Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att visualisera mikrotubulinätverken i neuromuskulära korsningar och muskelceller. I kombination med de kraftfulla genetiska verktygen hos Drosophila melanogaster, underlättar detta protokoll i hög grad genetisk screening och mikrotubulidynamisk analys för rollen som mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet.
Abstract
Mikrotubulinätverket är en viktig komponent i nervsystemet. Mutationer i många mikrotubuliregulatoriska proteiner är associerade med utvecklingsneurologiska funktionsnedsättningar och neurologiska sjukdomar, såsom mikrotubuli-associerat protein Tau till neurodegenerativa sjukdomar, mikrotubuliavskiljande protein Spastin och Katanin 60 orsakar ärftlig spastisk paraplegi respektive utvecklingsneurologiska avvikelser. Detektion av mikrotubulinätverk i nervceller är fördelaktigt för att belysa patogenesen av neurologiska sjukdomar. Den lilla storleken på neuroner och det täta arrangemanget av axonala mikrotubulibuntar gör det dock utmanande att visualisera mikrotubulinätverken. I denna studie beskriver vi en metod för dissektion av larvneuromuskulära förbindelser och muskelceller, samt immunfärgning av α-tubulin och mikrotubuli-associerat protein Futsch för att visualisera mikrotubulinätverk i Drosophila melanogaster. Den neuromuskulära förbindelsen gör det möjligt för oss att observera både pre- och postsynaptiska mikrotubuli, och den stora storleken på muskelcellerna i Drosophila-larven möjliggör tydlig visualisering av mikrotubulinätverket. Här, genom att mutera och överuttrycka Katanin 60 i Drosophila melanogaster, och sedan undersöka mikrotubulinätverken i den neuromuskulära förbindelsen och muskelcellerna, avslöjar vi exakt den reglerande rollen för Katanin 60 i neuroutveckling. Därför, i kombination med de kraftfulla genetiska verktygen hos Drosophila melanogaster, underlättar detta protokoll i hög grad genetisk screening och analys av mikrotubulidynamik för rollen som mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet.
Introduction
Mikrotubuli (MT), som en av de strukturella komponenterna i cytoskelettet, spelar en viktig roll i olika biologiska processer, inklusive celldelning, celltillväxt och motilitet, intracellulär transport och underhåll av cellform. Mikrotubulidynamik och funktion moduleras av interaktioner med andra proteiner, såsom MAP1, MAP2, Tau, Katanin och Kinesin 1,2,3,4,5.
I neuroner är mikrotubuli viktiga för utveckling och underhåll av axoner och dendriter. Avvikelser i mikrotubuli leder till dysfunktion och till och med neuronerdöd. Till exempel, i hjärnan hos Alzheimerspatienter, minskar Tau-proteinhyperfosforylering stabiliteten i mikrotubulinätverket, vilket orsakar neurologiska oregelbundenheter6. Således kommer undersökning av mikrotubulinätverk att bidra till en förståelse av neuroutveckling och patogenesen av neurologiska sjukdomar.
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är den perifera synapsen som bildas mellan en motorneuronaxonterminal och en muskelfiber, vilket är ett utmärkt och kraftfullt modellsystem för att studera synaptisk struktur och funktioner7. Futsch är ett protein i Drosophila som är homologt med det mikrotubulibindande proteinet MAP1B som finns hosdäggdjur8. Det uttrycks endast i neuroner och spelar en roll i utvecklingen av NMJ:s synaptiska knappar 8,9. I vildtyp visualiseras filamentösa buntar som löper längs mitten av NMJ-processer genom immunfärgning med anti-Futsch. När den når NMJ:s ände har denna bunt förmågan att antingen bilda en slinga bestående av mikrotubuli eller förlora sin trådformiga struktur, vilket resulterar i ett diffust och punkterat utseende10. Mikrotubulislingor är associerade med pausade tillväxtkoner, vilket tyder på att mikrotubulimatrisen är stabil11. Därför kan vi indirekt bestämma den stabila mikrotubuliutvecklingen i NMJ genom Futsch-färgning. Den stora storleken på muskelcellerna i Drosophila-larven möjliggör en tydlig visualisering av mikrotubulinätverket. De faktorer som påverkar stabiliteten i mikrotubulinätverket kan hittas genom att analysera mikrotubulis densitet och form. Samtidigt kan muskelcellernas mikrotubulinätverksstatus korsverifieras med resultatet av NMJ för att få mer omfattande slutsatser.
