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Bioengineering

लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी में इलेक्ट्रोपोरेशन और ट्रांसफॉर्मेशन कन्फर्मेशन के तरीके DSM20016

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65463
Automatic Translation
1, 1
1University of Toronto Mississauga

Summary

यहां, हम लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी DSM20016 के साथ काम करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, विकास, प्लास्मिड परिवर्तन, कॉलोनी पीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन माप, और सीमित प्लास्मिड मिनी-प्रेप, साथ ही साथ सामान्य मुद्दों और समस्या निवारण का विवरण देते हैं। ये प्रोटोकॉल DSM20016 में रिपोर्टर प्रोटीन के माप, या कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से पुष्टि करने की अनुमति देते हैं यदि कोई रिपोर्टर शामिल नहीं है।

Abstract

लैक्टोबैसिलस बैक्टीरिया का एक अविश्वसनीय रूप से बड़ा, विविध जीनस था जिसमें 261 प्रजातियां शामिल थीं, जिनमें से कई गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के भीतर सिंथेटिक जैविक प्रयासों के लिए चेसिस के रूप में उपयोग की क्षमता के साथ कॉमेंसल उपभेद थे। जीनस के भीतर देखे गए व्यापक फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक भिन्नता ने हाल ही में पुनर्वर्गीकरण और 23 उपन्यास जेनेरा की शुरूआत की।

पुराने जेनेरा के भीतर भिन्नताओं की चौड़ाई के कारण, एक सदस्य में प्रदर्शित प्रोटोकॉल अन्य सदस्यों के साथ विज्ञापित के रूप में काम नहीं कर सकते हैं। विशिष्ट उपभेदों में हेरफेर करने के तरीके पर केंद्रीकृत जानकारी की कमी ने तदर्थ दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला को जन्म दिया है, जो अक्सर अन्य जीवाणु परिवारों से अनुकूलित होते हैं। यह क्षेत्र में शुरू होने वाले शोधकर्ताओं के लिए मामलों को जटिल कर सकता है, जो यह नहीं जान सकते हैं कि कौन सी जानकारी उनके चुने हुए तनाव पर लागू होती है या नहीं।

इस पेपर में, हम प्रदर्शित सफलता के साथ प्रोटोकॉल के एक सेट को केंद्रीकृत करने का लक्ष्य रखते हैं, विशेष रूप से लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी स्ट्रेन पदनाम एफ 275 (अन्य संग्रह संख्या: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), समस्या निवारण सलाह और सामान्य मुद्दों के साथ। इन प्रोटोकॉल को एक शोधकर्ता को एक प्लास्मिड को बदलने, परिवर्तन की पुष्टि करने और रिपोर्टर प्रोटीन के माध्यम से प्लेट रीडर में सिस्टम प्रतिक्रिया को मापने के लिए एल रियूटेरी DSM20016 के साथ काम करने का बहुत कम अनुभव होना चाहिए।

Introduction

जीनस लैक्टोबैसिलस को ऐतिहासिक रूप से ग्राम-पॉजिटिव, रॉड के आकार के, गैर-बीजाणु बनाने वाले के रूप में वर्गीकृत किया गया था, या तो संकाय एनारोबेस या माइक्रोएरोफाइल जो मुख्य रूप से लैक्टिक एसिड1 का उत्पादन करने के लिए शर्करा को तोड़ते हैं। इन ढीले मानदंडों ने लैक्टोबैसिलस , फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक रूप से, एक अत्यंत विविध जीनस होने का नेतृत्व किया। इस व्यापक वर्गीकरण के परिणामस्वरूप जीनस को फिर से वर्गीकृत किया गया, 20202 में 23 उपन्यास जेनेरा पेश किए गए।

पुराने, व्यापक जीनस में प्रमुख कॉमेंसल और प्रोबायोटिक प्रजातियां शामिल थीं जिन्हें आम तौरपर खपत के लिए सुरक्षित (जीआरएएस) माना जाता था। लैक्टोबैसिलेसी परिवारविभिन्न उपभेदों 4,5,6,7 के सेवन के माध्यम से दिए गए कई स्वास्थ्य लाभों के कारण 'अच्छे बैक्टीरिया' होने की सार्वजनिक धारणा बनाए रखता है। जिस आसानी से वे जठरांत्र संबंधी मार्ग8 और उनकी सार्वजनिक स्वीकृति को नेविगेट कर सकते हैं, वह लैक्टोबैसिलेसी उपभेदों को चेसिस जीवों के रूप में मजबूत उम्मीदवारों के रूप में स्थापित करने के लिए गठबंधन करता है।

लैक्टोबैसिलेसी परिवार के भीतर मौजूद विशेषताओं की विस्तृत श्रृंखला ने एक ऐसी स्थिति को जन्म दिया है जिसमें कोई वास्तविक मॉडल-जीव तनाव नहीं है; अनुसंधान समूहों ने अपने विशेष उद्देश्यों के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक गुणों के साथ प्रजातियों का चयन करने का प्रयास किया है। (उदाहरण के लिए, डेयरी किण्वन प्रयोगशालाएं एल लैक्टिस चुन सकती हैं; सब्जी किण्वन के अध्ययन एल प्लांटरम का चयन कर सकते हैं; प्रोबायोटिक्स पर शोध एल एसिडोफिलस पर ध्यान केंद्रित कर सकता है; और इसी तरह।

