Summary
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til visualisering af mikrotubulusnetværkene i neuromuskulære kryds og muskelceller. Kombineret med de kraftfulde genetiske værktøjer i Drosophila melanogaster letter denne protokol i høj grad genetisk screening og mikrotubulus-dynamikanalyse for mikrotubulusnetværksregulerende proteiners rolle i nervesystemet.
Abstract
Mikrotubulusnetværket er en væsentlig bestanddel af nervesystemet. Mutationer i mange mikrotubuli regulatoriske proteiner er forbundet med neurodevelopmental lidelser og neurologiske sygdomme, såsom mikrotubulus-associeret protein Tau til neurodegenerative sygdomme, mikrotubulus skæreprotein Spastin og Katanin 60 forårsager henholdsvis arvelige spastiske paraplegi og neurodevelopmental abnormiteter. Påvisning af mikrotubulusnetværk i neuroner er fordelagtigt til belysning af patogenesen af neurologiske lidelser. Imidlertid gør den lille størrelse af neuroner og det tætte arrangement af aksonale mikrotubulusbundter visualisering af mikrotubulusnetværkene udfordrende. I dette studie beskriver vi en metode til dissektion af larvens neuromuskulære kryds og muskelceller samt immunfarvning af α-tubulin og mikrotubulusassocieret protein Futsch for at visualisere mikrotubulusnetværk i Drosophila melanogaster. Det neuromuskulære kryds tillader os at observere både præ- og postsynaptiske mikrotubuli, og den store størrelse af muskelceller i Drosophila-larven muliggør klar visualisering af mikrotubulusnetværket. Her, ved at mutere og overudtrykke Katanin 60 i Drosophila melanogaster og derefter undersøge mikrotubulusnetværkene i det neuromuskulære kryds og muskelceller, afslører vi nøjagtigt Katanin 60's regulerende rolle i neuroudvikling. Derfor, kombineret med de kraftfulde genetiske værktøjer af Drosophila melanogaster, letter denne protokol i høj grad genetisk screening og mikrotubulusdynamikanalyse for rollen som mikrotubulusnetværksregulerende proteiner i nervesystemet.
Introduction
Mikrotubuli (MT'er), som en af cytoskeletets strukturelle komponenter, spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer, herunder celledeling, cellevækst og motilitet, intracellulær transport og vedligeholdelse af celleform. Mikrotubulus dynamik og funktion moduleres af interaktioner med andre proteiner, såsom MAP1, MAP2, Tau, Katanin og Kinesin 1,2,3,4,5.
I neuroner er mikrotubuli afgørende for udvikling og vedligeholdelse af axoner og dendritter. Abnormiteter i mikrotubuli fører til dysfunktion og endda neuronernes død. For eksempel reducerer Tau-proteinhyperphosphorylering i hjernen hos Alzheimers patienter stabiliteten af mikrotubulusnetværket og forårsager neurologiske uregelmæssigheder6. Således vil undersøgelse af mikrotubulusnetværk bidrage til en forståelse af neuroudvikling og patogenesen af neurologiske sygdomme.
Det neuromuskulære kryds (NMJ) er den perifere synaps dannet mellem en motorneuronaxonterminal og en muskelfiber, som er et fremragende og kraftfuldt modelsystem til undersøgelse af synaptisk struktur og funktioner7. Futsch er et protein i Drosophila, der er homologt med det mikrotubulusbindende protein MAP1B, der findes hos pattedyr8. Det udtrykkes kun i neuroner og spiller en rolle i udviklingen af NMJ's synaptiske knapper 8,9. I vildtype visualiseres filamentøse bundter, der løber langs midten af NMJ-processer, ved immunfarvning med anti-Futsch. Når NMJ's ende nås, har dette bundt evnen til enten at danne en løkke bestående af mikrotubuli eller at miste sin trådformede struktur, hvilket resulterer i et diffust og punkteret udseende10. Mikrotubulussløjfer er forbundet med pausede vækstkegler, hvilket tyder på, at mikrotubulusarrayet er stabilt11. Derfor kan vi indirekte bestemme den stabile mikrotubulusudvikling i NMJ ved Futsch-farvning. Den store størrelse af muskelceller i Drosophila larve giver mulighed for klar visualisering af mikrotubulusnetværket. De faktorer, der påvirker stabiliteten af mikrotubulusnetværket, kan findes ved at analysere tætheden og formen af mikrotubuli. Samtidig kan muskelcellernes mikrotubulusnetværksstatus krydsverificeres med resultatet af NMJ for at opnå mere omfattende konklusioner.
