Summary
Her presenterer vi protokoller for arbeid med Limosilactobacillus reuteri DSM20016, som beskriver vekst, plasmidtransformasjon, koloni-PCR, fluorescerende reporterproteinmåling og begrenset plasmid mini-prep, samt vanlige problemer og feilsøking. Disse protokollene tillater måling av reporterproteiner i DSM20016, eller bekreftelse via koloni-PCR hvis ingen reporter er involvert.
Abstract
Lactobacillus var en utrolig stor, mangfoldig slekt av bakterier som omfattet 261 arter, hvorav flere var kommensale stammer med potensial for bruk som et chassis for syntetiske biologiske bestrebelser i mage-tarmkanalen. Den store fenotypiske og genotypiske variasjonen observert innen slekten førte til en nylig omklassifisering og introduksjonen av 23 nye slekter.
På grunn av bredden av variasjoner innen de gamle slektene, kan det hende at protokoller som er demonstrert i ett medlem, ikke fungerer som annonsert med andre medlemmer. Mangel på sentralisert informasjon om nøyaktig hvordan man skal manipulere spesifikke stammer har ført til en rekke ad hoc-tilnærminger , ofte tilpasset fra andre bakteriefamilier. Dette kan komplisere saker for forskere som starter i feltet, som kanskje ikke vet hvilken informasjon som gjelder eller ikke gjelder for den valgte stammen.
I dette papiret tar vi sikte på å sentralisere et sett med protokoller med demonstrert suksess, spesielt i Limosilactobacillus reuteri stammebetegnelse F275 (andre innsamlingsnumre: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), sammen med feilsøkingsråd og vanlige problemer man kan støte på. Disse protokollene skal gjøre det mulig for en forsker med liten eller ingen erfaring med å jobbe med L. reuteri DSM20016 å transformere et plasmid, bekrefte transformasjon og måle systemtilbakemelding i en plateleser via et reporterprotein.
Introduction
Slekten Lactobacillus ble historisk klassifisert som grampositiv, stavformet, ikke-sporedannende, enten fakultative anaerober eller mikroaerofiler som bryter sukker ned for primært å produsere melkesyre1. Disse løse kriteriene førte til at Lactobacillus var, fenotypisk og genotypisk, en ekstremt mangfoldig slekt. Denne brede kategoriseringen resulterte i at slekten ble omklassifisert, og introduserte 23 romanslekter i 20202.
Den gamle, bredere slekten inkluderte store kommensale og probiotiske arter som generelt anses som trygge (GRAS) for konsum3. Lactobacillaceae-familien opprettholder en offentlig oppfatning av å være "gode bakterier" på grunn av mange rapporterte helsemessige fordeler gitt via forbruk av ulike stammer 4,5,6,7. Enkelheten som de kan navigere i mage-tarmkanalen8 og deres offentlige aksept kombineres for å posisjonere Lactobacillaceae-stammer som sterke kandidater som chassisorganismer for inntakbare medisinske, terapeutiske eller diagnostiske applikasjoner.
Det brede spekteret av egenskaper som er tilstede i Lactobacillaceae-familien har ført til en situasjon der det ikke er noen de facto modell-organismestamme; Forskningsgrupper har hatt en tendens til å velge arter med de egenskapene som er mest relevante for deres spesielle mål. (For eksempel kan meierifermenteringslaboratorier velge L. lactis; studier av vegetabilsk gjæring kan velge L. plantarum; forskning på probiotika kan fokusere på L. acidophilus, og så videre.)
Det samme brede spekteret av egenskaper på tvers av arter har ført til en opphopning av protokoller og prosedyrer som kan fungere bra for en undergruppe av Lactobacillaceae-familien , men krever optimalisering for å fungere effektivt (eller kanskje å fungere i det hele tatt) hos andre9. Dette behovet for optimalisering mellom familiemedlemmer og til og med innenfor medlemmer av samme art kan frustrere innsatsen til ukjente forskere. Protokoller publisert i metodeseksjonene i papirer kan også inkludere egne modifikasjoner10, noe som fører til fragmenterte, desentraliserte protokollsamlinger.
