Summary
Her præsenterer vi protokoller til at arbejde med Limosilactobacillus reuteri DSM20016, der beskriver vækst, plasmidtransformation, koloni-PCR, fluorescerende reporterproteinmåling og begrænset plasmid mini-prep samt almindelige problemer og fejlfinding. Disse protokoller tillader måling af reporterproteiner i DSM20016 eller bekræftelse via koloni-PCR, hvis ingen indberetter er involveret.
Abstract
Lactobacillus var en utrolig stor, forskelligartet slægt af bakterier bestående af 261 arter, hvoraf flere var kommensale stammer med potentiale til brug som chassis for syntetiske biologiske bestræbelser i mave-tarmkanalen. Den store fænotypiske og genotypiske variation, der blev observeret inden for slægten, førte til en nylig omklassificering og introduktionen af 23 nye slægter.
På grund af bredden af variationer inden for de gamle slægter fungerer protokoller, der er demonstreret i et medlem, muligvis ikke som annonceret med andre medlemmer. Mangel på centraliseret information om, hvordan man præcist manipulerer specifikke stammer, har ført til en række ad hoc-tilgange , ofte tilpasset fra andre bakteriefamilier. Dette kan komplicere tingene for forskere, der starter i marken, som måske ikke ved, hvilke oplysninger der gælder eller ikke gælder for deres valgte stamme.
I dette papir sigter vi mod at centralisere et sæt protokoller med demonstreret succes, specifikt i Limosilactobacillus reuteri stammebetegnelsen F275 (andre indsamlingsnumre: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) sammen med fejlfindingsråd og almindelige problemer, man kan støde på. Disse protokoller skal gøre det muligt for en forsker med ringe eller ingen erfaring med at arbejde med L. reuteri DSM20016 at omdanne et plasmid, bekræfte transformation og måle systemfeedback i en pladelæser via et reporterprotein.
Introduction
Slægten Lactobacillus blev historisk klassificeret som gram-positive, stavformede, ikke-sporedannende, enten fakultative anaerober eller mikroaerofiler, der nedbryder sukker til primært at producere mælkesyre1. Disse løse kriterier førte til, at Lactobacillus er, fænotypisk og genotypisk, en ekstremt forskelligartet slægt. Denne brede kategorisering resulterede i, at slægten blev omklassificeret og introducerede 23 nye slægter i 20202.
Den gamle, bredere slægt omfattede vigtige kommensale og probiotiske arter, der generelt betragtes som sikre (GRAS) til forbrug3. Den Lactobacillaceae familie opretholder en offentlig opfattelse af at være 'gode bakterier' på grund af mange rapporterede sundhedsmæssige fordele skænket via forbruget af forskellige stammer 4,5,6,7. Den lethed, hvormed de kan navigere i mave-tarmkanalen8 og deres offentlige accept kombinere for at positionere Lactobacillaceae stammer som stærke kandidater som chassis organismer til indtagelige medicinske, terapeutiske, eller diagnostiske applikationer.
Den brede vifte af egenskaber, der findes inden for Lactobacillaceae-familien , har ført til en situation, hvor der ikke er nogen de facto-modelorganismestamme ; Forskergrupper har haft tendens til at vælge arter med de egenskaber, der er mest relevante for deres særlige mål. (For eksempel kan mejerifermenteringslaboratorier vælge L. lactis; undersøgelser af vegetabilsk fermentering kan vælge L. plantarum; forskning i probiotika kan fokusere på L. acidophilus; og så videre.)
Den samme brede vifte af egenskaber på tværs af arter har ført til en ophobning af protokoller og procedurer, der kan fungere godt for en delmængde af Lactobacillaceae familien, men kræver optimering til at arbejde effektivt (eller måske til at fungere overhovedet) i andre9. Dette behov for optimering mellem familiemedlemmer og endda inden for medlemmer af samme art kan frustrere indsatsen fra ukendte forskere. Protokoller offentliggjort i metodeafsnittene i papirer kan også omfatte deres egne ændringer10, hvilket fører til fragmenterede, decentraliserede protokolsamlinger.