प्रजातियों में विशेषताओं की इस एक ही विस्तृत श्रृंखला ने प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं के संचय को जन्म दिया है जो लैक्टोबैसिलेसी परिवार के एक उप-समूह के लिए अच्छी तरह से काम कर सकते हैं,लेकिन दूसरों में कुशलता से काम करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है (या शायद बिल्कुल भी कार्य करने के लिए)। परिवार के सदस्यों के बीच और यहां तक कि एक ही प्रजाति के सदस्यों के भीतर अनुकूलन की यह आवश्यकता अपरिचित शोधकर्ताओं के प्रयासों को निराश कर सकती है। कागजात के विधि अनुभागों में प्रकाशित प्रोटोकॉल में उनके स्वयं के संशोधनभी शामिल हो सकते हैं, जिससे खंडित, विकेन्द्रीकृत प्रोटोकॉल संग्रह हो सकते हैं।

रेउटेरी को एक व्यापक रूप से कशेरुक ी कमेंसल माना जाता है, जो स्तनधारी, एवियन11 और मछली12 गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) ट्रैक्ट में लगातार पाया जाता है। रेयूटेरी उप-उपभेदों को अक्सर आनुवंशिक रूप से विशिष्ट किया जाता है, बलगम आसंजन प्रोटीन अनुकूलन के माध्यम से, विशिष्टमूल मेजबानों को अधिक स्थायी रूप से उपनिवेशित करने के लिए 8,11,13। जीआई पथ लिमोसिलेक्टोबैसिलस प्रजातियों को उनके मूल मेजबान के बाहर मेजबानों में अलग किया जा सकता है, लेकिन क्षणिक प्रकृतिकी ओर अधिक होता है।

मानव-मेजबान विशेषज्ञता के कारण, एल रेयूटेरी DSM20016 मानव जीआई पथ में किसी भी बिंदु पर नैदानिक या चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए चेसिस के रूप में खुद को बहुत अच्छी तरह से रखता है, और तनाव DSM20016 अधिक क्षणभंगुर उपभेदों की तुलना में हस्तक्षेप के लिए प्रभाव की एक लंबी खिड़की प्रदान कर सकता है।

इस पेपर में, हम आणविक और सिस्टम जीव विज्ञान अनुप्रयोगों में सहायता के लिए अन्य स्रोतों से तनाव पर केंद्रीकृत जानकारी के साथ-साथ लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी (तनाव पदनाम: एफ 275; अन्य संग्रह संख्या: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) में प्रदर्शित प्रभावशीलता के साथ प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला को रेखांकित करते हैं। यहां निर्धारित प्रक्रियाओं को एक शोधकर्ता को एल रियूटेरी को कल्चर करने, इलेक्ट्रोसक्षम स्टॉक बनाने, रूपांतरित कॉलोनियों का चयन करने, कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से परिवर्तन की पुष्टि करने और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के माध्यम से डिज़ाइन की गई सिस्टम प्रतिक्रिया को मापने में सक्षम बनाना चाहिए।

हम ध्यान दें कि संबंधित प्रोटोकॉल ने सीआरआईएसपीआर-कैस 9 सहायता प्राप्त एसएसडीएनए जीनोम रीकंबाइनिंग को एल रियूटेरी (स्ट्रेन: एटीसीसी-पीटीए-6475)14 में कवर किया है, और सीआरएसआईपीआर-कैस 9 निकस-असिस्टेड जीनोम एडिटिंग में कई गैर-एल में शामिल हैं। हालांकि, ये एल रियूटेरी DSM20016 तनाव को संबोधित नहीं करते हैं जो यहां हमारा ध्यान केंद्रित है।

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Protocol

1. इलेक्ट्रोसक्षम कोशिकाओं DSM20016 एल रियूटेरी तैयार करना।

नोट: यह बर्थियर एट अल.17 द्वारा एक प्रोटोकॉल पर आधारित है, जिसमें रत्तानाचाईकुनसोपोन एट अल द्वारा सूचित सेंट्रीफ्यूजेशन गति है।18.

  1. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, ग्लिसरॉल स्टॉक से एल रियूटेरी को 6 एमएल डीमैन रोगोसा शार्प (एमआरएस) शोरबा में टीका लगाएं। एक स्थिर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एरोबिक रूप से इनक्यूबेट करें।
  2. अगली सुबह, रात भर की 4 मिलीलीटर को 200 मिलीलीटर एमआरएस शोरबा (1:50 कमजोर पड़ने) में टीका लगाएं।
  3. एक स्थिर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एरोबिक रूप से बढ़ने की अनुमति दें जब तक कि 600 एनएम ऑप्टिकल घनत्व मान (ओडी 600) 0.5-0.85 तक न पहुंच जाए; इसमें लगभग 2-3 घंटे लगने चाहिए।
  4. जैसे ही पर्याप्त OD600 मान तक पहुंच जाता है, मीडिया को 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें और ट्यूबों को संतुलित करते हुए बर्फ पर रखें।
  5. एक पूर्व-ठंडा, 4 डिग्री सेल्सियस सेंट्रीफ्यूज में 5,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  6. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, प्रत्येक गोली को 50 मिलीलीटर प्री-चिल्ड (0 डिग्री सेल्सियस से 4 डिग्री सेल्सियस) डीडीएच2ओ में फिर से निलंबित करें, और पिछले चरण के समान सेटिंग्स के साथ फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। जितना हो सके कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
  7. चरण 1.6 दोहराएँ।
  8. प्रत्येक गोली को 25 मिलीलीटर डीडीएच2ओ: 0.5 एम सुक्रोज, 10% ग्लिसरॉल में पुन: निलंबित करें। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और कोशिकाओं को वापस बर्फ पर रखें।
  9. डीडीएच 2 ओ: 0.5 एम सुक्रोज, 10% ग्लिसरॉल के समान2एमएल में सभी छर्रों को पुन: निलंबित करें।
  10. प्री-चिल्ड माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 50 μL से 100 μL भागों में एलिकोट; बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एल रियूटेरी का इलेक्ट्रोपोरेशन