L. reuteri regnes som en allment virveldyr commensal, funnet konsekvent i pattedyr, aviær11 og fisk12 gastrointestinale (GI) traktater. L. reuteri understammer er ofte genetisk spesialiserte, via slimadhesjonsproteintilpasning, for mer permanent kolonisering av spesifikke innfødte verter 8,11,13. GI-kanalen Limosilactobacillus-arter kan isoleres i verter utenfor sin opprinnelige vert, men tenderer mer mot en forbigående natur8.
På grunn av human-host spesialisering posisjonerer L. reuteri seg DSM20016 seg veldig bra som et chassis for diagnostiske eller terapeutiske applikasjoner på et hvilket som helst punkt i den menneskelige GI-kanalen, og belastningen DSM20016 kan gi et mer langvarig effektvindu for intervensjoner sammenlignet med mer forbigående stammer.
I dette papiret skisserer vi en serie protokoller med demonstrert effektivitet i Limosilactobacillus reuteri (stammebetegnelse: F275; andre innsamlingsnumre: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), sammen med sentralisert informasjon om belastningen fra andre kilder for å hjelpe til med molekylære og systembiologiske applikasjoner. Prosedyrer som er beskrevet her, bør gjøre det mulig for en forsker uten tidligere erfaring å dyrke L. reuteri, lage elektrokompetente aksjer, velge transformerte kolonier, bekrefte transformasjon via kolonipolymerasekjedereaksjon (PCR) og måle designet systemrespons via fluorescerende reporterproteiner.
Vi bemerker at relaterte protokoller har dekket CRISPR-Cas9 assistert ssDNA genom recombineering i L. reuteri (stamme: ATCC-PTA-6475) 14, og CRSIPR-Cas9 nickase-assistert genomredigering i flere ikke-L. reuteri, Lactobacillaceae familie flekker15,16; Disse adresserer imidlertid ikke L. reuteri DSM20016 stammen som er vårt fokus her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klargjøring av L. reuteri DSM20016 elektrokompetente celler
MERK: Dette er basert på en protokoll av Berthier et al.17, med sentrifugeringshastigheter informert av Rattanachaikunsopon et al.18.
- I et 50 ml sentrifugerør inokulerer L. reuteri fra glyserollager til 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS) buljong. Inkuber aerobt over natten ved 37 °C i en statisk inkubator.
- Neste morgen, inokuler 4 ml av natten kultur i 200 ml MRS buljong (1:50 fortynning).
- Tillat å vokse aerobt i en statisk 37 ° C inkubator til 600 nm optisk tetthetsverdi (OD600) når 0,5-0,85; Dette bør ta omtrent 2-3 timer.
- Så snart en tilstrekkelig OD600-verdi er nådd, dekanter mediet i 50 ml sentrifugerør og legg på is mens du balanserer rørene.
- Sentrifuge i 5 minutter ved 5000 x g i en forkjølt sentrifuge på 4 °C.
- Kast supernatanten, resuspender hver pellet i 50 ml forkjølt (0 °C til 4 °C) ddH2O, og sentrifuge igjen med de samme innstillingene som forrige trinn. Hold cellene på is så mye som mulig.
- Gjenta trinn 1.6.
- Resuspender hver pellet i 25 ml ddH2O: 0,5 M sukrose, 10% glyserol. Sentrifuge ved 5000 x g ved 4 °C i 10 minutter. Kast supernatanten og legg cellene tilbake på is.
- Suspender alle pellets i samme 2 ml ddH2O: 0,5 M sukrose, 10% glyserol.
- Aliquot i 50 μL til 100 μL porsjoner i forkjølte mikrosentrifugerør; oppbevares ved -80 °C for senere bruk.
2. Elektroporering av L. reuteri
MERK: Unngå pipettering så mye som mulig i de følgende trinnene. Inkludering av en kontrollelektroporering, uten tilsatt plasmid, anbefales for å sikre at antibiotikavalget er tilstrekkelig.
- Ta en hel elektrokompetent L. reuteri aliquot og tine den på is.