L. reuteri betragtes som et bredt hvirveldyr kommensal, der findes konsekvent i pattedyr, fugle11 og fisk12 gastrointestinale (GI) kanaler. L. reuteri sub-stammer er ofte genetisk specialiseret, via slim adhæsion protein tilpasning, til mere permanent kolonisere specifikke indfødte værter 8,11,13. GI-kanal Limosilactobacillus arter kan isoleres i værter uden for deres oprindelige vært, men har tendens til mere mod en forbigående natur8.
På grund af specialisering mellem mennesker og værter positionerer L. reuteri sig DSM20016 meget godt som et chassis til diagnostiske eller terapeutiske anvendelser på ethvert tidspunkt i den menneskelige mave-tarmkanal, og den stamme, DSM20016 kunne give et længerevarende effektvindue for interventioner sammenlignet med mere forbigående stammer.
I dette papir skitserer vi en række protokoller med demonstreret effektivitet i Limosilactobacillus reuteri (stammebetegnelse: F275; andre indsamlingsnumre: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) sammen med centraliseret information om stammen fra andre kilder til hjælp i molekylære og systembiologiske applikationer. Procedurer, der er fastlagt heri, skal gøre det muligt for en forsker uden forudgående erfaring at dyrke L. reuteri, skabe elektrokompetente lagre, vælge transformerede kolonier, bekræfte transformation via kolonipolymerasekædereaktion (PCR) og måle designet systemrespons via fluorescerende reporterproteiner.
Vi bemærker, at relaterede protokoller har dækket CRISPR-Cas9-assisteret ssDNA-genomrekombinering i L. reuteri (stamme: ATCC-PTA-6475)14 og CRSIPR-Cas9 nickase-assisteret genomredigering i flere ikke-L. reuteri, Lactobacillaceae familie pletter15,16; Disse adresserer imidlertid ikke L. reuteri DSM20016 stamme, som er vores fokus her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af L. reuteri DSM20016 elektrokompetente celler
BEMÆRK: Dette er baseret på en protokol af Berthier et al.17, med centrifugeringshastigheder informeret af Rattanachaikunsopon et al.18.
- I et 50 ml centrifugerør podes L. reuteri fra glycerollager i 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS) bouillon. Der inkuberes aerob natten over ved 37 °C i en statisk inkubator.
- Næste morgen podes 4 ml af natkulturen i 200 ml MRS-bouillon (1:50 fortynding).
- Lad det vokse aerob i en statisk 37 °C inkubator, indtil 600 nm optisk densitetsværdi (OD600) når 0,5-0,85; Dette skal tage ca. 2-3 timer.
- Så snart en passende OD600-værdi er nået, dekanteres mediet i 50 ml centrifugerør og anbringes på is, mens rørene afbalanceres.
- Der centrifugeres i 5 minutter ved 5.000 x g i en forkølet centrifuge på 4 °C.
- Supernatanten kasseres, hver pellet resuspenderes i 50 ml forkølet (0 °C til 4 °C) ddH2O, og centrifugeres igen med samme indstillinger som det foregående trin. Hold cellerne på is så meget som muligt.
- Gentag trin 1.6.
- Hver pellet resuspenderes i 25 ml ddH2O: 0,5 M saccharose, 10% glycerol. Der centrifugeres ved 5.000 x g ved 4 °C i 10 min. Supernatanten kasseres, og cellerne lægges på is igen.
- Resuspender alle pellets i samme 2 ml ddH2O: 0,5 M saccharose, 10% glycerol.
- Alikvote i portioner på 50 μl til 100 μl i forkølede mikrocentrifugeglas; opbevares ved -80 °C til senere brug.
2. Elektroporation af L. reuteri
BEMÆRK: Undgå pipettering så meget som muligt i de følgende trin. Inkludering af en kontrolelektroporation, uden plasmid tilsat, anbefales for at sikre, at antibiotikaudvælgelsen er tilstrækkelig.
- Tag en hel elektrokompetent L. reuteri aliquot og tø den op på is.