नोट: निम्नलिखित चरणों में जितना संभव हो उतना पाइपिंग से बचें। एंटीबायोटिक चयन पर्याप्त है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई प्लास्मिड नहीं जोड़ा गया है, एक नियंत्रण इलेक्ट्रोपोरेशन को शामिल करने की सलाह दी जाती है।

  1. एक संपूर्ण इलेक्ट्रोसक्षम एल रियूटेरी एलिकोट लें और इसे बर्फ पर पिघलाएं।
  2. धीरे-धीरे पिघले हुए एलिकोट में प्लास्मिड के 5 μL से 10 μL (अंतिम प्लास्मिड एकाग्रता >6 एनएम) मिलाएं, जितना संभव हो उतना पाइपिंग से बचें।
  3. एक बर्फ-ठंडा, 1 मिमी अंतर इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
  4. 1.25 केवी, 400 Ω और 25 μF पर इलेक्ट्रोपोरेट।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) एमआरएस शोरबा के 1 मिलीलीटर जोड़ें और क्यूवेट को एक या दो बार घुमाकर मिलाएं।
  6. रिकवरी की अनुमति देने के लिए क्यूवेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थिर इनक्यूबेटर में रखें।
  7. उचित चयन के साथ पूरी राशि को कई एमआरएस एगर प्लेटों पर प्लेट करें।
  8. प्लेटों को एक छोटी जलती हुई मोमबत्ती ("टीलाइट") और एक एनारोबिक वातावरण पैदा करने वाले पाउच के साथ पूरी तरह से एयरटाइट कंटेनर के अंदर रखें।
  9. 2-3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें या जब तक दिखाई देने वाली कॉलोनियां मौजूद न हों।

3. एसिड प्रतिरोधी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन एमचेरी 2 का माप।

  1. माप के लिए आवश्यक किसी भी कॉलोनी को चुनें और 1.5 मिलीलीटर फिल्टर स्टरलाइज्ड (गैर-आटोक्लेव) एमआरएस शोरबा और एक उपयुक्त चयन एंटीबायोटिक के साथ 96-वेल स्टोरेज माइक्रोप्लेट में टीका लगाएं।
  2. बिना हिलाए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 24 घंटे के लिए एरोबिक रूप से इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस स्टोरेज माइक्रोप्लेट को धारा 4 (कॉलोनी पीसीआर) में उपयोग के लिए रखा जाना चाहिए।
  3. स्थिर चरण में होने पर एल रेउटेरी मीडिया से बाहर निकल जाएगा; पाइपिंग के माध्यम से रातोंरात संस्कृति को फिर से निलंबित करें।
  4. 200 μL को एक सपाट, स्पष्ट-तल, 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें, प्लेट को प्लेट रीडर में स्थानांतरित करें, और mCherry2 (उत्तेजना [उदा]: 589 nm; उत्सर्जन [Em]: 610 nm) या अन्य प्रासंगिक संवाददाताओं के OD और प्रतिदीप्ति को मापें।

4. कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से प्लास्मिड अपटेक की पुष्टि

  1. अनुभाग 3 से 96-वेल स्टोरेज माइक्रोप्लेट से, 5 μL को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: यदि >5 मिनट बीत चुके हैं, तो एल रेयूटेरी को दूसरी बार फिर से निलंबित करना आवश्यक हो सकता है।
  2. एक पोर्टेबल बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में, गोली को देखने तक नीचे की ओर घुमाएं (लगभग 2 मिनट 2,000 x g पर), सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और 20 mM NaOH के 20 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, भंवर, और फोड़े को दूसरी बार दोहराएं।
  4. तुरंत नमूने ठंडा करें; टेम्प्लेट क्षरण और पीसीआर निषेध की संभावना को कम करने के लिए निम्नलिखित चरणों में नमूनों को बर्फ पर जितना संभव हो उतना रखने की कोशिश करें।
  5. एक पोर्टेबल बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 2 मिनट के लिए 2 मिनट के लिए नीचे घुमाएं जब तक कि सेल मलबे को गोली न लग जाए, फिर सतह पर तैरने वाला 1 μL लें और बर्फ-ठंडे DNase- और RNase-मुक्त ddH2O (100x कमजोर पड़ने) के 99 μL में पतला करें।
  6. प्लास्मिड-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया में टेम्पलेट डीएनए के रूप में 100x कमजोर पड़ने का उपयोग करें। ई कोलाई मिनी-प्रेप से प्राप्त प्लास्मिड के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें।
  7. बर्फ पर नमूने वापस करें और 1x एकाग्रता पर एक उपयुक्त लोडिंग डाई जोड़ें।
  8. 30 मिनट के लिए 110 वी पर टीएई बफर (ट्राइस-एसीटेट-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड [ईडीटीए]) में 1% एगारोस जेल में चलाएं। यदि आवश्यक हो तो छवि।