- Bland forsiktig 5 μL til 10 μL plasmid (endelig plasmidkonsentrasjon >6 nM) inn i tint alikot, og unngå pipettering så mye som mulig.
- Overfør til en iskjølt, 1 mm elektroporeringskuvett.
- Elektroporat ved 1,25 kV, 400 Ω og 25 μF.
- Tilsett 1 ml romtemperatur (RT) MRS-buljong og bland ved å snu kyvetten en eller to ganger.
- Plasser kyvettene i en statisk inkubator ved 37 °C i 2,5-3 timer for å muliggjøre gjenvinning.
- Plate hele mengden på flere MRS-agarplater med passende valg.
- Plasser tallerkenene i en helt lufttett beholder med et lite tent stearinlys ("telys") og en anaerob atmosfæregenererende pose.
- Dyrk ved 37 °C i 2-3 dager eller til synlige kolonier er til stede.
3. Måling av det syrefaste fluorescerende reporterproteinet mCherry2
- Velg eventuelle kolonier som kreves for måling og inokuler i en 96-brønns lagringsmikroplate med 1,5 ml filtersterilisert (ikke-autoklaver) MRS-buljong per brønn og et passende utvalg antibiotika.
- Inkuber aerobt i 24 timer over natten ved 37 °C uten å riste.
MERK: Denne oppbevaringsmikroplaten skal oppbevares for bruk i avsnitt 4 (koloni-PCR). - L. reuteri vil felle ut av media når den er i stasjonær fase; Resuspender overnattingskulturen via pipettering.
- Overfør 200 μL til en flat, klar bunn, 96-brønnsplate, overfør platen til en plateleser, og mål OD og fluorescens av mCherry2 (eksitasjon [Ex]: 589 nm; utslipp [Em]: 610 nm) eller andre relevante reportere.
4. Bekreftelse av plasmidopptak via koloni-PCR
- Fra 96-brønns lagringsmikroplaten fra seksjon 3, overfør 5 μL til et PCR-rør.
MERK: Hvis det har gått >5 minutter, kan det være nødvendig å resuspendere L. reuteri en gang til. - I en bærbar stasjonær mikrosentrifuge, spinn ned til pelleten kan sees (omtrent 2 minutter ved 2000 x g), kast supernatanten og resuspender pelleten i 20 μL på 20 mM NaOH.
- Kok ved 95 °C i 5 min, og gjenta koken en gang til.
- Umiddelbart chill prøvene; Prøv å holde prøvene på is så mye som mulig i de følgende trinnene for å redusere sannsynligheten for malnedbrytning og PCR-hemming.
- Spinn ned i en bærbar benkemikrosentrifuge ved 2000 x g i 2 minutter til celleavfallet er pelletert, ta deretter 1 μL av supernatanten og fortynn til 99 μL iskald DNase- og RNase-fri ddH2O (100x fortynning).
- Bruk 100x fortynning som mal-DNA i en standard PCR-reaksjon ved bruk av plasmidspesifikke primere. Inkluder en positiv kontroll med et plasmid avledet fra E. coli mini-prep.
- Returner prøvene på is og tilsett et passende lastestoff i en 1x konsentrasjon.
- Kjør i 1% agarosegel i TAE-buffer (tris-acetat-etylendiamintetraeddiksyre [EDTA]) ved 110 V i 30 minutter. Bilde om nødvendig.
5. Mini-prep protokoll for L. reuteri , etterfulgt av PCR for å bekrefte plasmid tilstedeværelse
MERK: Protokoll beregnet for bruk med mini-prep-settet som er oppført i materialfortegnelsen.
- Inokuler L. reuteri i 10 ml MRS-buljong som inneholder et passende antibiotikum og inkuber over natten aerobt ved 37 °C i en statisk inkubator.
- Sentrifuge ved 5000 x g i 10 minutter i en forkjølt sentrifuge på 4 °C.
