Summary
Bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) são sondas químicas úteis para identificar e caracterizar estruturas G-quadruplex em modelos de DNA in vitro. Este protocolo detalha o procedimento para realizar reações de sondagem com B-CePs e para resolver produtos da reação por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução.
Abstract
G-quadruplexes (G4s) são estruturas de DNA biologicamente relevantes, não canônicas, que desempenham um papel importante na expressão gênica e doenças, representando alvos terapêuticos significativos. Métodos acessíveis são necessários para a caracterização in vitro do DNA dentro de potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (PQSs). B-CePs são uma classe de agentes alquilantes que provaram ser sondas químicas úteis para a investigação da estrutura de ordem superior dos ácidos nucléicos. Este trabalho descreve um novo ensaio de mapeamento químico explorando a reatividade específica de B-CePs com o N7 de guaninas, seguido de clivagem direta em Gs alquilada.
Ou seja, para distinguir as dobras G4 das formas de DNA desdobradas, usamos B-CeP 1 para sondar o aptâmero ligante de trombina (TBA), um DNA de 15 meros capaz de assumir o arranjo G4. A reação de guaninas que respondem a B-CeP com B-CeP 1 produz produtos que podem ser resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução (PAGE) em nível de nucleotídeo único, localizando adutos de alquilação individuais e clivagem de fita de DNA nas guaninas alquiladas. O mapeamento utilizando B-CePs é uma ferramenta simples e poderosa para a caracterização in vitro de sequências de DNA formador de G-quadruplex, possibilitando a localização precisa de guaninas envolvidas na formação de G-tétrades.
Introduction
Além da típica dupla hélice de Watson-Crick, os ácidos nucléicos podem adotar várias estruturas secundárias, como a forma alternativa G-quadruplex (G4), devido às suas sequências ricas em guanina. A estrutura G4 é baseada na formação de tetrâmeros planares, chamados de G-tétrades, nos quais quatro guaninas interagem através de ligações de hidrogênio Hoogsteen. As tétrades G são empilhadas e posteriormente estabilizadas por cátions monovalentes que são coordenados no centro do núcleo da guanina (Figura 1)1.
Figura 1: Representação esquemática de uma estrutura G-quadruplex (A) Representação esquemática de um G-tétrade. A matriz planar é estabilizada pelo pareamento de bases de Hoogsteen e por um cátion central (M+). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Sequências com quatro ou mais tiragens de pelo menos dois nucleotídeos guaninos consecutivos são potenciais sequências formadoras de G-quadruplex (PQSs) que podem dobrar em estruturas G-quadruplex . Os PQS estão localizados em diversos contextos celulares, como telômeros, promotores gênicos, DNA ribossomal e sítios de recombinação, e estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos2. Assim, a identificação e validação experimental de G4s no genoma humano, que atualmente é realizada principalmente por meio de ferramentas computacionais, é uma questão biologicamente relevante3. A fim de apoiar predições computacionais ou detectar estruturas G4 imprevisíveis, um método acessível baseado em mapeamento químico para identificar a formação de G4 em um molde de DNA é mostrado aqui, permitindo a identificação precisa de guaninas que formam a estrutura G-tétrade.
O ensaio de mapeamento químico relatado explora a reatividade diferente de bis-3-cloropiperidinas (B-CePs) com guaninas após a formação de estruturas G4. Devido à sua alta reatividade com nucleófilos 4,5,6,7,8,9, as B-CePs são agentes alquilantes de ácidos nucleicos com capacidade de reagir de forma muito eficiente com a posição N 7 dos nucleotídeos guanina10. A alquilação é seguida por depuração e clivagem de fitas em construções de DNA de fita simples e dupla. Pelo contrário, guaninas envolvidas na formação das G-tétrades em arranjos G4 são impermeáveis à alquilação B-CeP, já que a posição N7 das guaninas está implicada nas ligações de hidrogênio Hoogsteen. Essa reatividade específica dos B-CePs permite não apenas a detecção de estruturas G4, mas também a identificação das guaninas que formam a(s) tétrade(s), pois elas podem ser deduzidas de sua relativa proteção contra alquilação em comparação com guaninas em DNA de fita simples e dupla.