5. एल रेयूटेरी के लिए मिनी-प्रेप प्रोटोकॉल, इसके बाद प्लास्मिड उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पीसीआर

नोट: सामग्री तालिका में सूचीबद्ध मिनी-प्रेप किट के साथ उपयोग के लिए प्रोटोकॉल का अभिप्रेत।

  1. एक उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त 10 मिलीलीटर एमआरएस शोरबा में एल रियूटेरी को टीका लगाएं और एक स्थिर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एरोबिक रूप से इनक्यूबेट करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस सेंट्रीफ्यूज में 10 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. पेलेट को मानक पी 1 बफर (किट के साथ शामिल) के 2 मिलीलीटर में धोएं ताकि अम्लता को नकारा जा सके जो बाद के चरणों में हस्तक्षेप कर सकता है, उसी सेटिंग के साथ सेंट्रीफ्यूज करें जैसा कि पहले वर्णित है, और सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  4. बैक्टीरियल कोशिकाओं को निष्क्रिय करने के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल लाइसोजाइम और 100 यू / एमएल म्यूटानोलिसिन युक्त संशोधित पी 1 बफर के 250 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. बफर पी 2 के 250 μL जोड़ें, चार से छह बार इनवर्ट करके मिलाएं, और आरटी पर 5 मिनट से अधिक समय तक इनक्यूबेट न करें।
  6. 350 μL बफर N3 (किट के साथ शामिल) जोड़ें और मिश्रण करने के लिए तुरंत चार से छह बार धीरे से घुमाएं।
  7. 10 मिनट के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. जितना संभव हो उतना सुपरनैटेंट को स्पिन कॉलम में स्थानांतरित करें और 60 सेकंड के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। प्रवाह को छोड़ दें।
  9. स्पिन कॉलम को 500 μL बफर PB (किट के साथ शामिल) और 60 s के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज के साथ धोएं। प्रवाह को छोड़ दें।
  10. स्पिन कॉलम को 750 μL बफर पीई (किट के साथ शामिल) के साथ धोएं, और 60 सेकंड के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। किसी भी अवशिष्ट बफर को हटाने के लिए 60 सेकंड के लिए प्रवाह और सेंट्रीफ्यूज को छोड़ दें।
  11. स्पिन कॉलम को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। स्पिन कॉलम के फिल्टर में DNAS- और RNASE-मुक्त ddH 2 O के 20-30 μL लागू करें और 60 सेकंड के लिए 10,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करने से पहले1-2मिनट के लिए छोड़ दें।
  12. प्लास्मिड-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया करें (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCGTTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATAGAAGACA), जिसमें टेम्पलेट डीएनए प्रदान किया जाता है। ई कोलाई मिनी-प्रेप से प्राप्त प्लास्मिड के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पीसीआर सेटिंग्स हैं: 5 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, (30 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस) 30 चक्र, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड। पैरामीटर इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले किसी भी व्यक्ति द्वारा उपयोग किए जाने वाले पोलीमरेज़, टुकड़े की लंबाई और सटीक प्राइमरों पर अत्यधिक निर्भर हैं।

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Representative Results

परिवर्तन क्षमता
रेयूटेरी को डीसीएम-/डैम-नॉन-मिथाइलेटेड प्लास्मिड की आवश्यकता नहीं होती है, जैसा कि अन्य लैक्टोबैसिलेसी19,20 (चित्रा 1 देखें) के लिए देखा गया है। 8.5 केबी प्लास्मिड pTRKH3_mCherry2 के 10 μL के साथ L. Reuteri DSM20016 का विद्युतीकरण प्लास्मिड मिथाइलेशन स्थिति की परवाह किए बिना लगभग 80 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (CFU)/μg (प्रति 200 μL पर पांच से आठ कॉलोनियों) की परिवर्तन क्षमता प्रदान करना चाहिए। चयनात्मक इलाज और पुन: परिवर्तन के साथ, उत्परिवर्तित एल रियूटेरी उपभेदों को कहीं अधिक परिवर्तन क्षमता21 के साथ प्राप्त करना संभव है, जो लगभग 4 x 103 सीएफयू / μg (200-250 कॉलोनियां प्रति 200 μL प्लेटेड) की pTRKH3_mCherry2 के साथ देखा जाता है, जिससे उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों की अनुमति मिलती है। इसी तरह के परिणाम रिपोर्टर एमटीएफपी 1 के लिए भी देखे गए थे। पीएनजेड 123 (पीएसएच 71 रोलिंग सर्कल मूल) के साथ परिवर्तन भी किए गए थे, जिसमें कोई बहिर्जात संवैधानिक रिपोर्टर प्रोटीन नहीं था, जिसके परिणामस्वरूप 3 x 104 सीएफयू / μg डीएनए की परिवर्तन क्षमता थी (पूरक चित्र 1)।

Figure 1
चित्र 1: इलेक्ट्रोपोरेशन क्षमता। प्लास्मिड स्टॉक के कुल 10 एनएम pTRKH3_mTFP1 और 80 एनएम pTRKH3_mCherry2 दो स्रोतों से प्राप्त किए गए थे: डीएच 10 ई कोलाई और डीसीएम - / रेयूटेरी को तब दो अलग-अलग मिथाइलेशन पैटर्न प्लास्मिड के 10 μL के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और कॉलोनियों की गिनती की गई थी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को दर्शाती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