Många protokoll har använts för att undersöka nätverket och dynamiken hos mikrotubuli. Dessa undersökningar har dock ofta fokuserat på in vitro-studier 12,13,14,15,16. Alternativt har vissa in vivo-experiment använt elektronmikroskopi för att detektera cytoskelettet17. Enligt den specifika bindningen av fluorescerande märkta antikroppar eller kemiska färgämnen till proteiner eller DNA, möjliggör de metoder som presenteras här detektion av mikrotubulinätverk i NMJ på nivån av enskilda neuroner in vivo, med resultat som bekräftas av observationer i muskelceller. Detta protokoll är enkelt, stabilt och repeterbart när det kombineras med de kraftfulla genetiska verktyg som finns tillgängliga i Drosophila melanogaster, vilket möjliggör ett brett spektrum av fenotypiska undersökningar och genetiska screeningar för rollen av mikrotubulinätverkets reglerande proteiner i nervsystemet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissektion av larver
OBS: Dissektionslösningen hemolymfliknande koksaltlösning (HL3.1)18 och fixeringslösningen 4% paraformaldehyd (PFA)19,20 används vid rumstemperatur eftersom mikrotubuli depolymeriseras när temperaturen är för låg.
- Välj ut envandrande 3:e stjärnlarv med lång trubbig pincett. Tvätta den med HL3.1 och placera den på dissektionsskålen under stereomikroskopet.
OBS: Vandrande 3:e stjärnlarven identifieras av grenad främre spiracle och kryper runt röret vid cirka 96 h (25 °C)21. - Placera larven med rygg- eller buksidan uppåt. Identifiera den dorsala sidan med de två långa luftstruparna och den ventrala med buktandsbältena.
- Beroende på vilken vävnad som ska observeras, välj dorsal eller ventral dissektion. Detta kommer att möjliggöra en mer exakt och detaljerad bild av det specifika intresseområdet. För NMJ- och muskelcellsobservation, skär upp larvens dorsala respektive ventrala regioner.
- Nåla fast munkrokarna och svansen. Justera stiften för att hålla larven i ett förlängt tillstånd. Tillsätt en droppe HL3.1 till larven för att förhindra att den torkar.
OBS: Ca2+ -fri HL 3.1 kan användas för att minimera sammandragning av musklerna under dissektion. - Använd dissekeringssaxen för att göra ett litet tvärgående snitt nära den bakre änden, men klipp inte av den bakre änden. Skär sedan längs den ventrala mittlinjen mot den främre änden.
- Sätt in fyra insektsnålar i larvens fyra hörn. Justera insektsstiften så att larven sträcks maximalt åt alla håll.
- Använd pincetten för att ta bort inre organ utan att skada musklerna.
2. Fixering
- Tillsätt 100 μl PFA (4 %) för att sänka ner slaktkropparna i 40 minuter medan slaktkropparna fortfarande sitter fast på dissekeringsskålen.
VARNING: Effektiva skyddsåtgärder vidtas för att undvika direktkontakt med hud eller inandning, eftersom PFA är en fara. - Demontera stiften och överför sample till ett 2 ml mikrocentrifugrör. Skölj av PFA med 1x fosfatbuffrad koksaltlösning innehållande 0.2% Triton X-100 (0.2% PBST) för att fylla 2 ml mikrocentrifugrör i 10 min på avfärgningsshakern vid 15 rpm. Upprepa tvättprocessen 5 gånger.
3. Immunocytokemi
- Sänk ned slaktkropparna i blockeringsmedel (5 % getserum i 0,2 % PBST) och blockera i 40 minuter i rumstemperatur.
- Ta bort blockeringsmedlet och ersätt det med 200 μl av den primära antikroppen (t.ex. anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) utspädd med 0,2 % PBST vid 4 °C över natten. Visualisera muskelmikrotubuli genom immunfärgning med monoklonalt anti-α-tubulin. Anti-Futsch kan indirekt återspegla mikrotubulimorfologin i NMJ.
