Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å visualisere mikrotubuli-nettverkene i nevromuskulære veikryss og muskelceller. Kombinert med de kraftige genetiske verktøyene til Drosophila melanogaster, letter denne protokollen i stor grad genetisk screening og mikrotubuli-dynamikkanalyse for rollen som mikrotubulinettverksregulerende proteiner i nervesystemet.
Abstract
Mikrotubulinettverket er en viktig komponent i nervesystemet. Mutasjoner i mange mikrotubuli regulatoriske proteiner er assosiert med nevrodevelopmental lidelser og nevrologiske sykdommer, slik som mikrotubuli-assosiert protein Tau til neurodegenerative sykdommer, mikrotubuli kutte protein Spastin og Katanin 60 forårsake arvelig spastisk paraplegi og nevrodevelopmental abnormiteter, henholdsvis. Deteksjon av mikrotubulære nettverk i nevroner er fordelaktig for å belyse patogenesen av nevrologiske lidelser. Den lille størrelsen på nevroner og det tette arrangementet av aksonale mikrotubulibunter gjør imidlertid visualisering av mikrotubuli-nettverkene utfordrende. I denne studien beskriver vi en metode for disseksjon av larvens nevromuskulære overgang og muskelceller, samt immunfarging av α-tubulin og mikrotubuli-assosiert protein Futsch for å visualisere mikrotubulinettverk i Drosophila melanogaster. Det nevromuskulære veikrysset tillater oss å observere både pre- og postsynaptiske mikrotubuli, og den store størrelsen på muskelceller i Drosophila-larven muliggjør klar visualisering av mikrotubulinettverket. Her, ved å mutere og overuttrykke Katanin 60 i Drosophila melanogaster, og deretter undersøke mikrotubuli-nettverkene i det nevromuskulære veikrysset og muskelcellene, avslører vi nøyaktig den regulatoriske rollen til Katanin 60 i nevroutvikling. Derfor, kombinert med de kraftige genetiske verktøyene til Drosophila melanogaster, letter denne protokollen i stor grad genetisk screening og mikrotubuli dynamikkanalyse for rollen som mikrotubuli nettverksregulerende proteiner i nervesystemet.
Introduction
Mikrotubuli (MT), som en av de strukturelle komponentene i cytoskelettet, spiller en viktig rolle i ulike biologiske prosesser, inkludert celledeling, cellevekst og motilitet, intracellulær transport og vedlikehold av celleform. Mikrotubuli dynamikk og funksjon moduleres av interaksjoner med andre proteiner, slik som MAP1, MAP2, Tau, Katanin og Kinesin 1,2,3,4,5.
I nevroner er mikrotubuli avgjørende for utvikling og vedlikehold av aksoner og dendritter. Abnormaliteter i mikrotubuli fører til dysfunksjon og til og med død av nevroner. For eksempel, i hjernen til Alzheimers pasienter, reduserer Tau-protein hyperfosforylering stabiliteten til mikrotubulinettverket, noe som forårsaker nevrologiske uregelmessigheter6. Dermed vil undersøkelse av mikrotubulinettverk bidra til en forståelse av nevroutvikling og patogenesen av nevrologiske sykdommer.
Det nevromuskulære veikrysset (NMJ) er den perifere synapsen dannet mellom en motorneuronaksonterminal og en muskelfiber, som er et utmerket og kraftig modellsystem for å studere synaptisk struktur og funksjoner7. Futsch er et protein i Drosophila som er homologt med det mikrotubulibindende proteinet MAP1B som finnes hos pattedyr8. Det uttrykkes bare i nevroner og spiller en rolle i utviklingen av NMJs synaptiske knapper 8,9. I villtype visualiseres filamentøse bunter som går langs midten av NMJ-prosesser ved immunfarging med anti-Futsch. Når den når NMJs ende, har denne bunten evnen til enten å danne en sløyfe bestående av mikrotubuli eller å miste sin trådformede struktur, noe som resulterer i et diffust og punktert utseende10. Mikrotubuli sløyfer er assosiert med pauset vekstkjegler, noe som antyder at mikrotubuli-matrisen er stabil11. Derfor kan vi indirekte bestemme den stabile mikrotubuliutviklingen i NMJ ved Futsch-farging. Den store størrelsen på muskelceller i Drosophila larven muliggjør klar visualisering av mikrotubulinettverket. Faktorene som påvirker stabiliteten til mikrotubuli-nettverket kan bli funnet ved å analysere tettheten og formen til mikrotubuli. Samtidig kan mikrotubuli nettverksstatus for muskelceller kryssverifiseres med resultatet av NMJ for å oppnå mer omfattende konklusjoner.