O protocolo de mapeamento químico é relatado aqui usando B-CeP 1 (Figura 2A) como sonda para a caracterização do aptâmero ligante de trombina (TBA), um DNA de 15 meros capaz de assumir o arranjo G4 na presença de cátions potássio11,12. O arranjo G4 do TBA (G4-TBA) é diretamente comparado com dois controles, a saber, TBA na forma de fita simples (ssTBA) e TBA recozido em sua sequência complementar para formar o construto de fita dupla (dsTBA) (Tabela 1). Os produtos das reações de sondagem são resolvidos por eletroforese em gel de poliacrilamida de alta resolução (PAGE) no nível de nucleotídeo único, localizando adutos de alquilação individuais e clivagem de fita de DNA nas guaninas alquiladas. A visualização do gel é possibilitada pela conjugação do oligonucleotídeo TBA com um fluoróforo em sua extremidade 3' (Tabela 1). Este protocolo mostra como dobrar TBA em suas diferentes conformações (G4 e controles), e como realizar reações de sondagem com B-CePs seguido de PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ácido nucleico e preparação de sonda química
- Ácidos nucleicos
NOTA: O oligonucleotídeo denominado "TBA" é a sequência de DNA de 15 meros 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3' marcada na extremidade 3' pelo fluoróforo 5-carboxifluoresceína (FAM) para permitir a visualização no gel. O oligonucleotídeo não marcado "cTBA" é sua sequência complementar de DNA 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'. A TBA e a CBT são empregadas para a obtenção das três diferentes estruturas, como mostra a Tabela 1.- Ponteiras de autoclave e tubos de 0,5 mL para obtenção de descartáveis estéreis e evitar contaminação.
- Preparar soluções-mãe solubilizando cada oligonucleotídeo em água ultrapura até uma concentração final de 100 μM. Determinar a concentração exata de oligonucleotídeos com um espectrofotômetro ultravioleta-visível (UV-Vis), usando o coeficiente de extinção a 260 nm fornecido pelo fabricante.
OBS: Foram utilizados coeficientes de extinção: 164.300 M-1 cm-1 e 138.600 M-1 cm-1 para TBA e CBAc, respectivamente. - Armazenar soluções estoque de TBA e cTBA a -20 °C (por meses nessas condições).
- Composto B-CeP 1
NOTA: O composto B-CeP 1 é sintetizado como relatado anteriormente6.- Prepare a solução-mãe B-CeP 1 a ~10 mM. Pesar ~1 mg do composto liofilizado usando uma balança analítica localizada em uma capela de fumaça e solubilizá-lo em 100% dimetilsulfóxido (DMSO).
- Calcular a concentração exata do composto com base na quantidade real de composto e DMSO (d = 1,1 g/cm3) usado.
OBS: Manipular o composto com luvas o tempo todo (tanto quando liofilizado quanto quando dissolvido em DMSO)13,14.
Tabela 1: Estruturas de oligonucleotídeos utilizadas neste protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.
2. Enovelamento de construções de ácidos nucleicos
- Preparação de tampões
- Preparar uma solução tampão BPE (ácido bifosfato-etilenodiaminotetracético [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO4, 6 mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7,4) e uma solução de 500 mM KCl em água ultrapura. Filtrar as soluções através de filtros de tamanho de poro de 0,22 μm.
NOTA: Para obter melhores resultados, use soluções recém-preparadas. O tampão BPE pode ser armazenado a 4 °C por até 15 dias.
- Preparar uma solução tampão BPE (ácido bifosfato-etilenodiaminotetracético [EDTA], 5x: 2 mM NaH 2 PO4, 6 mM Na 2 HPO 4, 1 mM Na2EDTA, pH7,4) e uma solução de 500 mM KCl em água ultrapura. Filtrar as soluções através de filtros de tamanho de poro de 0,22 μm.
- Dobramento de amostras de G4-TBA, ssTBA e dsTBA pelo procedimento de redobramento térmico
NOTA: Cátions potássio são necessários para dobrar a estrutura G4 (G4-TBA). Não adicionar cátions potássio na solução de dobramento dos controles ssTBA e dsTBA.- Preparar 40 μL de uma solução de 4 μM de G4-TBA em 1x BPE e 100 mM KCl. Desnaturar a solução de oligonucleotídeo G4-TBA aquecendo o tubo a 95 °C por 5 min e resfriá-lo lentamente até a temperatura ambiente (TR) para permitir que o TBA se dobre em G-quadruplexes.