- Bland forsigtigt 5 μL til 10 μL plasmid (endelig plasmidkoncentration >6 nM) i den optøede delprøve, idet pipettering så vidt muligt undgås.
- Overfør til en iskølet elektroporationskuvette med 1 mm mellemrum.
- Elektroporat ved 1,25 kV, 400 Ω og 25 μF.
- Tilsæt 1 ml stuetemperatur (RT) MRS bouillon og bland ved at vende kuvetten en eller to gange.
- Kuvetterne anbringes i en statisk inkubator ved 37 °C i 2,5-3 timer for at muliggøre restitution.
- Hele mængden anbringes på flere MRS-agarplader med passende valg.
- Anbring pladerne i en helt lufttæt beholder med et lille tændt stearinlys ("fyrfadslys") og en anaerob atmosfæregenererende pose.
- Voks ved 37 °C i 2-3 dage, eller indtil synlige kolonier er til stede.
3. Måling af det syreresistente fluorescerende reporterprotein mCherry2
- Vælg eventuelle kolonier, der kræves til måling, og pod i en 96-brønds opbevaringsmikroplade med 1,5 ml filtersteriliseret (ikke-autoklaveret) MRS-bouillon pr. Brønd og et passende udvalg af antibiotika.
- Der inkuberes aerob i 24 timer natten over ved 37 °C uden omrystning.
BEMÆRK: Denne opbevaringsmikroplade skal opbevares til brug i afsnit 4 (koloni-PCR). - L. reuteri udfældes ud af mediet, når det er i den stationære fase; Resuspender natkulturen via pipettering.
- Overfør 200 μL til en flad, klarbundet plade med 96 brønde, overfør pladen til en pladelæser, og mål OD og fluorescens af mCherry2 (excitation [Ex]: 589 nm; emission [Em]: 610 nm) eller andre relevante reportere.
4. Bekræftelse af plasmidoptagelse via koloni-PCR
- Fra mikropladen med 96 brønde opbevaring fra sektion 3 overføres 5 μL til et PCR-rør.
BEMÆRK: Hvis der er gået >5 minutter, kan det være nødvendigt at resuspendere L. reuteri en anden gang. - I en bærbar bordmikrocentrifuge drejes ned, indtil pelleten kan ses (ca. 2 min ved 2.000 x g), supernatanten kasseres, og pelleten resuspenderes i 20 μL 20 mM NaOH.
- Kog ved 95 °C i 5 min, hvirvelstrøm, og gentag kogningen en anden gang.
- Prøverne afkøles straks; prøv at holde prøverne på is så meget som muligt i de følgende trin for at mindske sandsynligheden for skabelonnedbrydning og PCR-hæmning.
- Spin ned i en bærbar bordmikrocentrifuge ved 2.000 x g i 2 minutter, indtil celleaffaldet er pelleteret, tag derefter 1 μL supernatant og fortynd til 99 μL iskold DNase- og RNasefri ddH2O (100x fortynding).
- Brug 100x fortynding som skabelon-DNA i en standard PCR-reaktion ved anvendelse af plasmidspecifikke primere. Inkluder en positiv kontrol med et plasmid afledt af E. coli mini-prep.
- Returner prøverne på is og tilsæt et passende farvestof i en koncentration på 1x.
- Der køres 1% agarosegel i TAE-buffer (tris-acetat-ethylendiamintetraeddikesyre [EDTA]) ved 110 V i 30 min. Billede om nødvendigt.
5. Mini-prep-protokol for L. reuteri efterfulgt af PCR for at bekræfte plasmidtilstedeværelse
BEMÆRK: Protokol beregnet til brug med mini-prep-sættet, der er anført i materialetabellen.
- L. reuteri podes i 10 ml MRS-bouillon, der indeholder et passende antibiotikum, og inkuberes aerob natten over ved 37 °C i en statisk inkubator.
- Der centrifugeres ved 5.000 x g i 10 minutter i en forkølet centrifuge på 4 °C.
- Pelleten vaskes i 2 ml standard P1-buffer (følger med sættet) for at ophæve surhedsgraden, der kan forstyrre senere trin, centrifugeres med samme indstilling som tidligere beskrevet, og supernatanten kasseres.