परिवर्तन की स्थिति
रेउटेरी एयरो-सहिष्णु है और इसे सामान्य वायुमंडलीय परिस्थितियों में शोरबा और आगर पर उगाया जा सकता है। हालांकि, परिवर्तन की सफलता चढ़ाए जाने पर एक एनारोबिक विकास वातावरण की पीढ़ी पर बहुत अधिक निर्भर करती है; यह शायद परिवर्तन की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण शर्त है। ओ2 लीक का पता गैर-रूपांतरित एल रियूटेरी की एक प्लेट को शामिल करके लगाया जा सकता है। कॉलोनी आकृति विज्ञान ऑक्सीजन की उपस्थिति में उल्लेखनीय रूप से परिवर्तन करता है ( चित्र 2 देखें); वैकल्पिक रूप से, एनारोबिक संकेतक का उपयोग किया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

Figure 2
चित्र 2: एल रेयूटेरी कॉलोनी आकृति विज्ञान। pTRKH3_mCherry2 प्लास्मिड के साथ कालोनियां बदल गईं। (ए) गलत कम-ओ2 स्थितियों के तहत, कॉलोनियां सफेद, अपारदर्शी, चिकनी, गोल, उत्तल और चमकदार दिखाई देती हैं। (बी) आंशिक या रिसाव ओ2 स्थितियों के तहत, कॉलोनियां सफेद, अपारदर्शी, लहरदार (लहरदार), गोल, उम्बोनेट (गोल / घुंडी), और चमकदार दिखाई देती हैं। (सी) वायुमंडलीय ओ2 स्तरों के तहत कोई प्लास्मिड परिवर्तन नहीं होने वाली एल रेयूटेरी कॉलोनियां। कॉलोनियां या तो अपारदर्शी या पारभासी दिखाई देती हैं और या तो उभयचर या सपाट होती हैं; वे हमेशा लोबेट, गोल और सूखे दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रिपोर्टर प्रोटीन माप
रिपोर्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति और विकास DSM20016 कॉलोनी के बीच भिन्न होते हैं ( चित्रा 3 ए देखें), जिससे सिस्टम गतिविधि पर सटीक कटौती मुश्किल हो जाती है। सही ढंग से रूपांतरित जंगली-प्रकार एल रियूटेरी DSM20016 का चयन और इलाज करना संभव है; पुन: परिवर्तन उत्परिवर्तन के साथ उपभेदों को जन्म दे सकता है जो अधिक परिवर्तन दक्षता को सक्षम करता है। इस विधि के माध्यम से विकसित एक तनाव रिपोर्टर प्रोटीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में कहीं अधिक स्थिर दिखाई दिया ( चित्रा 3 बी देखें)। यह सलाह दी जाती है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति की आवश्यकता वाले काम को पूरा करने से पहले, प्लास्मिड इलाज और पुन: परिवर्तन के माध्यम से ऐसे उत्परिवर्तन की मांग की जाए।

Figure 3
चित्रा 3: रूपांतरित एल रेयूटेरी के लिए विकास, रिपोर्टर प्रतिदीप्ति और कॉलोनी पीसीआर परिणाम। दोनों प्रयोग 80 एनएम पर pTRKH3_mCherry2 प्लास्मिड का उपयोग करते हैं। (ए, बी) तीन उप-भूखंडों में से प्रत्येक में प्रत्येक कॉलम एक ही कॉलोनी के ओडी मूल्य, प्रतिदीप्ति मूल्य (उदा: 589 एनएम; ईएम: 610 एनएम), और पीसीआर परिणाम (ठोस ब्लॉक देखा गया सही बैंड इंगित करता है)। (ए) एल रियूटेरी से सभी कॉलोनियों DSM20016 परिवर्तन चुना गया (नियंत्रण परिवर्तन = शून्य कॉलोनियां)। 100 से अधिक माप से पहले 24 घंटे के लिए फ़िल्टर किए गए एमआरएस शोरबा में इनक्यूबेट की गई कॉलोनियां। (बी) एल रियूटेरी DSM20016 स्ट्रेन से चुनी गई कुल 88 कॉलोनियों को उच्च परिवर्तन क्षमता, अधिक सुसंगत रिपोर्टर प्रोटीन उत्पादन और कम पीसीआर अवरोध (नियंत्रण परिवर्तन = शून्य कॉलोनियों) के लिए चुना गया था। कॉलोनियों को 200 लाभ पर माप से पहले 24 घंटे के लिए फ़िल्टर किए गए एमआरएस शोरबा में इनक्यूबेट किया जाता है। नियंत्रण नीले रंग में हैं, सी = गैर-रूपांतरित DSM20016 सेल नियंत्रण, एम = फ़िल्टर किए गए एमआरएस शोरबा केवल मीडिया नियंत्रण, और त्रुटि पट्टियां मानक विचलन को दर्शाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