- Preparar 40 μL de uma solução de 4 μM de ssTBA em 1x BPE. Efectuar o procedimento de redobração térmica, tal como referido no ponto 2.2.1, para dobrar o TBA na sua forma de fita simples.
- Preparar 40 μL de uma solução de 4 μM de dsTBA misturando quantidades equimolares de TBA e cTBA em 1x BPE. Executar o procedimento de redobramento térmico conforme mencionado acima (passo 2.2.1) para que o TBA recoza à sua sequência complementar de TBA e forme a forma de fita dupla do TBA.
NOTA: O volume final de cada solução de dobramento é baseado no número de amostras para as reações de sondagem, considerando que serão necessários 5 μL de solução de 4 μM para cada amostra. Prepare um pouco o volume excedente de cada solução para evitar erros de pipetagem.
3. Reações de sondagem
NOTA: As reações de sondagem devem ser feitas imediatamente após o procedimento de redobramento térmico.
- Quando as soluções de dobramento de G4-TBA, ssTBA e dsTBA tiverem resfriado para RT, execute uma centrifugação de spin curto (7.000 × g para 5-8 s em RT) e inicie as reações de sondagem.
- Preparar 21 tubos autoclavados vazios de 0,5 mL. Organizá-los em três conjuntos de sete tubos cada no rack para amostras de laboratório, conforme relatado na Tabela 2.
NOTA: Cada conjunto de colunas corresponde às três diferentes condições de dobramento de TBA G4-TBA, ssTBA e dsTBA. Cada linha corresponde a três tempos de incubação diferentes. Cada célula dentro da coluna corresponde à concentração final da sonda B-CeP 1 (Tabela 2). Certifique-se de rotular claramente os tubos. - Adicione 3 μL de água ultrapura em cada tubo.
- Adicionar 5 μL de G4-TBA dobrado em cada tubo do primeiro conjunto (passo 3.2). Adicionar 5 μL de ssTBA dobrado em cada tubo do segundo conjunto. Adicionar 5 μL de dsTBA dobrado em cada tubo do terceiro conjunto.
- Diluir a solução-mãe B-CeP 1 para 250 μM e 25 μM em água ultrapura.
NOTA: As diluições da sonda química B-CeP 1 devem ser preparadas na hora e reagir imediatamente com o substrato de ADN para evitar reacções concorrentes com a água. - Adicionar 2 μL da diluição B-CeP 1 adequada (25 μM e 250 μM) às amostras. Substitua o composto por água ultrapura nas três amostras de controle (C) para análise dos TBAs dobrados de forma diferente na ausência do composto. Incubar todas as amostras a 37 °C.
- Após 1 h, 4 h e 15 h de incubação, pare a reação colocando os tubos a -20 °C até a próxima etapa.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas nestas condições durante alguns dias. - Secar as amostras em centrífuga a vácuo.
NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a -20 °C durante semanas antes de prosseguir com a análise PAGE.
Tabela 2: Amostras para as reações de sondagem (estruturas, concentrações de sonda e tempo de incubação). Cada conjunto de colunas corresponde às três diferentes condições de dobramento da TBA (G4-TBA, ssTBA e dsTBA). Cada linha corresponde a três tempos de incubação diferentes (1, 4, 15 h). Cada célula dentro da coluna corresponde à concentração final da sonda B-CeP 1 (5 ou 50 μM). O controle (C) para cada conjunto corresponde a uma amostra dos TBAs dobrados de forma diferente incubados por maior tempo (15 h) na ausência do composto. Clique aqui para baixar esta tabela.
4. PÁGINA de alta resolução
- Preparação da solução desnaturante de poliacrilamida
NOTA: Preparar com antecedência 500 mL de solução de gel de poliacrilamida desnaturante a 20%. Cerca de 80 mL dessa solução serão utilizados para cada experimento. Use uma garrafa de vidro âmbar ou cubra uma garrafa de vidro com papel alumínio para armazenar a solução em RT.