- Pellet resuspenderes i 250 μL modificeret P1-buffer indeholdende 10 mg/ml lysozym og 100 E/ml mutanolysin for at lysere bakterieceller. Der inkuberes i 1-2 timer ved 37 °C.
- Tilsæt 250 μL buffer P2, bland ved at invertere fire til seks gange og inkuber ved RT i højst 5 minutter.
- Tilsæt 350 μL buffer N3 (inkluderet i sættet) og vend straks fire til seks gange forsigtigt for at blande.
- Der centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min.
- Så meget supernatant som muligt overføres til en centrifugeringskolonne og centrifugeres ved 10.000 x g i 60 s. Kassér gennemløbet.
- Centrifugeringskolonnen vaskes med 500 μL buffer PB (følger med sættet) og centrifugeres ved 10.000 x g i 60 sekunder. Kassér gennemløbet.
- Centrifugeringskolonnen vaskes med 750 μL buffer PE (følger med sættet), og centrifugeres ved 10.000 x g i 60 sekunder. Gennemstrømningen kasseres, og centrifugeres i 60 s for at fjerne eventuel resterende buffer.
- Centrifugeringssøjlen anbringes i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Påfør 20-30 μL DNAse- og RNAse-fri ddH 2 O på centrifugeringssøjlens filter og lad det stå i1-2minutter, før det centrifugeres ved 10.000 x g i 60 s.
- Udfør en standard PCR-reaktion ved hjælp af plasmidspecifikke primere (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), hvor eluat tilvejebringer skabelon-DNA'et. Inkluder en positiv kontrol med et plasmid afledt af E. coli mini-prep.
BEMÆRK: PCR-indstillingerne, der anvendes i denne undersøgelse, er: 98 °C i 5 minutter (98 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 72 °C i 45 sekunder) 30 cyklusser, 72 °C i 2 minutter, 4 °C hold. Parametrene er meget afhængige af den anvendte polymerase, fragmentlængde og nøjagtige primere, der anvendes af enhver person, der bruger denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv transformation
L. reuteri kræver ikke et dcm-/moder-ikke-methyleret plasmid, som observeret for andre Lactobacillaceae19,20 (se figur 1). Elektroporation af L. reuteri DSM20016 med 10 μL af 8,5 kb plasmid pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 theta replikationsoprindelse) bør give transformationseffektivitet på ca. 80 kolonidannende enheder (CFU)/μg (fem til otte kolonier pr. 200 μL belagt), uanset plasmidmethyleringstilstanden. Med selektiv hærdning og retransformation er det muligt at opnå muterede L. reuteri-stammer med langt større transformationseffektivitet21, observeret med pTRKH3_mCherry2 på ca. 4 x 103 CFU/μg (200-250 kolonier pr. 200 μL belagt), hvilket giver mulighed for applikationer med højere kapacitet. Lignende resultater blev også observeret for reporteren mTFP1. Transformationer blev også udført med pNZ123 (pSH71 rullende cirkeloprindelse), der ikke bærer noget eksogent konstitutivt reporterprotein, hvilket resulterede i transformationseffektivitet på 3 x 104 CFU/μg DNA (supplerende figur 1).
Figur 1: Elektroporationseffektivitet. I alt 10 nM pTRKH3_mTFP1 og 80 nM pTRKH3_mCherry2 plasmidbestande blev opnået fra to kilder: DH10β E. coli og dcm-/dam-methylase knockout E. coli. L. reuteri blev derefter elektroporeret med 10 μL af de to forskellige methyleringsmønsterplasmider, og kolonierne tælles. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Vækstbetingelser for transformation
L. reuteri er aerotolerant og kan dyrkes i bouillon og på agar under normale atmosfæriske forhold. Imidlertid afhænger transformationssucces stærkt af dannelsen af et anaerob vækstmiljø, når det belægges; Det er måske den vigtigste forudsætning for transformationssucces. O2 lækager kan detekteres ved at inkludere en plade af ikke-transformeret L. reuteri. Kolonimorfologi ændrer mærkbart i tilstedeværelsen af ilt (se figur 2); alternativt kan anaerobe indikatorer anvendes (se materialetabel).