- Vask pelleten i 2 ml standard P1-buffer (følger med settet) for å surhetsgrad som kan forstyrre senere trinn, sentrifuger med samme innstilling som tidligere beskrevet, og kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i 250 mikrol modifisert P1-buffer inneholdende 10 mg/ml lysozym og 100 U/ml mutanolysin for å lyse opp bakterieceller. Inkuber i 1-2 timer ved 37 °C.
- Tilsett 250 μL buffer P2, bland ved å invertere fire til seks ganger, og inkuber ved RT i ikke lenger enn 5 minutter.
- Tilsett 350 μL buffer N3 (følger med settet) og snu umiddelbart fire til seks ganger forsiktig for å blande.
- Sentrifuge ved 10 000 x g i 10 min.
- Overfør så mye supernatant som mulig til en spinnkolonne og sentrifuge ved 10 000 x g i 60 s. Kast gjennomstrømningen.
- Vask sentrifugeringssøylen med 500 μL buffer PB (følger med settet) og sentrifuge ved 10 000 x g i 60 s. Kast gjennomstrømningen.
- Vask sentrifugeringskolonnen med 750 μL buffer-PE (følger med settet), og sentrifuge ved 10 000 x g i 60 s. Kast gjennomstrømningen og sentrifugen i 60 sekunder for å fjerne eventuell gjenværende buffer.
- Plasser sentrifugerøret i et mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Påfør 20-30 μL DNAse- og RNAse-fri ddH 2 O på filteret i spinnkolonnen og la stå i1-2min, før sentrifugering ved 10 000 x g i 60 s.
- Utfør en standard PCR-reaksjon ved bruk av plasmidspesifikke primere (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), med eluat som gir mal-DNA. Inkluder en positiv kontroll med et plasmid avledet fra E. coli mini-prep.
MERK: PCR-innstillingene som brukes i denne studien er: 98 °C i 5 minutter, (98 °C i 30 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 45 s) 30 sykluser, 72 °C i 2 minutter, 4 °C hold. Parametrene er svært avhengige av polymerasen som brukes, fragmentlengde og eksakte primere som brukes av enhver person som bruker denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv transformasjon
L. reuteri krever ikke et dcm-/dam- ikke-metylert plasmid, som observert for andre Lactobacillaceae19,20 (se figur 1). Elektroporering av L. reuteri DSM20016 med 10 μL av 8,5 kb plasmid pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 theta opprinnelse til replikasjon) bør gi transformasjonseffektivitet på omtrent 80 kolonidannende enheter (CFU) / μg (fem til åtte kolonier per 200 μL belagt), uavhengig av plasmidmetyleringstilstanden. Med selektiv herding og retransformasjon er det mulig å oppnå muterte L. reuteri-stammer med langt større transformasjonseffektivitet21, observert med pTRKH3_mCherry2 på omtrent 4 x 103 CFU / μg (200-250 kolonier per 200 μL belagt), noe som muliggjør applikasjoner med høyere gjennomstrømning. Lignende resultater ble også observert for reporteren mTFP1. Transformasjoner ble også utført med pNZ123 (pSH71 valsesirkelopprinnelse), uten eksogent konstitutivt reporterprotein, noe som resulterte i transformasjonseffektivitet på 3 x 104 CFU / μg DNA (tilleggsfigur 1).
Figur 1: Elektroporeringseffektivitet. Totalt 10 nM pTRKH3_mTFP1 og 80 nM pTRKH3_mCherry2 plasmidstammer ble oppnådd fra to kilder: DH10β E. coli og dcm-/dam-methylase knockout E. coli. L. reuteri ble deretter elektroporert med 10 μL av de to forskjellige metyleringsmønsterplasmidene og koloniene telte. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vekstforhold for transformasjon
L. reuteri er aerotolerant og kan dyrkes i buljong og på agar under normale atmosfæriske forhold. Imidlertid er transformasjonssuksess avhengig av generering av et anaerob vekstmiljø når det er belagt; Det er kanskje den viktigste forutsetningen for transformasjonssuksess. O2 lekkasjer kan oppdages ved å inkludere en plate av ikke-transformert L. reuteri. Kolonimorfologi endres merkbart i nærvær av oksygen (se figur 2); alternativt kan anaerobe indikatorer brukes (se Materialfortegnelse).