CUIDADO: A poliacrilamida é neurotóxica. Durante todas as etapas de preparação e derramamento do gel, use luvas e jaleco. Descarte a acrilamida polimerizada em caixa apropriada para materiais contaminados.- Pesar 210 g de ureia num copo de 1 L. Adicionar 250 mL de solução de acrilamida/bisacrilamida a 40% (19/1) e 50 mL de TBE 10x (Tris-HCl 890 mM, borato 890 mM, EDTA 20 mM, pH 8).
- Coloque o copo num prato agitado e misture a solução com uma vareta agitadora. Cubra o copo com papel alumínio durante a mistura para evitar respingos e contaminação.
- Misture a solução até que a ureia esteja completamente dissolvida e a solução esteja límpida.
Observação : esta etapa pode levar muitas horas. Para promover a dissolução da ureia, adicione uma pequena alíquota de água sem ultrapassar o volume final desejado. - Retire a haste de agitação. Deite a solução num cilindro e adicione água a um volume final exato de 500 ml.
- Instalação de aparelhos de gel
- Limpe duas placas (uma com entalhe e outra sem entalhe) com etanol a 70%, deixe-as secar e, em seguida, trate as placas com uma solução de dimetildiclorosilano.
NOTA: A silanização pode ser ignorada, embora ajude a liberar o gel de uma das placas quando o sanduíche de gel é desmontado.
CUIDADO: Manuseie a solução de silanização com luvas e realize o tratamento da placa com esta solução em uma coifa de fumaça. - Coloque os espaçadores de 0,4 mm ao longo das bordas longas da placa mais longa, coloque a placa curta em cima da outra e alinhe as duas placas na parte inferior.
- Coloque várias camadas de fita de papel ao longo de todas as bordas, exceto na parte superior.
- Para evitar vazamentos durante a fundição, adicione uma camada adicional de fita ao fundo do gel.
- Encaixe as laterais do sanduíche de vidro com abraçadeiras limpas seguindo as instruções do fornecedor (diferentes fornecedores usam aparelhos ligeiramente diferentes, abraçadeiras de sanduíche e juntas).
- Limpe duas placas (uma com entalhe e outra sem entalhe) com etanol a 70%, deixe-as secar e, em seguida, trate as placas com uma solução de dimetildiclorosilano.
- Despejando o gel
NOTA: Deite o gel em RT (25 °C), uma vez que a polimerização da poliacrilamida é sensível à temperatura.- Num béquer, deitar 80 ml da solução de poliacrilamida desnaturante previamente preparada (passo 4.1), 450 μL de uma solução de persulfato de amónio (APS) a 10% m/V e 45 μL de tetrametiletilenodiamina (TEMED) imediatamente antes da utilização.
- Misture a solução e despeje-a rapidamente entre as placas de vidro usando uma seringa de 50 mL. Introduza o pente com o número desejado de poços entre as placas de vidro, evitando bolhas. Adicione a solução de gel para encher o sanduíche completamente, se necessário. Coloque quatro grampos no pente para pressionar para baixo e permitir uma distribuição uniforme dos poços.
- Deixe o gel polimerizar por pelo menos 45 min.
- Executando o gel
- Após a polimerização, remova todas as abraçadeiras e camadas de fita adesiva. Retire o pente lentamente e enxágue bem os poços com água destilada.
- Siga as instruções do fornecedor específico para colocar corretamente o sanduíche de gel no aparelho de eletroforese vertical de gel.
- Prepare o tampão de funcionamento TBE (1x: 89 mM Tris-HCl, borato 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8) em água deionizada e encha os reservatórios superior e inferior com o tampão.
- Aqueça as placas realizando uma pré-corrida da eletroforese em gel por pelo menos 30 min a 50 W.
- Preparar tampão de carregamento de gel desnaturante (DGLB: 1 M Tris-HCl, 80% formamida, 50% glicerol, 0,05% azul de bromofenol) em água ultrapura.
NOTA: O GLB ajuda a rastrear o movimento das amostras de oligonucleotídeos no sistema de gel e permite carregar as amostras nos poços do gel. A presença do agente desnaturante formamida permite que as espécies de DNA se separem de acordo com o tamanho, mesmo em um PAGE não desnaturante. - Ressuspender as amostras secas (amostras do passo 3.8) em 5 μL de DGLB.