Figur 2: L. reuteri kolonimorfologi. Kolonier transformeret med det pTRKH3_mCherry2 plasmid. (A) Under korrekte forhold med lavO2 ser kolonier hvide, uigennemsigtige, glatte, runde, konvekse og skinnende ud. (B) Under delvise eller utætteO2-forhold fremstår kolonier hvide, uigennemsigtige, undulate (bølgede), runde, umbonate (afrundede / knobby) og skinnende. C) L. reuteri-kolonier uden plasmidtransformation under atmosfæriskeO2-niveauer . Kolonierne fremstår enten uigennemsigtige eller gennemskinnelige og enten umbonate eller flade; De ser altid lobate, runde og tørre ud. Klik her for at se en større version af denne figur.
Reporter protein måling
Vildtype L. reuteri DSM20016 reporterproteinekspression og vækst varierer mellem kolonier (se figur 3A), hvilket gør nøjagtige fradrag på systemaktivitet vanskelige. Det er muligt at vælge og helbrede korrekt transformeret vildtype L. reuteri DSM20016; Retransformation kan give anledning til belastninger med mutationer, der muliggør større transformationseffektivitet. En stamme udviklet via denne metode syntes langt mere stabil med hensyn til reporterproteinekspression (se figur 3B). Det tilrådes, at sådanne mutationer søges via plasmidhærdning og retransformation, inden der udføres arbejde, der kræver tunet proteinekspression.
Figur 3: Vækst, rapporterer fluorescens og koloni PCR-resultater for transformeret L. reuteri. Begge eksperimenter bruger pTRKH3_mCherry2 plasmid ved 80 nM. (A,B) Hver kolonne på tværs af hvert af de tre delområder henviser til den samme kolonis OD-værdi, fluorescensværdi (Ex: 589 nm; Em: 610 nm) og PCR-resultat (solid blok angiver korrekt observeret bånd). (A) Alle kolonier fra L. reuteri DSM20016 transformation plukket (kontroltransformation = nul kolonier). Kolonier inkuberet i filtreret MRS-bouillon i 24 timer før måling ved forstærkning 100. (B) I alt 88 kolonier udvalgt fra L. reuteri DSM20016 stamme udvalgt for højere transformationseffektivitet, mere konsistent reporterproteinproduktion og lavere PCR-hæmning (kontroltransformation = nul kolonier). Kolonier inkuberet i filtreret MRS-bouillon i 24 timer før måling ved forstærkning 200. Kontrollerne er i blåt, C = ikke-transformeret DSM20016 cellekontrol, M = filtreret MRS-bouillon kun mediekontrol, og fejlbjælker angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Koloni PCR
Colony PCR bør ikke anvendes som det eneste middel til at udlede korrekt transformation, da de kan være upålidelige, selv når prøverne fortyndes og holdes nedkølede (se figur 4). Hvis den ikke-plasmidkontrol, der er inkluderet i transformationer, udviser nulkolonier, indebærer det, at alle kolonier har plasmidet, der bærer antibiotikaresistens. Men hvis koloni PCR er påkrævet, kan de optimerede betingelser, der er angivet her, i høj grad øge succesen.
Figur 4: Koloni PCR af transformeret L. reuteri. (A) L. reuteri DSM20016 kolonier blev screenet for positive PCR-bånd; seks blev opnået og podet i frisk autoklaveret MRS-bouillon. Prøver på 5 μL taget på forskellige tidspunkter efter podning blev igen PCR ved de angivne fortyndingsniveauer. Farver i hver gang/fortyndingsboks angiver succesen med PCR-gendannelsen: grøn = korrekt bånd observeret; rød = intet bånd observeret. (B) Resultaterne for en fast 100x fortynding viser, at varierende tilberedningstemperatur resulterede i forskellige PCR-succeshastigheder: prøver blev forberedt på is og PCR-ed straks (89,77%), tilberedt ved stuetemperatur og PCR-ed straks (75%) eller forberedt ved RT og derefter inkuberet ved 37 °C i 30 minutter før PCR (27,27%). (C) (1) Otte positive 100x fortyndingsprøver (R1-8) fra RT-tilstanden. (2) Efter at have været efterladt ved RT i 48 timer, blev prøverne PCR-ed en anden gang, hvilket viste et fravær af båndene ved ~ 1,1 kb; positive og negative kontroller (baner +/-) er de mest højre baner i C (2). Den anvendte stige var 1 kb plus DNA-stigen, der er anført i materialetabellen. Klik her for at se en større version af denne figur.