- Efter inkubation av den primära antikroppen, tvätta larverna med 0,2 % PBST i 10 minuter. Upprepa 5 gånger.
- Inkubera larverna med 200 μL sekundär antikropp (t.ex. get anti-Mouse-488, 1:1000) utspädd med 0,2 % PBST vid rumstemperatur i 1,5 timmar i mörker.
- Tillsätt sedan ett kärnfärgämne som TO-PRO(R) 3-jodid (T3605) i en koncentration av 1:1000 i inkubationsröret i 30 minuter vid färgning av mikrotubuli i mörker20,22.
- Skölj av den sekundära antikroppen och kärnfärgen med 0,2 % PBST i 10 min. Upprepa 5 gånger i mörker.
4. Montering
- Placera larvkroppen i 0,2 % PBST på ett glasglas och justera den under stereomikroskopet. Se till att larvkroppens inre yta är vänd uppåt och att alla larvkroppar är ordnade som önskat.
- Absorbera överflödig PBST-lösning med en våtservett och tillsätt försiktigt en droppe antiblekningsmonteringsmedium.
- Lägg ett täckglas på objektglaset för att täcka de dissekerade larverna långsamt och försiktigt för att undvika bubblor.
- Applicera nagellack runt täckglaset. Placera objektglaset i det mörka utrymmet för att minska fluorescerande dämpning.
5. Bildtagning
- För att ta bilderna, använd ett laserskanningskonfokalmikroskop, välj 60x oljenedsänkningsobjektivet (numerisk bländare 1,42) eller liknande och justera laserns effekt och våglängd baserat på experimentet.
- För att identifiera NMJ, ta bilder i muskel 4 i segment A3 (som visas på platsen i figur 1F). Välj en 488 nm laser för att aktivera α-tubulin eller Futsch och 543 nm för att aktivera HRP-bildspåret. Justera parametrarna till en bildstorlek på 800 pixlar x 800 pixlar, en digital zoom på 2,0 och ett bildintervall på 0,8 μm i NMJ (figur 2).
- För att identifiera mikrotubuli i muskeln, ta bilder av muskel 2 i segment A3-A5 (som visas på platsen i figur 1G) eftersom den har färre trakealgrenar. Välj en 488 nm laser för att aktivera α-tubulin och en 635 nm laser för att aktivera T3605 bildspåret. Justera parametrarna till en bildstorlek på 1024 pixlar x 1024 pixlar, en digital zoom på 3,0 och ett bildintervall på 0,4 μm i muskelceller (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrerade en steg-för-steg-procedur för att visualisera mikrotubulinätverket i både neuromuskulära korsningar (NMJ) och muskelceller. Efter dissektion enligt det schematiska diagrammet (Figur 1A-E) utförs immunfärgning och bilder observeras därefter och samlas in under ett laserkonfokalmikroskop eller ett stereoskopiskt fluorescensmikroskop (Figur 1F,G).
Både pre- och postsynaptisk mikrotubuliorganisation av NMJ kunde märkas med anti-α-tubulin, och genom att välja skikttjockleken på laserskanningskonfokalmikroskopet skulle mikrotubulimorfologin för olika skivor visas (Figur 2A-C). Futsch har också använts för neural spårning genom att avslöja mikrotubuliorganisationen i nervcellernas axoner. Anti-HRP används för att märka neuronalmembranet 10,23,24. Samfärgning med anti-Futsch- och anti-HRP-antikroppar utförs för att detektera mikrotubulistatus i nervcellers axoner. Futsch-färgning kan återspegla överflödet av stabila mikrotubuli i de presynaptiska neuronerna i NMJ9. Tubulinspecifikt chaperon E (TBCE) spelar en avgörande roll i utvecklingen av MT-cytoskelettet. När TBCE slås ner i presynaptiska neuroner blir signalen av anti-Futsch svagare och tunnare, och färgningen i de terminala boutonerna är antingen otydlig eller frånvarande23. Tau är ett mikrotubuliassocierat protein som har en viktig roll i mikrotubulimontering och stabilisering25,26. Hos Drosophila med ektopiskt uttryck av humant vildtyps- och muterat humant Tau-protein avslöjas en minskning av intensiteten av Futsch-signalen vid NMJ-terminalerna20. Enligt resultaten av Futsch-färgning var färgningsintensiteten hos axonstammen starkare än hos grenarna (Figur 2D-F). Mikrotubuli i slutet av grenar är mindre stabila och mer benägna till morfologiska förändringar, så mikrotubulis dynamik kan återspeglas genom färgning av de terminala mikrotubuli.