- Antes de carregar as amostras, limpe os poços usando uma seringa pequena e o tampão TBE na câmara tampão superior para remover a ureia dos poços.
OBS: Repita este passo várias vezes para limpar com precisão os poços, evitando assim bandas difíceis de serem interpretadas. - Coloque as amostras nos poços limpos e anote a ordem de carregamento.
- Execute a eletroforese em gel por 2 h a 50 W, ou pelo menos até que o corante azul de bromofenol tenha corrido 2/3 abaixo do gel.
- Imagem do gel
- Após a eletroforese, desligue a fonte de alimentação, retire o sanduíche de vidro e limpe os óculos.
- Detecte a fluorescência das bandas de oligonucleotídeos marcadas com FAM por varredura usando um imageador de gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 2 mostra um resultado representativo de um ensaio de mapeamento químico realizado, conforme descrito no protocolo com B-CeP 1, sobre o oligonucleotídeo TBA dobrado em três estruturas diferentes. O arranjo G-quadruplex do TBA (G4-TBA) foi obtido dobrando o oligonucleotídeo em BPE e na presença do cátion K+, enquanto a forma de fita simples da mesma sequência de TBA (ssTBA) foi dobrada na ausência de potássio. O construto de fita dupla (dsTBA) foi preparado por recozimento TBA para sua sequência complementar em tampão BPE. Uma concentração final de 5 ou 50 μM de B-CeP 1 foi reagida com amostras de 2 μM de G4-TBA (faixas da esquerda da Figura 2B), ssTBA (vias centrais da Figura 2B) e dsTBA (faixas da direita da Figura 2B) por 1 h, 4 h e 15 h. Controles adicionais são as construções de DNA não reagiram com a sonda. A análise do dicroísmo circular (CD) das três diferentes dobras da TBA confirmou sua estrutura adequada (Figura Suplementar S1). O espectro de CD do dsTBA foi de fato caracterizado por uma banda de comprimento de onda longa positiva em ~260-280 nm e uma banda negativa em ~245 nm15, consistentemente com uma hélice de DNA em sua forma B. O ssTBA mostrou-se pouco estruturado na ausência de íons K+, enquanto o G4-TBA se dobra em um G4 antiparalelo na presença de íons K+, caracterizado por uma banda negativa em 260 nm e uma banda positiva em 290 nm15.
Os resultados de PAGE de alta resolução relatados na Figura 2B fornecem uma visão abrangente das reações dependentes do tempo e da concentração de B-CeP 1 em relação a G4-TBA, ssTBA e dsTBA, revelando claramente um padrão de alquilação marcadamente diferente para o G4-TBA em comparação com o que foi observado para os construtos ssTBA e dsTBA. Bandas migrando com menor mobilidade do que as amostras não tratadas (C) são consistentes com alquilação do substrato do DNA. No caso do substrato G4-TBA, observa-se claramente apenas um aduto de alquilação, de acordo com a presença de apenas uma guanina (G8) disponível para alquilação (numeração das guaninas na Figura 2C). Ao contrário, múltiplos adutos são distinguidos quando o substrato é ssTBA ou dsTBA, com todas as guaninas possuindo a posição N7 livre para ser sondada. As bandas de migração mais rápida são atribuídas aos produtos da clivagem de fios. No caso do substrato G4-TBA, as guaninas (G1, G2, G5, G6, G10, G11, G14, G15) envolvidas nas tétrades G-quadruplex são impermeáveis à alquilação, enquanto G8 é afetada pela clivagem como etapa seguinte da alquilação. Nos construtos ssTBA e dsTBA, todas as guaninas são suscetíveis à clivagem, como demonstrado pelas numerosas bandas detectadas, que se tornam progressivamente mais intensas em tempos de incubação mais longos.
Este protocolo permite a discriminação entre as guaninas envolvidas na formação das tétrades G-quadruplex e as guaninas não implicadas neste arranjo, elucidando a estrutura do G4-TBA (Figura 2C).