कॉलोनी पीसीआर
कॉलोनी पीसीआर का उपयोग सही परिवर्तन के एकमात्र साधन के रूप में नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे तब भी अविश्वसनीय हो सकते हैं जब नमूने को पतला किया जाता है और ठंडा रखा जाता है ( चित्रा 4 देखें)। यदि परिवर्तनों के साथ शामिल नो-प्लास्मिड नियंत्रण शून्य कॉलोनियों को प्रदर्शित करता है, तो इसका अर्थ है कि सभी कॉलोनियों में एंटीबायोटिक प्रतिरोध ले जाने वाला प्लास्मिड होता है। हालांकि, अगर कॉलोनी पीसीआर की आवश्यकता होती है, तो यहां निर्धारित अनुकूलित स्थितियां सफलता में काफी वृद्धि कर सकती हैं।

Figure 4
चित्र 4: परिवर्तित एल रियूटेरी की कॉलोनी पीसीआर। (ए) एल रियूटेरी DSM20016 कॉलोनियों को सकारात्मक पीसीआर बैंड के लिए जांच की गई थी; छह प्राप्त किए गए और ताजा आटोक्लेव एमआरएस शोरबा में टीका लगाया गया। टीकाकरण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर लिए गए 5 μL के नमूने कमजोर पड़ने के संकेतित स्तरों पर फिर से पीसीआर के अधीन थे। कमजोर पड़ने वाले बॉक्स में रंग पीसीआर रिकवरी की सफलता को इंगित करते हैं: हरा = सही बैंड देखा गया; लाल = कोई बैंड नहीं देखा गया। (बी) एक निश्चित 100 x कमजोर पड़ने के परिणाम बताते हैं कि तैयारी के तापमान में बदलाव के परिणामस्वरूप पीसीआर सफलता की अलग-अलग दर हुई: नमूने बर्फ और पीसीआर-एड पर तुरंत तैयार किए गए (89.77%), कमरे के तापमान पर तैयार किए गए और तुरंत पीसीआर-एड (75%), या आरटी पर तैयार किए गए और फिर पीसीआर (27.27%) से पहले 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए गए। (सी) (1) आरटी स्थिति से आठ सकारात्मक 100 x तनुकरण नमूने (आर 1-8)। (2) 48 घंटे के लिए आरटी पर छोड़े जाने के बाद, नमूनों को दूसरी बार पीसीआर-एड किया गया, जिसमें ~ 1.1 केबी पर बैंड की अनुपस्थिति दिखाई गई; सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण (लेन +/-) सी (2) में सबसे दाएं लेन हैं। उपयोग की जाने वाली सीढ़ी 1 केबी प्लस डीएनए सीढ़ी थी, जो सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ल. मिनी-प्रेप
रेयूटेरी के लिए मिनी-प्रेप सीमित है और केवल एक वैकल्पिक प्लास्मिड परिवर्तन पुष्टिकरण विधि के रूप में अभिप्रेत है। एक पिछले प्रकाशन में उल्लेख किया गया है कि कुछ उपभेदों को म्यूटानोलिसिन22 द्वारा अधिक प्रभावी ढंग से व्यवस्थित किया जाता है; दोहरी लाइसोजाइम-म्यूटानोलिसिन कार्रवाई एल रियूटेरी DSM20016 के लिए सबसे प्रभावी पाई गई। मिनी-प्रेप एलुएट को एक अगारोस जेल के माध्यम से चलाने से अवलोकन योग्य बैंड के बजाय स्मीयर होता है। बाद में पीसीआर को, हालांकि, अपेक्षित बैंड आकार का उत्पादन करना चाहिए (चित्रा 5 देखें)।

Figure 5
चित्रा 5: पीसीआर और मिनी-प्रेप उत्पादों के एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन। चित्रा 4 ए से वही छह कॉलोनियों को इस पेपर में निर्धारित प्रोटोकॉल का उपयोग करके मिनी-तैयार किया गया था। (नीचे पंक्ति) मिनी-प्रेप एलुएट एक धब्बा दिखाता है। (शीर्ष पंक्ति) पीसीआर को डीएनए टेम्पलेट के रूप में एलुएंट का उपयोग करके किए जाने के बाद, स्पष्ट सकारात्मक बैंड देखे जाते हैं। उपयोग की जाने वाली सीढ़ी 1 केबी प्लस डीएनए सीढ़ी थी, जो सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: पीएनजेड 123 प्लास्मिड के साथ एल रियूटेरी DSM20016 की परिवर्तन क्षमता। पीएनजेड 123 (पीएसएच 71 रोलिंग सर्कल मूल) के साथ किए गए परिवर्तन, जिसमें कोई बहिर्जात संवैधानिक रिपोर्टर प्रोटीन नहीं था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: एनारोबिक कक्षों के लिए सीएडी फाइलें। शीट 1: बेस ड्राइंग; शीट 2: लंबी दीवार ड्राइंग; शीट 3: छोटी दीवार ड्राइंग; शीट 4: शीर्ष ड्राइंग; शीट 5: ढक्कन ड्राइंग; शीट 6: लॉक लिप ड्राइंग; शीट 7: क्लैंप बार ड्राइंग; शीट 8: क्लैंप प्लेट ड्राइंग; शीट 9: असेंबली अवलोकन; शीट 10: क्रमांकित भागों के साथ अवलोकन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

