-form av DNA-helixen. I jämförelse med ssTBA, som visade sig vara dåligt strukturerad i frånvaro av K+-joner, veckar G4-TBA i en antiparallell G4 i närvaro av K+-joner, kännetecknad av ett negativt band vid 260 nm och ett positivt band vid 290 nm15. Förkortningar: TBA = trombinbindande aptamer; B-CeP 1 = bis-3-klorpipiperidin 1; BPE = bifosfat-EDTA, G = guanin; G4 = guanin quadruplex; ss = enkelsträngad; DS = dubbelsträngad. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G-quadruplexer är nukleinsyrasekundära strukturer som vanligtvis veckar sig inom guaninrika DNA-sekvenser och är viktiga forskningsmål på grund av deras koppling till genetisk kontroll och sjukdomar. Kemisk kartläggning med B-CePs är ett användbart protokoll för karakterisering av DNA G4s, som kan användas för att identifiera guaninbaserna som är involverade i bildandet av G-tetrader under fysiologiska saltförhållanden.
Den kemiska sond som används i detta protokoll är B-CeP 1 (figur 2A), som genom att specifikt reagera med N7 i guaninnukleobaser kan skilja mellan de guaniner som är involverade i bildandet av G-quadruplex-tetraderna och de guaniner som inte är inblandade i ett sådant arrangemang. Faktum är att Hoogsteens väteinteraktioner mellan guaninerna i G-tetrader (figur 1) försämrar reaktionen med sonden. Produkter av sonderingsreaktioner löses upp med högupplöst PAGE (Figur 2B), en laboratorietillgänglig procedur som används för att detektera alkyleringsaddukter och klyvningsställen i DNA-sekvenser. Dessutom gör användningen av en DNA-sekvens märkt med en fluorofor det möjligt för användare att utföra experimentet under säkra förhållanden, undvika radioaktivt märkta nukleinsyror och det konventionella färgningssteget med interkalatorer.
B-CeP 1-sonden är mycket stabil i fast form och i icke-vattenhaltig stamlösning, och endast ett fåtal problem kan uppstå när sonderingsreaktionen utförs. För att undvika nackdelar i protokollet är det mycket viktigt att undvika närvaron av oönskade nukleofiler i sonderingslösningarna för att undvika konkurrerande reaktioner som kan minska titern hos den aktiva sonden som är tillgänglig för att bilda addukten med DNA. Eftersom de flesta vanliga buffertar innehåller Tris-bas, påminner vi läsaren om att dess nukleofila primära amin kan reagera med sondens elektrofila centrum som konkurrerar ut reaktiviteten hos guaninerna i DNA-substratet10, som visas i figur 3 för B-CeP 1. Detta är motiveringen för att utföra sondreaktionerna i fosfatbufferten, som beskrivs i protokollet. För att undvika reaktioner med vatten7 rekommenderar vi också att alla utspädningar av B-CeP 1 bereds nyberedda och omedelbart reagerar med nukleinsyrasubstratet.
Den kemiska kartläggningen av B-CePs som beskrivs här är ett bekvämt alternativ till dimetylsulfatet (DMS) fotavtrycksprotokollet, som representerar den vanliga analysen för den initiala karakteriseringen av G4s16. De två protokollen ger i stort sett samma information, nämligen bildandet av G4-strukturen och identifieringen av de guaniner som ingår i G4, oavsett G4-konformationen. Den kemiska kartläggningen med B-CePs har dock en viktig fördel när det gäller DMS-fotavtryck - enkelheten i protokollet. Efter sondreaktionerna behöver protokollet som beskrivs här inga ytterligare steg, medan DMS-fotavtryck behöver efterföljande klyvning av hett piperidin efter reaktion med sonden, vilket innebär ytterligare provrening och buffertutbyte16. Minskningen av antalet steg i protokollet med B-CePs innebär användning av mindre mängder av det ursprungliga DNA-substratet. Slutligen kommer den kemiska kartläggningen av B-CePs, som beskrivs här med TBA-sekvensen som ett proof-of-concept, att leda till nya experiment som är tillämpliga på alla andra potentiella G-quadruplex-bildande sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Institutionen för farmaceutiska och farmakologiska vetenskaper, University of Padova (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