Uma possível desvantagem do experimento é a presença de nucleófilos indesejados no ambiente de reação. Por exemplo, nucleófilos derivados de sais no tampão de reação competem com o DNA pela reatividade com B-CePs, levando a uma reação ineficiente da sonda com o substrato. A Figura 3 mostra os resultados das reações de sondagem realizadas em tampão Tris, que contém a base nucleofílica de Tris. B-CeP 1 (5 e 50 μM) é reagido com amostras de 2 μM de G4-TBA (faixas da esquerda da Figura 3), ssTBA (vias centrais da Figura 3) e dsTBA (faixas da direita da Figura 3) por 1 h, 4 h, 15 h e 24 h. Nessas condições, a reatividade da sonda em direção aos três substratos de DNA é claramente diminuída. Para as amostras de G4-TBA, podemos observar apenas a formação de adutos sem detectar a clivagem das fitas. Nos casos de ssTBA e dsTBA, somente após 24 h a fragmentação do DNA é comparável à observada após 15 h de incubação na Figura 2B. A reatividade competitiva indesejada de B-CePs com Tris leva à falta de informações estruturais de ácidos nucleicos.
Figura 2: Mapeamento químico de uma estrutura TBA G-quadruplex por B-CeP 1 em tampão BPE. (A) Estrutura química do B-CeP 1. (B) Tempo e dependência da concentração das reações de sondagem entre B-CeP 1 e TBA em tampão BPE. Alíquotas de TBA foram dobradas em três condições diferentes para obter o arranjo G-quadruplex (G4-TBA), o oligonucleotídeo de fita simples (ssTBA) e TBA recozido em sua sequência complementar para formar o construto de fita dupla (dsTBA). O oligonucleotídeo TBA foi marcado na extremidade 3' com um fluoróforo (FAM) para permitir a visualização no sistema gel. Alíquotas (2 μM) de G4-TBA, ssTBA e dsTBA foram tratadas com B-CeP 1 na concentração final de 5 ou 50 μM em tampão BPE e incubadas a 37 °C pelo tempo indicado. O resultado das reações de sondagem foi analisado por PAGE desnaturante de alta resolução (poliacrilamida [PAA] 20%, ureia 7 M, 1x TBE). "C" indica a amostra controle de cada construto TBA. (C) Desenho animado do arranjo G-quadruplex de G4-TBA e numeração de guaninas na sequência TBA. A única guanina que não estava envolvida na estrutura G4, reagindo assim com B-CeP 1, é destacada em vermelho. A estrela verde representa o fluoróforo FAM. Abreviações: TBA = aptâmero ligante de trombina; B-CeP 1 = bis-3-cloropiperidina 1; BPE = bifosfato-EDTA; G = guanina; G4 = guanina quadruplex; ss = fita simples; ds = fita dupla; FAM = 5-carboxifluoresceína; PAA = poliacrilamida; PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida; TBE = Tris-borato-EDTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mapeamento químico ineficiente na presença de tampão Tris. Tempo e dependência de concentração das reações de sondagem entre B-CeP 1 e TBA em tampão Tris. Alíquotas de TBA foram dobradas em três condições diferentes para obter o arranjo G-quadruplex (G4-TBA), o oligonucleotídeo de fita simples (ssTBA) e TBA recozido em sua sequência complementar para formar o construto de fita dupla (dsTBA). O oligonucleotídeo TBA foi marcado na extremidade 3' com um fluoróforo (FAM) para permitir a visualização no sistema gel. Alíquotas (2 μM) de G4-TBA, ssTBA e dsTBA foram tratadas com B-CeP 1 na concentração final de 5 ou 50 μM em tampão Tris-HCl 10 mM e incubadas a 37 °C pelo tempo indicado. O resultado das reações de sondagem foi analisado por PAGE desnaturante de alta resolução (PAA 20%, ureia 7M, 1x TBE). "C" indica a amostra controle de cada construto TBA. A nucleofilia de Tris usada como tampão durante as reações de sondagem leva a sinais mais baixos e perda de informação estrutural. Abreviações: TBA = aptâmero ligante de trombina; B-CeP 1 = bis-3-cloropiperidina 1; BPE = bifosfato-EDTA; G = guanina; G4 = guanina quadruplex; ss = fita simples; ds = fita dupla; FAM = 5-carboxifluoresceína; PAA = poliacrilamida; PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida; TBE = Tris-borato-EDTA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Espectros de CD de G4-TBA, ssTBA e dsTBA. Após o dobramento adequado das três diferentes estruturas, os espectros de CD foram registrados a 25 °C. O espectro de CD do dsTBA, caracterizado por bandas de comprimento de onda longo positivas em ~260-280 nm e uma banda negativa em ~245 nm16, é consistente com uma forma B da hélice do DNA. Em comparação com o ssTBA, que se mostrou pouco estruturado na ausência de íons K+, o G4-TBA dobra em um G4 antiparalelo na presença de íons K+, caracterizado por uma banda negativa em 260 nm e uma banda positiva em 290 nm15. Abreviações: TBA = aptâmero ligante de trombina; B-CeP 1 = bis-3-cloropiperidina 1; BPE = bifosfato-EDTA; G = guanina; G4 = guanina quadruplex; ss = fita simples; ds = fita dupla. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G-quadruplexos são estruturas secundárias de ácidos nucleicos que tipicamente se dobram dentro de sequências de DNA ricas em guanina, e são alvos significativos de pesquisa por causa de sua associação com controle genético e doenças. O mapeamento químico por B-CePs é um protocolo útil para a caracterização do DNA G4s, que pode ser usado para identificar as bases guaninas envolvidas na formação de G-tétrades sob condições fisiológicas salinas.