Mange protokoller har blitt brukt for å undersøke nettverket og dynamikken til mikrotubuli. Imidlertid har disse undersøkelsene ofte fokusert på in vitro-studier 12,13,14,15,16. Alternativt har noen in vivo-eksperimenter brukt elektronmikroskopi for å oppdage cytoskjelettet17. I henhold til den spesifikke bindingen av fluorescerende merkede antistoffer eller kjemiske fargestoffer til proteiner eller DNA, tillater metodene som presenteres her deteksjon av mikrotubulinettverk i NMJ på nivået av individuelle nevroner in vivo, med resultater bekreftet av observasjoner i muskelceller. Denne protokollen er enkel, stabil og repeterbar når den kombineres med de kraftige genetiske verktøyene som er tilgjengelige i Drosophila melanogaster, noe som muliggjør et mangfoldig utvalg av fenotypiske undersøkelser og genetiske screeninger for rollen som mikrotubulinettverksregulatoriske proteiner i nervesystemet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Disseksjon av larver
MERK: Dissekeringsløsningen hemolymfelignende saltvann (HL3.1)18 og fikseringsløsningen 4% paraformaldehyd (PFA)19,20 brukes ved romtemperatur fordi mikrotubuli depolymeriseres når temperaturen er for lav.
- Plukk ut envandrende 3 rd instar larve med lang, butt tang. Vask den med HL3.1 og legg den på disseksjonsfatet under stereomikroskopet.
MERK: Vandrende 3. stjernelarve identifiseres ved forgrenet fremre spirakel og kryper rundt røret ved ca. 96 timer (25 °C)21. - Plasser larven med dorsal- eller ventralsiden opp. Identifiser dorsalsiden ved de to lange luftrørene og den ventrale ved bukbeltene.
- Avhengig av vevet som skal observeres, velger du dorsal eller ventral disseksjon. Dette vil gi en mer presis og detaljert oversikt over det spesifikke interesseområdet. For NMJ og muskelcelleobservasjon, kutt åpne henholdsvis larvens dorsale og ventrale regioner.
- Pin munnkrokene og halen. Juster pinnene for å holde larven i utvidet tilstand. Tilsett en dråpe HL3.1 til larven for å forhindre at den tørker ut.
MERK: Ca2+ -fri HL 3.1 kan brukes til å minimere sammentrekning av musklene under disseksjon. - Bruk dissekeringssaksen til å lage et lite tverrsnitt nær den bakre enden, men ikke klipp av den bakre enden. Skjær deretter langs den ventrale midtlinjen mot den fremre enden.
- Sett inn fire insektpinner på larvens fire hjørner. Juster insektpinnene slik at larven strekkes maksimalt i alle retninger.
- Bruk tangen til å fjerne indre organer mens du ikke skader musklene.
2. Fiksering
- Tilsett 100 μL PFA (4%) for å fordype i 40 minutter mens slaktene fortsatt er festet på dissekereskålen.
FORSIKTIG: Effektive beskyttelsestiltak er tatt for å unngå direkte kontakt med hud eller innånding, da PFA er en fare. - Demonter pinnene og overfør prøven til et 2 ml mikrosentrifugerør. Skyll av PFA med 1x fosfatbufret saltvann inneholdende 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST) for å fylle 2 ml mikrosentrifugerør i 10 minutter på avfargingshakeren ved 15 o / min. Gjenta vaskeprosessen 5x.
3. Immunocytokjemi
- Dypp slaktkroppene i blokkeringsmiddel (5% geitserum i 0,2% PBST) og blokker i 40 minutter ved romtemperatur.
- Fjern blokkeringsmidlet og erstatt det med 200 mikrol av det primære antistoffet (f.eks. anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) fortynnet med 0,2 % PBST ved 4 °C over natten. Visualiser muskelmikrotubuli ved immunfarging med monoklonalt anti-α-tubulin. Anti-Futsch kan indirekte reflektere mikrotubulimorfologien i NMJ.