Figur 2: L. reuteri kolonimorfologi. Kolonier forvandlet med pTRKH3_mCherry2 plasmid. (A) Underkorrekt lav-O2 forhold, kolonier vises hvite, ugjennomsiktige, glatte, runde, konvekse og skinnende. (B) Under delvise eller lekkendeO2-forhold virker koloniene hvite, ugjennomsiktige, upulerte (bølgete), runde, umbonate (avrundet/knottet) og skinnende. (C) L. reuteri-kolonier uten plasmidtransformasjon under atmosfæriskeO2-nivåer . Koloniene virker enten ugjennomsiktige eller gjennomsiktige og enten umbonate eller flate; De virker alltid lobate, runde og tørre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Måling av reporterproteiner
Wild-type L. reuteri DSM20016 reporter protein uttrykk og vekst varierer mellom kolonier (se figur 3A), noe som gjør nøyaktige fradrag på systemaktivitet vanskelig. Det er mulig å velge og kurere riktig transformert villtype L. reuteri DSM20016; Retransformasjon kan gi opphav til stammer med mutasjoner som muliggjør større transformasjonseffektivitet. En stamme utviklet via denne metoden virket langt mer stabil når det gjaldt reporterproteinuttrykk (se figur 3B). Det anbefales at slike mutasjoner søkes, via plasmidherding og retransformasjon, før det utføres arbeid som krever innstilt proteinuttrykk.
Figur 3: Vekst, reporterfluorescens og koloni-PCR-utfall for transformert L. reuteri. Begge forsøkene bruker pTRKH3_mCherry2 plasmid ved 80 nM. (A,B) Hver kolonne på tvers av hver av de tre delplottene refererer til den samme koloniens OD-verdi, fluorescensverdi (Ex: 589 nm; Em: 610 nm), og PCR-resultat (solid blokk indikerer riktig bånd observert). (A) Alle kolonier fra L. reuteri DSM20016 transformasjon plukket (kontrolltransformasjon = null kolonier). Kolonier inkuberes i filtrert MRS-buljong i 24 timer før måling ved gevinst 100. (B) Totalt 88 kolonier plukket fra L. reuteri DSM20016 stamme valgt for høyere transformasjonseffektivitet, mer konsistent reporterproteinproduksjon og lavere PCR-hemming (kontrolltransformasjon = null kolonier). Kolonier inkuberes i filtrert MRS-buljong i 24 timer før måling ved forsterkning 200. Kontroller er i blått, C = ikke-transformert DSM20016 cellekontroll, M = filtrert MRS-buljong bare mediekontroll, og feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Koloni PCR
Koloni-PCR bør ikke brukes som eneste middel til å utlede korrekt transformasjon, da de kan være upålitelige selv når prøvene fortynnes og holdes avkjølt (se figur 4). Hvis ikke-plasmidkontrollen som følger med transformasjoner viser null kolonier, innebærer det at alle kolonier har plasmidet som bærer antibiotikaresistens. Imidlertid, hvis koloni-PCR er nødvendig, kan de optimaliserte forholdene som er angitt her, øke suksessen betydelig.