Morfologiska förändringar av mikrotubuli kan också enkelt visualiseras22. Mikrotubuliöglor kan färgas med anti-Futsch och anti-α-tubulin. Dessutom kan formen på en enda slinga visas tydligt, vilket underlättar kvantitativ analys. Katanin är till exempel ett mikrotubuliavskiljande protein som spelar en viktig roll i regleringen av mikrotubulidynamiken. Den katalytiska subenheten Katanin 60 har rapporterats ha en effekt på morfologin hos mikrotubuli22. Mao har konstruerat Katanin 60-mutanten genom P-elementmedierad excision och uas-Katanin 60 genom att sätta in pUAST-attB-Katanin 60 i den andra kromosomen vid 51D. Ökningen av mikrotubulislingor orsakade av Katanin 60 17A-mutationer visades tydligt (Figur 2A,B,D,E). Dessutom, i överuttrycket av Katanin 60, kunde korta MT-fragment också observeras signifikant inom de terminala boutonerna (Figur 2C).
Mikrotubulinätverket kan observeras genom färgning med α-tubulinantikroppar i muskelceller. Ett nätverk av mikrotubuli som sträckte sig runt kärnan var tydligt synligt (Figur 3A). Det mikrotubuliavskiljande proteinet Katanin reglerar fördelningen av mikrotubulinätverket22. I Katanin 6017A-mutanten hade muskelcellerna en signifikant ökad perinukleär MT-intensitet och uppvisade starkare knippen jämfört med vildtypen (Figur 3B). Fragmentering av mikrotubulifibrer orsakad av överuttryck av Katanin 60 var representerad (Figur 3C). Således möjliggör protokollet visualisering av mikrotubulinätverk i både neuroner och muskelceller.
Figur 1. Dorsal dissektionsprocedur av Drosophila-larv . (A-E) Förfarandet för beredning av slaktkroppar av larver (ändrat från21). (A) Stick in två stift vardera i munkrokarna och svansen på en larv. (B) Använd dissekeringssaxen för att göra ett litet tvärgående snitt nära den bakre änden. (C) Skär längs den ventrala mittlinjen mot den främre änden. (D) Sätt in fyra insektsstift i larvens fyra hörn. (E) Använd en pincett för att ta bort inre organ och justera stiftens position för att placera larven i en lämplig position för fotografering. (F) Falloidin används för att märka cytoskelettet för att visualisera muskeln, och HRP används för att märka cellmembranet hos neuroner. Den observerade regionen av NMJ är begränsad till muskel 4 i segment A3, samfärgad med anti-HRP (grön) och falloidin (magenta). Den högra panelen visar en schematisk representation av den lokala muskelstrukturen. Ramstorleken på 1024 pixlar x 1024 pixlar, digital zoom på 0,6 och ett bildintervall på cirka 4 μm med en 10x objektivlins (numerisk bländare 0,45). (G) Det observerade området av muskelcellerna är begränsat till muskel 2 i segmenten A3 till A5, färgade med falloidin (magenta). Den enskilda sektionen fångas av ett stereoskopiskt fluorescensmikroskop. Skalstapel: 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Konfokalbilder av mikrotubuli inom NMJ med anti-α-tubulin eller anti-Futsch. NMJ-terminaler av w1118-kontroll (A), Katanin 60 17A-mutant (B) och neuronalt överuttryck av Katanin 60 (C), samfärgat med anti-HRP (rött) och anti-α-tubulin (grönt) visas i den vänstra kolumnen. Bilderna är projektioner från kompletta z-stackar genom hela muskeln 4 NMJ i buksegmentet A3. Den mellersta kolumnen visar en tydligare bild av mikrotubuli i NMJ-terminalerna genom att ta bort mikrotubuli från muskeln. Den högra kolumnen visar morfologin hos mikrotubuli i synaptiska boutoner med hjälp av analysprogrammet. Skalstreck: 1 μm. NMJ-terminaler av olika genotyper samfärgade med anti-HRP (röd) och anti-Futsch (grön) (D-F). MT-slingor indikerades med pilar. Skalstreck: 5 μm. Denna siffra har anpassats från22. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Perinukleär mikrotubulinätverksfärgning i Drosophila-larvmuskelcellerna. (A-C) Larvmusklerna samfärgas med anti-α-tubulin (grönt) för att visa mikrotubulinätverket och T3605 (blått) för att visa kärnan för w1118-kontroll (A), Katanin 60 17A-mutant (B) och Katanin 60-överuttryck i muskelsystemet (C). Bilderna är projektioner från kompletta z-stackar från utseendet på mikrotubuli till kärnans centrum. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs ett protokoll för dissektion och immunfärgning av neuromuskulära neuromuskulära förbindelser och muskelceller hos Drosophila-larver . Det finns flera viktiga punkter att tänka på. För det första är det viktigt att undvika skador på de observerade musklerna under dissektionsprocessen. Det kan vara värt att fixa filén innan man tar bort inre organ för att förhindra direktkontakt mellan pincetten och musklerna. För att undvika muskelskador eller separation från larvepidermis är det viktigt att se till att shakerns hastighet inte överstiger 15 rpm under tvätt och inkubation. Dessutom är exakt kontroll över hudförlängningen nödvändig för att säkerställa tydlig och fullständig fotografering av NMJ-morfologi. Det är tillrådligt att utföra preliminära experiment för att optimera antikroppskoncentrationen, fixeringen, blockeringen och inkubationstiderna. Den fasta tiden är begränsad till cirka 40 minuter. För kort eller för lång bidrar inte till immunfärgning av mikrotubulinätverket.
Mikrotubuli i nervceller är tätt packade och utmanande att visualisera tydligt med konventionell mikroskopi. Jämfört med nervceller är muskelcellerna hos Drosophila anmärkningsvärt stora, med muskel 2 i segment A3 som mäter upp till 40 μm x 150 μm, vilket gör den mottaglig för högupplöst avbildning. Att använda Drosophila-muskelceller för att undersöka regleringen av mikrotubulinätverksassocierade proteiner är därför ett intuitivt och tydligt tillvägagångssätt som har ett betydande värde för att validera NMJ-fenotyper20,22,23. Jämfört med den tidigare metoden27 har vi ändrat dissektionsriktningen från ryggen till buken för att få ett fritt föremål. Elueringsbufferten i muskeln med 0,2 % PBST är relativt skonsam och hjälper till att bevara muskelintegriteten.
Det finns fortfarande vissa begränsningar för den här metoden. Som ett mikrotubulibindande protein uttrycks Futsch uteslutande i neuroner och kan indirekt representera polymeriserade mikrotubuli. Men om endast Futsch används för att visualisera mikrotubulinätverket under interaktionsscreening kan vissa kandidatproteiner missas. α-tubulin eller β-tubulin kan direkt representera mikrotubulinätverket, men dessa två proteiner presenterar både presynaptiskt och postsynaptiskt, och det är ibland svårt att skilja åt. Dessutom är ett stort antal α/β-tubulinheterodimerer fördelade i cytoplasman, vilket innebär att märkning av antingen α-tubulin eller β-tubulin kanske inte är lämplig för levande avbildning, eftersom både polymeriserat och icke-polymeriserat tubulin kan observeras samtidigt.
Att observera mikrotubuli från motorneuroner till muskelceller kan ge en omfattande förståelse av rörelsemekanismerna ur neurala kretsars perspektiv, vilket underlättar studiet av neuroutvecklingsprocesser och patogenesen av neurologiska sjukdomar. Att visualisera mikrotubulinätverket i olika modellsystem är fördelaktigt för att verifiera genfunktion från flera perspektiv med hjälp av detta protokoll. Denna metod kan också användas för att observera de postsynaptiska receptorerna för NMJ, vilket är fördelaktigt för studiet av kommunikation mellan synapser och synaptisk plasticitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Ying Xiong för diskussioner och kommentarer om manuskriptet. Detta arbete stöds av ett anslag från National Science Foundation of China (NSFC) till C. M. (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