A sonda química utilizada neste protocolo é a B-CeP 1 (Figura 2A), que, reagindo especificamente com o N7 das nucleobases guaninas, pode discriminar entre as guaninas envolvidas na formação das tétrades G-quadruplex e as guaninas que não estão implicadas em tal arranjo. De fato, as interações de hidrogênio Hoogsteen entre as guaninas em G-tétrades (Figura 1) prejudicam a reação com a sonda. Os produtos das reações de sondagem são resolvidos pelo PAGE de alta resolução (Figura 2B), um procedimento acessível em laboratório altamente utilizado para detectar adutos de alquilação e sítios de clivagem dentro de sequências de DNA. Além disso, o uso de uma sequência de DNA marcada com fluoróforo permite que os usuários realizem o experimento em condições seguras, evitando ácidos nucleicos marcados radioativamente e a etapa de coloração convencional com intercaladores.
A sonda B-CeP 1 é muito estável na forma sólida e em solução de estoque não aquosa, e apenas alguns problemas podem ocorrer durante a realização da reação de sondagem. Para evitar inconvenientes no protocolo, é muito importante evitar a presença de nucleófilos indesejados nas soluções de sondagem para evitar reações concorrentes que poderiam diminuir o título da sonda ativa disponível para formar o aduto com o DNA. Como os tampões mais comumente utilizados contêm Tris base, lembramos ao leitor que sua amina primária nucleofílica pode reagir com o centro eletrofílico da sonda competindo com a reatividade das guaninas do substrato de DNA10, como mostrado na Figura 3 para B-CeP 1. Esta é a justificativa para a realização das reações de sondagem em tampão fosfato, conforme detalhado no protocolo. Para evitar reações com água7, também recomendamos que todas as diluições de B-CeP 1 sejam preparadas na hora e reagiram instantaneamente com o substrato de ácido nucleico.
O mapeamento químico por B-CePs descrito aqui é uma alternativa conveniente ao protocolo de pegada de sulfato de dimetila (DMS), que representa o ensaio convencional para a caracterização inicial de G4s16. Os dois protocolos fornecem basicamente as mesmas informações, ou seja, a formação da estrutura do G4 e a identificação das guaninas envolvidas no G4, independentemente da conformação do G4. No entanto, o mapeamento químico com B-CePs possui uma vantagem fundamental em relação ao footprinting DMS - a simplicidade do protocolo. Após as reações de sondagem, o protocolo aqui descrito não necessita de etapas adicionais, enquanto a plantação do DMS necessita de posterior clivagem por piperidina quente após a reação com a sonda, implicando purificação adicional da amostra e troca do tampão16. A redução do número de passos no protocolo com B-CePs implica na utilização de menores quantidades do substrato inicial do DNA. Finalmente, o mapeamento químico por B-CePs, aqui descrito com a sequência TBA como prova de conceito, levará a novos experimentos aplicáveis a qualquer outra sequência potencial de formação de G-quadruplex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciências Farmacêuticas e Farmacológicas da Universidade de Padova (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