- Etter inkubering av det primære antistoffet, vask larver med 0,2% PBST i 10 minutter. Gjenta 5x.
- Inkuber larvene med 200 μL sekundært antistoff (f.eks. geitanti-mus-488, 1:1000) fortynnet med 0,2% PBST ved romtemperatur i 1,5 timer i mørket.
- Deretter tilsettes et kjernefysisk fargestoff som TO-PRO (R) 3-jodid (T3605) i en konsentrasjon på 1:1000 i inkubasjonsrøret i 30 minutter når du farger mikrotubuli i mørket20,22.
- Skyll av det sekundære antistoffet og det nukleære fargestoffet med 0,2% PBST i 10 minutter. Gjenta 5x i mørket.
4. Montering
- Plasser larvekadaveret i 0,2% PBST på et glassglass og juster det under stereomikroskopet. Pass på at den indre overflaten av larvekroppen vender opp og at alle larvekropper er ordnet etter ønske.
- Absorber overflødig PBST-oppløsning med en våtserviett og tilsett forsiktig en dråpe antifademonteringsmedium.
- Legg en dekkseddel på lysbildet for å dekke de dissekerte larvene sakte og forsiktig for å unngå bobler.
- Påfør neglelakk rundt dekselet. Plasser lysbildet i det mørke rommet for å redusere fluorescerende demping.
5. Oppkjøp av bilder
- For å skaffe bildene, bruk et laserskanning konfokalmikroskop, velg 60x oljenedsenkingsmål (numerisk blenderåpning 1.42) eller lignende, og juster laserstyrken og bølgelengden basert på eksperimentet.
- For å identifisere NMJ, ta bilder i muskel 4 i segment A3 (som vist på stedet i figur 1F). Velg en 488 nm laser for å aktivere α-tubulin eller Futsch og 543 nm for å aktivere HRP-bildesporet. Juster parametrene til en bildestørrelse på 800 piksler x 800 piksler, en digital zoom på 2,0 og et bildeintervall på 0,8 μm i NMJ-er (figur 2).
- For å identifisere mikrotubuli i muskel, ta bilder av muskel 2 i segment A3-A5 (som vist på stedet i figur 1G) da den har færre trakeale grener. Velg en 488 nm laser for å aktivere α-tubulin og en 635 nm laser for å aktivere T3605-bildesporet. Juster parametrene til en bildestørrelse på 1024 piksler x 1024 piksler, en digital zoom på 3,0 og et bildeintervall på 0,4 μm i muskelceller (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrerte en trinnvis prosedyre for visualisering av mikrotubulinettverket i både nevromuskulære veikryss (NMJ) og muskelceller. Etter disseksjon i henhold til skjematisk diagram (figur 1A-E) utføres immunfarging, og bilder observeres og samles deretter under et laserkonfokalmikroskop eller et stereoskopisk fluorescensmikroskop (figur 1F,G).
Både pre- og postsynaptisk mikrotubuli organisering av NMJ kunne merkes med anti-α-tubulin, og ved å velge lagtykkelsen til laserskanningens konfokale mikroskop, ville mikrotubulimorfologien til forskjellige skiver bli vist (figur 2A-C). Futsch har også blitt brukt til nevral sporing ved å avsløre mikrotubuliorganisasjonen i aksonene til nevroner. Anti-HRP brukes til å merke nevronmembranen 10,23,24. Co-farging med anti-Futsch og anti-HRP antistoffer utføres for å oppdage mikrotubuli status i aksoner av nevroner. Futschfarging kan gjenspeile overflod av stabile mikrotubuli i de presynaptiske nevronene til NMJ9. Tubulinspesifikk chaperone E (TBCE) spiller en avgjørende rolle i utviklingen av MT-cytoskjelettet. Når TBCE slås ned i presynaptiske nevroner, blir signalet fra anti-Futsch svakere og tynnere, og fargingen i terminalboutonene er enten uåpenbar eller fraværende23. Tau er et mikrotubuliassosiert protein som har en viktig rolle i mikrotubuli montering og stabilisering25,26. I Drosophila med ektopisk ekspresjon av humant villtype og mutant humant Tau-protein, avsløres en reduksjon i intensiteten av Futsch-signalet ved NMJ-terminalene20. Ifølge resultatene av Futsch-farging var fargeintensiteten til aksonstammen sterkere enn grenene (figur 2D-F). Mikrotubuli på enden av grenene er mindre stabile og mer utsatt for morfologiske forandringer, slik at dynamikken til mikrotubuli kan reflekteres ved farging av terminale mikrotubuli.