रियूटेरी DSM20016 के परिवर्तन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम परिवर्तनों को चढ़ाने के बाद एनारोबिक विकास स्थितियों की पीढ़ी है; एरोबिक स्थितियों में प्राप्त कॉलोनियां केवल बहुत सामयिक होती हैं और आमतौर पर एमआरएस शोरबा में टीका लगाए जाने पर बढ़ने में विफल रहती हैं। कॉलोनी के विकास की संभावना को अधिकतम करने के लिए पूरे रिकवरी वॉल्यूम को चढ़ाना भी अभ्यास किया जाना चाहिए। इन दो महत्वपूर्ण चरणों के साथ भी, परिवर्तन दक्षता अभी भी प्रयोग पर एक सीमा है, क्योंकि अपेक्षित कॉलोनियों की संख्या परिवर्तनों के दौरान प्रति प्लेट एक या दो जितनी कम हो सकती है (चित्र 1 देखें)।

वाणिज्यिक खाद्य कंटेनरों का शुरू में उपयोग किया गया था और लगातार ओ2 बहिष्करण के लिए अपर्याप्त पाया गया था। विश्वविद्यालय की मशीन की दुकान द्वारा डिजाइन किए गए एनारोबिक कक्षों के लिए सीएडी फाइलें पूरक फ़ाइल 1 में पाई जा सकती हैं। चूंकि इन बक्से में कभी-कभी जॉइनरी में छोटे अंतराल के माध्यम से हवा की घुसपैठ हो सकती है, इसलिए पहले उपयोग से पहले किसी भी रिसाव की जांच के लिए उन्हें पानी (अनसील) से भरने की सलाह दी जाती है; बाद की जांच आमतौर पर आवश्यक नहीं होती है। इन बक्से में ओ2 अनुक्रमण प्रणालियों के बजाय ओ2 प्रतिस्थापन प्रणाली होनी चाहिए, क्योंकि उन्हें दबाव के लिए परीक्षण नहीं किया गया है।

मीडिया के मुद्दे उत्पन्न हो सकते हैं; आटोक्लेव एमआरएस शोरबा चयनात्मक है लेकिन इसमें अत्यधिक ऑटो-फ्लोरोसेंट गुण होते हैं, जो कम फ्लोरोसेंट रीडिंग के माप में बाधा डालते हैं। फ़िल्टर स्टरलाइज्ड एमआरएस शोरबा का उपयोग करने के लिए संशोधन इस समस्या को सुधारता है, लेकिन कम चयनात्मक है। रेयूटेरी 24 घंटे के बाद मीडिया के पीएच को लगभग पीएच 4 तक कम कर देता है ( चित्रा 6 देखें), इसलिए मीडिया को एसिड-संवेदनशील जीएफपी23 का पता लगाने के लिए बफरिंग की आवश्यकता होती है। हमने इस समस्या से बचने के बजाय अधिक एसिड प्रतिरोधी एमचेरी 2 का उपयोग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया।

Figure 6
चित्र 6: एमआरएस शोरबा में एल रियूटेरी के समय के साथ पीएच। एल रियूटेरी DSM20016 समय के साथ पीएच को कम करता है (डैश्ड लाइन); पीकेए मान पीएच को इंगित करता है जिस पर रिपोर्टर प्रोटीन प्रतिदीप्ति अम्लता (क्षैतिज रेखाओं) के कारण अधिकतम मूल्य का 50% होगा। EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4.3, mCherry2 pKa = 3.3. प्रत्येक रिपोर्टर प्रोटीन में रिपोर्टर प्रभावशीलता अलग-अलग समय बिंदुओं पर अधिकतम प्रतिदीप्ति के 50% तक कम हो जाती है क्योंकि तेजी से अम्लीय एल रियूटेरी (ऊर्ध्वाधर रेखाओं) के भीतर उत्पादित होने पर उनकी एसिड संवेदनशीलता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एल. रियूटेरी। DSM20016 कॉलोनी पीसीआर प्रयासों को बाधित करता प्रतीत होता है, इस प्रक्रिया की उपयोगिता को गंभीर रूप से सीमित करता है। चरण 4.3 के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट से कम पीसीआर विफलता दर बढ़ सकती है, जबकि आरटी पर 48 घंटे के परिणामस्वरूप पूर्ण पीसीआर विफलता होती है ( चित्रा 4 बी, सी देखें)। नमूने को पतला करने और हर समय बर्फ पर नमूने रखने के लिए संशोधन कॉलोनी पीसीआर की सफलता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।

एल रियूटेरी DSM20016 के आंतरिक कार्यों के बारे में बहुत कुछ अज्ञात है। इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान बिना प्लास्मिड के साथ परिवर्तन नियंत्रण प्लेटों को जोड़ा जाता है, जो शून्य कालोनियों को दिखाते हैं, इसका मतलब यह होना चाहिए कि प्लास्मिड स्थिति में मौजूद किसी भी कॉलोनी में प्लास्मिड होता है। हालांकि, बाद में कॉलोनी पीसीआर को संशोधनों के साथ भी प्लास्मिड अपटेक की विश्वसनीय रूप से पुष्टि नहीं करने के लिए दिखाया गया है। यह पीसीआर डीएनए टुकड़ों को कम करने वाले एंडोन्यूक्लियूज़ पर प्रतिबंध के कारण हो सकता है। एंडोन्यूक्लियस का सामना अन्य लैक्टोबैसिलेसी प्रजातियों में किया गया है और बांध-/डीसीएम-ई.कोलाई 19,20 के उपयोग के माध्यम से दूर किया गया है। एल. रियूटेरी। DSM20016 में कम्प्यूटेशनल विश्लेषण24 के माध्यम से एनोटेट किए गए कई कथित प्रतिबंध-संशोधन एंजाइम हैं। DSM20016 की परिवर्तन क्षमता को संभावित रूप से आगे बढ़ाया जा सकता है यदि इसके प्रतिबंध संशोधन (आरएम) एंजाइम मान्यता साइटों की विशेषता और टाला जा सकता है। आगे की जांच की आवश्यकता है।