L. reuteri mini-prep
Mini-prep for L. reuteri er begrænset og kun beregnet som en alternativ plasmidtransformationsbekræftelsesmetode. En tidligere publikation bemærkede, at nogle stammer lyseres mere effektivt af mutanolysin22; dobbelt lysozym-mutanolysin virkning blev fundet at være den mest effektive for L. reuteri DSM20016. Kørsel af mini-prep eluat gennem en agarosegel resulterer i et udtværing snarere end observerbare bånd. Efterfølgende PCR bør dog producere forventede båndstørrelser (se figur 5).
Figur 5: Agarosegelelektroforese af PCR- og mini-prep-produkter. De samme seks kolonier fra figur 4A blev mini-prepped ved hjælp af protokollen beskrevet i dette papir. (Nederste række) Mini-prep eluate viser en udtværing. (Øverste række) Efter PCR blev udført ved anvendelse af elueringsmidlet som DNA-skabelon, observeres klare positive bånd. Den anvendte stige var 1 kb plus DNA-stigen, der er anført i materialetabellen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Transformationseffektivitet af L. reuteri DSM20016 med pNZ123 plasmid. Transformationer udført med pNZ123 (pSH71 rullende cirkeloprindelse), der ikke bærer noget eksogent konstitutivt reporterprotein. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: CAD-filer til anaerobe kamre. Ark 1: Grundtegning; Ark 2: Lang vægtegning; Ark 3: Lille vægtegning; Ark 4: Toptegning; Ark 5: Lågtegning; Ark 6: Lås læbetegning; Ark 7: Tegning af klemmestang; Ark 8: Klemmepladetegning; Ark 9: Oversigt over samling; Ark 10: Oversigt med nummererede dele. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trin for transformationen af L. reuteri DSM20016 er dannelsen af anaerobe vækstbetingelser efter transformationer er belagt; kolonier opnået under aerobe forhold er kun meget lejlighedsvise og vokser generelt ikke, når de podes i MRS-bouillon. Plating hele genopretningsvolumenet bør også praktiseres for at maksimere sandsynligheden for kolonivækst. Selv med disse to kritiske trin er transformationseffektivitet stadig en begrænsning for eksperimentering, da forventede kolonier kan tælle så lavt som en eller to pr. plade under transformationer (se figur 1).
Der blev oprindeligt anvendt kommercielle fødevarebeholdere, som viste sig at være utilstrækkelige til konsekvent udelukkelseaf O2. CAD-filer til anaerobe kamre designet af universitetets maskinværksted findes i supplerende fil 1. Da disse kasser lejlighedsvis kan have luftinfiltration gennem små huller i snedkerarbejde, anbefales det at fylde dem med vand (uforseglet) for at kontrollere eventuelle lækager inden første brug; Efterfølgende kontrol er normalt ikke nødvendig. Disse kasser skal have O2-udskiftningssystemer i stedet forO2-sekvestreringssystemer, da de ikke er testet for tryk.
Der kan opstå medieproblemer; autoklaveret MRS-bouillon er selektiv, men har meget autofluorescerende egenskaber, hvilket hæmmer målingen af lave fluorescerende aflæsninger. Ændring til brug af filtersteriliseret MRS-bouillon forbedrer dette problem, men er mindre selektiv. L. reuteri sænker mediets pH til omkring pH 4 efter 24 timer (se figur 6), så mediet kræver buffering for at detektere syrefølsom GFP23. Vi har ændret denne protokol til at bruge mere syrebestandig mCherry2 i stedet for at undgå dette problem.