Figur 4: Koloni-PCR av transformert L. reuteri. (A) L. reuteri DSM20016 kolonier ble screenet for positive PCR-bånd; seks ble oppnådd og inokulert i fersk autoklavert MRS-buljong. Prøver på 5 μL tatt på forskjellige tidspunkter etter inokulering ble gjenstand for PCR igjen ved de angitte fortynningsnivåene. Farger i hver gang / fortynningsboks indikerer suksessen til PCR-utvinningen: grønn = riktig bånd observert; rød = ingen bånd observert. (B) Resultater for en fast 100x fortynning viser at variasjon i fremstillingstemperaturen resulterte i ulik grad av PCR-suksess: prøver ble fremstilt på is og PCR-ed umiddelbart (89,77%), fremstilt ved romtemperatur og PCR-ed umiddelbart (75%), eller fremstilt ved RT deretter inkubert ved 37 °C i 30 minutter før PCR (27,27%). (C) (1) Åtte positive 100x fortynningsprøver (R1-8) fra RT-tilstanden. (2) Etter å ha blitt forlatt på RT i 48 timer, ble prøvene PCR-ed en gang til, og viste et fravær av båndene ved ~ 1.1 kb; positive og negative kontroller (felt +/-) er de høyre feltene i C (2). Stigen som ble brukt var 1 kb pluss DNA-stigen, oppført i materialfortegnelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
L. reuteri mini-prep
Mini-prep for L. reuteri er begrenset og kun ment som en alternativ bekreftelsesmetode for plasmidtransformasjon. En tidligere publikasjon bemerket at noen stammer lyseres mer effektivt av mutanolysin22; dobbel lysozym-mutanolysinvirkning ble funnet å være den mest effektive for L. reuteri DSM20016. Å kjøre mini-prep eluate gjennom en agarosegel resulterer i et smør i stedet for observerbare bånd. Påfølgende PCR bør imidlertid gi forventede båndstørrelser (se figur 5).
Figur 5: Agarosegelelektroforese av PCR og mini-prep-produkter. De samme seks koloniene fra figur 4A ble mini-prepped ved hjelp av protokollen som er angitt i denne artikkelen. (Nederste rad) Mini-prep eluate viser et smør. (Øverste rad) Etter at PCR ble utført ved bruk av eluanten som DNA-mal, observeres klare positive bånd. Stigen som ble brukt var 1 kb pluss DNA-stigen, oppført i materialfortegnelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Transformasjonseffektivitet av L. reuteri DSM20016 med pNZ123-plasmid. Transformasjoner utført med pNZ123 (pSH71 rullende sirkelopprinnelse), som ikke bærer noe eksogent konstitutivt reporterprotein. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: CAD-filer for anaerobe kamre. Ark 1: Base tegning; Ark 2: Lang veggtegning; Ark 3: Liten veggtegning; Ark 4: Topptegning; Ark 5: Lokk tegning; Ark 6: Lås leppetegning; Ark 7: Clamp bar tegning; Ark 8: Klemplate tegning; Ark 9: Montering oversikt; Ark 10: Oversikt med nummererte deler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trinnet for transformasjonen av L. reuteri DSM20016 er genereringen av anaerobe vekstforhold etter at transformasjoner er belagt; kolonier oppnådd i aerobe forhold er bare svært sporadiske og generelt ikke klarer å vokse når inokulert i MRS buljong. Plettering av hele utvinningsvolumet bør også praktiseres for å maksimere sannsynligheten for kolonivekst. Selv med disse to kritiske trinnene er transformasjonseffektivitet fortsatt en begrensning på eksperimentering, da forventede kolonier kan telle så lavt som en eller to per plate under transformasjoner (se figur 1).
Kommersielle matbeholdere ble opprinnelig brukt og funnet å være utilstrekkelige for konsistent O2 ekskludering. CAD-filer for anaerobe kamre designet av universitetets maskinverksted finnes i tilleggsfil 1. Siden disse boksene av og til kan ha luftinfiltrasjon gjennom små hull i snekkerarbeid, anbefales det å fylle dem med vann (uforseglet) for å se etter eventuelle lekkasjer før første gangs bruk; Etterfølgende kontroller er vanligvis ikke nødvendig. Disse boksene bør ha O 2 erstatningssystemer i stedet for O2 sekvestreringssystemer, da de ikke er testet for trykksetting.
Medieproblemer kan oppstå; autoklavert MRS-buljong er selektiv, men har svært autofluorescerende egenskaper, noe som hindrer måling av lave fluorescerende avlesninger. Modifikasjon for å bruke filtersterilisert MRS-buljong forbedrer dette problemet, men er mindre selektiv. L. reuteri senker pH i mediet til rundt pH 4 etter 24 timer (se figur 6), så mediet krever bufring for å oppdage syrefølsom GFP23. Vi endret denne protokollen for å bruke mer syrefast mCherry2 i stedet, og unngikk dette problemet.