इस पेपर में निर्धारित संशोधित इलेक्ट्रोपोरेशन विधि अहर्न एट अल द्वारा एल रियूटेरी DSM20016 के लिए पहले वर्णित विधि के लिए एक कम जटिल, अधिक आधुनिक विकल्प प्रदान करती है।25. यह पेपर प्लास्मिड अपटेक के लिए बांध-/डीसीएम-मिथाइलेशन आवश्यकताओं के बारे में अहर्ने एट अल द्वारा किए गए महत्वपूर्ण अनुबंधों की जांच करता है, जिनकी पुष्टि नहीं की गई है। इस पेपर में निर्धारित परिवर्तन विधि भी चढ़ाना के बाद महत्वपूर्ण एनारोबिक विकास की आवश्यकता पर जोर देती है, जो स्पष्ट रूप से अहर्न एट अल द्वारा व्यक्त नहीं की गई है।

यहां निर्धारित कुछ तरीकों और दृष्टिकोणों का उपयोग भविष्य के अनुप्रयोगों में अन्य लैक्टोबैसिलेसी परिवार हेरफेर प्रयासों की सहायता के लिए किया जा सकता है, विशेष रूप से: परिवर्तन नियंत्रण प्लेटों का समावेश, एसिड-प्रतिरोधी रिपोर्टर एमचेरी 2 का उपयोग, कॉलोनी पीसीआर तापमान आवश्यकताएं, और मिनी-प्रेप म्यूटानोलिसिन समावेशन। हालांकि, कुछ को अभी भी अन्य उपभेदों में बेहतर काम करने के लिए संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है।

एल. रियूटेरी। DSM20016 नैदानिक और कृषि महत्व का है क्योंकि इसकी स्थिति न केवल एक सामान्य कशेरुक ी समूह (पशुधन फ़ीड में एक योजक के रूप में संभावित उपयोग के साथ) के रूप में है, बल्कि मानव आंत पर्यावरण के साथ आंतरिक रूप से जुड़े लैक्टोबैसिलेसी-परिवार के उपभेदों की एक बहुत छोटी संख्या में से एक के रूप में भीहै। इस माइक्रोब का कुशल हेरफेर इसे जीआई पथ के भीतर नए उपचारों के भविष्य के वितरण और भड़काऊ स्थितियों की गैर-आक्रामक निगरानी के लिए एक चेसिस के रूप में खोलेगा। इस लेख में, इन विधियों को स्पष्ट रूप से संकलित किया गया है और सामूहिक रूप से संशोधनों के साथ प्रदर्शित किया गया है, विशेष रूप से, गैर-मॉडल एल रियूटेरी स्ट्रेन DSM20016।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव मौजूद नहीं है।

Acknowledgments

वैन पिजकेरेन (विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की गई मूल्यवान सलाह की बहुत सराहना करते हैं, जिनके मार्गदर्शन में एल रेउटेरी एटीसीसी पीटीए 6475 के साथ काम करने पर यहां वर्णित तरीकों के लिए एक आधार प्रदान किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder NEB N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes Thomas Scientific 1145J12
Agarose  BioShop AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) Beckman Allegra  N/A No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet Thermo Scientific OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system VWR 58017-984
Centrifuge tubes (50 mL) FroggaBio TB50-500
DNA gel x6 loading dye NEB B7024S
Electroporation cuvette Fisherbrand FB101
Erythromycin Millipore Sigma E5389-5G
Gel electroporation bath/dock VWR 76314-748
Glycerol  BioShop GLY001
Limosilactobacillus reuteri Leibniz Institute DSMZ DSM20016 Strain designation F275
Lysozyme BioShop LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) FroggaBio LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen) Qiagen 27106 slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated) Thermo Scientific CM0359B
Mutanolysin Millipore Sigma M9901-5KU
NaOH  Millipore Sigma 1064691000
P100 Pipette Eppendorf 3123000047
P1000 Pipette Eppendorf 3123000063
P2.5 Pipette Eppendorf 3123000012
P20 Pipette Eppendorf 3123000039
P200 Pipette Eppendorf 3123000055
PCR tubes FroggaBio STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge Genlantis E200100
Petri dishes VWR 25384-088
PTC-150 Thermal Cycler MJ Research N/A No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified) Addgene 27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer Thermo Scientific 840-281700
Storage microplate Fisher Scientific 14-222-225
Sucrose BioShop SUC507
TAE Buffer 50x Thermo Scientific B49
Vortex VWR 58816-121 No longer in production
VWR 1500E incubator VWR N/A No longer in production

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 196
<em>लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी</em> में इलेक्ट्रोपोरेशन और ट्रांसफॉर्मेशन कन्फर्मेशन के तरीके DSM20016
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Duggan, A., McMillen, D. Methods for … More

Duggan, A., McMillen, D. Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016. J. Vis. Exp. (196), e65463, doi:10.3791/65463 (2023).

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