Figur 6: pH over tid af L. reuteri i MRS bouillon. L. reuteri DSM20016 sænker pH over tid (stiplede linje); pKa-værdien angiver den pH, hvor reporterproteinfluorescensen ville være 50% af den maksimale værdi på grund af surhed (vandrette linjer). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Hvert reporterprotein har reportereffektivitet reduceret til 50% af den maksimale fluorescens på forskellige tidspunkter på grund af deres syrefølsomhed, når de produceres inden for stadig surere L. reuteri (lodrette linjer). Klik her for at se en større version af denne figur.
L. Reuteri DSM20016 ser ud til at hæmme koloni-PCR-indsatsen, hvilket alvorligt begrænser nytten af denne procedure. Så lidt som 30 minutter ved 37 °C efter trin 4.3 kan øge PCR-fejlraten, mens 48 timer ved RT resulterer i fuldstændig PCR-fejl (se figur 4B,C). Ændringen for at fortynde prøverne og holde prøverne på is til enhver tid er afgørende for at øge koloniens PCR-succes.
Meget forbliver ukendt om L. reuteri DSM20016 interne funktioner. Transformationskontrolplader uden plasmid tilsat under elektroporation, der viser nulkolonier, bør indebære, at alle kolonier, der er til stede i plasmidtilstanden, besidder plasmidet. Imidlertid har efterfølgende koloni-PCR vist sig ikke pålideligt at bekræfte plasmidoptagelse, selv med ændringer. Dette kan skyldes restriktionsendonukleaser, der nedbryder PCR-DNA-fragmenter. Endonukleaser er blevet fundet i andre Lactobacillaceae arter og overvinde ved brug af dæmning-/dcm-E.coli 19,20. L. Reuteri DSM20016 har flere formodede restriktionsmodifikationsenzymer kommenteret via beregningsanalyse24. Transformationseffektiviteten af DSM20016 kunne potentielt øges yderligere, hvis dets restriktionsmodifikations- (RM) enzymgenkendelsessteder kunne karakteriseres og undgås. Der er behov for yderligere undersøgelser.
Den modificerede elektroporationsmetode, der er beskrevet i dette papir, tilbyder et mindre komplekst og mere moderne alternativ til en metode, der tidligere er beskrevet for L. reuteri DSM20016 af Ahrne et al.25. Dette papir undersøger væsentlige bestemmelser fremsat af Ahrne et al. vedrørende dæmnings-/dcm-methyleringskrav til plasmidoptagelse, som ikke er blevet bekræftet. Transformationsmetoden, der er beskrevet i dette papir, understreger også det kritiske anaerobe vækstbehov efter plettering, ikke eksplicit formidlet af Ahrne et al.
Nogle metoder og tilgange, der er beskrevet heri, kan bruges i fremtidige applikationer til at hjælpe andre Lactobacillaceae familie manipulation forsøg, især: inkludering af transformation kontrolplader, brug af syre-resistente reporter mCherry2, koloni PCR temperatur krav, og mini-prep mutanolyse inklusion. Nogle kan dog stadig have brug for ændringer for at fungere optimalt i andre stammer.
L. Reuteri DSM20016 er af klinisk og landbrugsmæssig betydning på grund af dets position ikke kun som et generisk hvirveldyrs kommensal (med potentielle anvendelser som tilsætningsstof i husdyrfoder), men også som en af et meget lille antal Lactobacillaceae-familiestammer, der er iboende forbundet med det menneskelige tarmmiljø8. Effektiv manipulation af denne mikrobe vil åbne den som et chassis for fremtidig levering af nye terapier i mave-tarmkanalen og ikke-invasiv overvågning af inflammatoriske tilstande. I denne artikel er disse metoder eksplicit blevet samlet og samlet demonstreret med modifikationer for specifikt den ikke-model L. reuteri stamme DSM20016.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi sætter stor pris på det værdifulde råd fra professor J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), hvis vejledning om at arbejde med L. reuteri ATCC PTA 6475 gav et fundament for de metoder, der er beskrevet her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F.
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P.
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M.
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