Morfologiske endringer av mikrotubuli kan også lett visualiseres22. Microtubule løkker kan farges med anti-Futsch og anti-α-tubulin. Videre kan formen på en enkelt sløyfe vises tydelig, noe som letter kvantitativ analyse. For eksempel er Katanin et mikrotubuli-kuttende protein som spiller en viktig rolle i reguleringen av mikrotubulidynamikk. Den katalytiske subenheten Katanin 60 er rapportert å ha effekt på morfologien til mikrotubuli22. Mao har konstruert Katanin 60 mutant ved P-elementmediert eksisjon og uas-Katanin 60 ved å sette inn pUAST-attB-Katanin 60 i det andre kromosomet ved 51D. Økningen i mikrotubuli sløyfer forårsaket av Katanin 6017A mutasjoner ble tydelig demonstrert (figur 2A,B,D,E). I tillegg, i overekspresjonen av Katanin 60, kunne korte MT-fragmenter også observeres signifikant i terminalboutonene (figur 2C).
Mikrotubulinettverket kan observeres ved farging med α-tubulinantistoffer i muskelceller. Et nettverk av mikrotubuli som strakte seg rundt kjernen var godt synlig (figur 3A). Mikrotubuli kuttprotein Katanin regulerer fordelingen av mikrotubuli nettverket22. I Katanin 6017A mutant hadde muskelceller en signifikant økt perinukleær MT-intensitet og viste sterkere bunter sammenlignet med villtypen (figur 3B). Fragmentering av mikrotubulifibre forårsaket av overekspresjon av Katanin 60 var representert (figur 3C). Dermed muliggjør protokollen mikrotubuli nettverksvisualisering i både nevroner og muskelceller.
Figur 1. Dorsal disseksjonsprosedyre av Drosophila larve. (A-E) Prosedyren for fremstilling av larvalkroppe (modifisert fra21). (A) Sett inn to pinner hver i munnkrokene og halen til en larve. (B) Bruk dissekeringssaksen til å lage et lite tverrsnitt nær den bakre enden. (C) Skjær langs den ventrale midtlinjen mot den fremre enden. (D) Sett inn fire insektpinner på larvens fire hjørner. (E) Bruk tang for å fjerne indre organer og juster posisjonen til pinnene for å plassere larven i en passende posisjon for fotografering. (F) Phalloidin brukes til å merke cytoskjelettet for å visualisere muskelen, og HRP brukes til å merke cellemembranen til nevroner. Den observerte regionen av NMJ er begrenset til muskel 4 i segment A3, samtidig farget med anti-HRP (grønn) og falloidin (magenta). Det høyre panelet viser en skjematisk fremstilling av den lokale muskelstrukturen. Rammestørrelsen på 1024 piksler x 1024 piksler, digital zoom på 0,6 og et bildeintervall på omtrent 4 μm ved bruk av et 10x objektivobjektivt objektivobjektiv (numerisk blenderåpning 0,45). (G) Det observerte området av muskelcellene er begrenset til muskel 2 i segmentene A3 til A5, farget med falloidin (magenta). Enkeltseksjonen fanges opp av et stereoskopisk fluorescensmikroskop. Skala bar: 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Konfokale bilder av mikrotubuli innen NMJ av anti-α-tubulin eller anti-Futsch. NMJ-terminaler med w1118 kontroll (A), Katanin 60 17A mutant (B) og nevronal overekspresjon av Katanin 60 (C), samtidig farget med anti-HRP (rød) og anti-α-tubulin (grønn) er vist i venstre kolonne. Bildene er projeksjoner fra komplette z-stabler gjennom hele muskel 4 NMJ i buksegmentet A3. Den midterste kolonnen viser et klarere bilde av mikrotubuli i NMJ-terminalene ved å fjerne mikrotubuli fra muskelen. Den høyre kolonnen viser morfologien til mikrotubuli i synaptiske boutoner ved hjelp av analyseprogramvaren. Skala bar: 1 μm. NMJ terminaler av forskjellige genotyper co-farget med anti-HRP (rød) og anti-Futsch (grønn) (D-F). MT-løkker ble indikert med piler. Skala bar: 5 μm. Dette tallet er tilpasset fra22. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Perinukleær mikrotubuli nettverksfarging i Drosophila larve muskelceller. (AC) Larvemuskulatur er farget sammen med anti-α-tubulin (grønn) for å vise mikrotubulinettverket og T3605 (blå) for å vise kjernen for w1118 kontroll (A), Katanin 60 17A mutant (B) og Katanin 60 overekspresjon i muskelsystemet (C). Bildene er projeksjoner fra komplette z-stabler fra utseendet til mikrotubuli til sentrum av kjernefysika. Skala bar: 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en protokoll for disseksjon og immunfarging av Drosophila larve, nevromuskulære veikryss og muskelceller. Det er flere viktige punkter å vurdere. For det første er det viktig å unngå skade på de observerte musklene under disseksjonsprosessen. Det kan være verdt å feste fileten før du fjerner indre organer for å hindre direkte kontakt mellom tangen og musklene. For å unngå muskelskade eller separasjon fra larveepidermis, er det viktig å sikre at shakerens hastighet ikke overstiger 15 o / min under vask og inkubasjon. I tillegg er presis kontroll over hudforlengelse nødvendig for å sikre klar og fullstendig fotografering av NMJ-morfologi. Det anbefales å gjennomføre foreløpige eksperimenter for å optimalisere antistoffkonsentrasjonen, fiksering, blokkering og inkubasjonstider. Den faste varigheten er begrenset til ca. 40 min. For kort eller for lang bidrar ikke til immunfarging av mikrotubulinettverket.
Mikrotubuli i nevroner er tettpakket og utfordrende å visualiseres tydelig ved hjelp av konvensjonell mikroskopi. Sammenlignet med nevroner er muskelcellene til Drosophila spesielt store, med muskel 2 av segment A3 som måler opptil 40 μm x 150 μm, noe som gjør den egnet til høyoppløselig bildebehandling. Derfor er bruk av Drosophila muskelceller for å undersøke reguleringen av mikrotubuli nettverksassosierte proteiner en intuitiv og klar tilnærming som har betydelig verdi for å validere NMJ-fenotyper20,22,23. Sammenlignet med den tidligere metode27 har vi endret disseksjonsretningen fra dorsalen til magen for å oppnå et uhindret objekt. Elusjonsbufferen i muskelen med 0,2% PBST er relativt mild og bidrar til å bevare muskelintegriteten.
Det er fortsatt noen begrensninger for denne tilnærmingen. Som et mikrotubulibindende protein uttrykkes Futsch utelukkende i nevroner og kan indirekte representere polymeriserte mikrotubuli. Men hvis bare Futsch brukes til å visualisere mikrotubulinettverket under interaksjonsscreening, kan noen kandidatproteiner bli savnet. α-tubulin eller β-tubulin kan direkte representere mikrotubuli-nettverket, men disse to proteinene presenterer både presynaptisk og postsynaptisk, og det er noen ganger vanskelig å skille. Videre fordeles et stort antall α/β-tubulinheterodimerer i cytoplasma, noe som betyr at merking av enten α-tubulin eller β-tubulin kanskje ikke er egnet for levende avbildning, da både polymerisert og ikke-polymerisert tubulin kan observeres samtidig.
Observasjon av mikrotubuli fra motorneuroner til muskelceller kan gi en omfattende forståelse av bevegelsesmekanismer fra nevrale kretsers perspektiv, noe som letter studiet av nevrodevelopmental prosesser og patogenesen av nevrologiske sykdommer. Visualisering av mikrotubulinettverket i forskjellige modellsystemer er gunstig for å verifisere genfunksjon fra flere perspektiver ved hjelp av denne protokollen. Denne metoden kan også brukes til å observere de postsynaptiske reseptorene til NMJ, noe som er gunstig for studiet av kommunikasjon mellom synapser og synaptisk plastisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ying Xiong for diskusjoner og kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet støttes av et tilskudd fra National Science Foundation of China (NSFC) til CM (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