Figur 6: pH over tid av L. reuteri i MRS-buljong. L. reuteri senker DSM20016 pH over tid (stiplet linje); pKa-verdien indikerer pH der reporterproteinfluorescensen vil være 50% av maksimumsverdien på grunn av surhet (horisontale linjer). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Hvert reporterprotein har reportereffektivitet redusert til 50% av den maksimale fluorescensen på forskjellige tidspunkter på grunn av deres syrefølsomhet når de produseres i stadig surere L. reuteri (vertikale linjer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
L. Reuteri DSM20016 ser ut til å hemme koloniens PCR-innsats, noe som sterkt begrenser nytten av denne prosedyren. Så lite som 30 minutter ved 37 °C etter trinn 4.3 kan øke PCR-feilraten, mens 48 timer ved RT gir fullstendig PCR-svikt (se figur 4B,C). Modifikasjonen for å fortynne prøvene og holde prøvene på is til enhver tid er avgjørende for å øke koloniens PCR-suksess.
Mye er fortsatt ukjent om de interne funksjonene til L. reuteri DSM20016. Transformasjonskontrollplater uten plasmid tilsatt under elektroporering, som viser null kolonier, bør innebære at eventuelle kolonier tilstede i plasmidtilstanden har plasmidet. Imidlertid har påfølgende koloni-PCR vist seg å ikke pålitelig bekrefte plasmidopptak selv med modifikasjoner. Dette kan skyldes restriksjonsendonukleaser som nedbryter PCR DNA-fragmenter. Endonukleaser har blitt påtruffet i andre Lactobacillaceae-arter og overvunnet ved bruk av dam-/dcm-E.coli 19,20. L. Reuteri DSM20016 har flere antatte restriksjonsmodifikasjonsenzymer kommentert via beregningsanalyse24. Transformasjonseffektiviteten til DSM20016 kan potensielt økes ytterligere hvis enzymgjenkjenningsstedene for restriksjonsmodifikasjon (RM) kan karakteriseres og unngås. Ytterligere undersøkelser er nødvendig.
Den modifiserte elektroporasjonsmetoden som er angitt i dette papiret, gir et mindre komplekst, mer moderne alternativ til en metode som tidligere er beskrevet for L. reuteri DSM20016 av Ahrne et al.25. Denne artikkelen undersøker vesentlige bestemmelser fra Ahrne et al. angående dam-/dcm- metyleringskrav for plasmidopptak, som ikke er bekreftet. Transformasjonsmetoden som er angitt i denne artikkelen, understreker også det kritiske anaerobe vekstbehovet etter plating, ikke eksplisitt formidlet av Ahrne et al.
Noen metoder og tilnærminger som er angitt her, kan brukes i fremtidige applikasjoner for å hjelpe andre Lactobacillaceae-familiemanipulasjonsforsøk , spesielt: inkludering av transformasjonskontrollplater, bruk av den syrefaste reporteren mCherry2, koloni-PCR-temperaturkrav og mini-prep mutanolysinininkludering. Noen kan imidlertid fortsatt trenge modifikasjoner for å fungere optimalt i andre stammer.
L. Reuteri DSM20016 er av klinisk og landbruksmessig betydning på grunn av sin posisjon ikke bare som en generisk virveldyrkommensal (med potensielle bruksområder som tilsetningsstoff i husdyrfôr), men også som en av et svært lite antall Lactobacillaceae-familiestammer som er iboende forbundet med det menneskelige tarmmiljøet8. Effektiv manipulering av denne mikroben vil åpne den opp som et chassis for fremtidig levering av nye terapier i GI-kanalen og ikke-invasiv overvåking av inflammatoriske tilstander. I denne artikkelen har disse metodene blitt eksplisitt samlet og kollektivt demonstrert med modifikasjoner for, spesielt, ikke-modellen L. reuteri stamme DSM20016.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det foreligger ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi setter stor pris på de verdifulle rådene fra professor JP van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), hvis veiledning om arbeid med L. reuteri ATCC PTA 6475 ga grunnlag for metodene beskrevet her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F.
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P.
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M.
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