Mange protokoller er blevet anvendt til at undersøge mikrotubulis netværk og dynamik. Imidlertid har disse undersøgelser ofte fokuseret på in vitro-undersøgelser 12,13,14,15,16. Alternativt har nogle in vivo-eksperimenter anvendt elektronmikroskopi til at detektere cytoskelettet17. Ifølge den specifikke binding af fluorescerende mærkede antistoffer eller kemiske farvestoffer til proteiner eller DNA tillader de metoder, der præsenteres her, påvisning af mikrotubulusnetværk i NMJ på niveauet af individuelle neuroner in vivo, med resultater bekræftet af observationer i muskelceller. Denne protokol er enkel, stabil og gentagelig, når den kombineres med de kraftfulde genetiske værktøjer, der er tilgængelige i Drosophila melanogaster, hvilket muliggør en bred vifte af fænotypiske undersøgelser og genetiske screeninger for rollen som mikrotubulusnetværksregulerende proteiner i nervesystemet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissektion af larver
BEMÆRK: Den dissekerende opløsning hæmolymfelignende saltvand (HL3.1)18 og fikseringsopløsningen 4% paraformaldehyd (PFA)19,20 anvendes ved stuetemperatur, fordi mikrotubuli depolymeriserer, når temperaturen er for lav.
- Vælg en vandrende 3. stjernelarve med lange stumpe tang. Vask det med HL3.1 og læg det på dissektionsskålen under stereomikroskopet.
BEMÆRK: Vandrende 3. stjernelarve identificeres ved forgrenet forreste spirakel og kravler rundt i røret ved ca. 96 timer (25 °C)21. - Placer larven med den dorsale eller ventrale side opad. Identificer den dorsale side ved de to lange luftrør og den ventrale ved de abdominale dentikelbælter.
- Afhængigt af vævet, der skal observeres, skal du vælge dorsal eller ventral dissektion. Dette vil give mulighed for en mere præcis og detaljeret visning af det specifikke interesseområde. Til NMJ og muskelcelleobservation skal du åbne henholdsvis larvedorsale og ventrale regioner.
- Fastgør mundkroge og halen. Juster stifterne for at holde larven i udvidet tilstand. Tilsæt en dråbe HL3.1 til larven for at forhindre, at den tørrer.
BEMÆRK: Ca2+ -fri HL 3.1 kan bruges til at minimere sammentrækning af musklerne under dissektion. - Brug dissekersaksen til at lave et lille tværgående snit tæt på den bageste ende, men skær ikke den bageste ende af. Skær derefter langs den ventrale midterlinje mod den forreste ende.
- Indsæt fire insektstifter på larvens fire hjørner. Juster insektstifter, så larven maksimalt strækkes i alle retninger.
- Brug tangen til at fjerne indre organer uden at beskadige musklerne.
2. Fastgørelse
- Tilsæt 100 μL PFA (4%) for at nedsænke slagtekroppe i 40 minutter, mens slagtekroppene stadig er fastgjort på dissekeringsskålen.
FORSIGTIG: Der træffes effektive beskyttelsesforanstaltninger for at undgå direkte kontakt med hud eller indånding, da PFA udgør en fare. - Afmonter stifterne, og overfør prøven til et 2 ml mikrocentrifugeglas. PFA skylles af med 1x fosfatbufret saltvand indeholdende 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST) for at fylde 2 ml mikrocentrifugerør i 10 minutter på affarvningsrysteren ved 15 omdr./min. Gentag vaskeprocessen 5x.
3. Immuncytokemi
- Nedsænk slagtekroppene i blokeringsmiddel (5% gedeserum i 0,2% PBST) og bloker i 40 minutter ved stuetemperatur.
- Blokeringsmidlet fjernes og erstattes med 200 μL af det primære antistof (f.eks. anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) fortyndet med 0,2 % PBST ved 4 °C natten over. Visualiser muskelmikrotubuli ved immunfarvning med monoklonal anti-α-tubulin. Anti-Futsch kan indirekte afspejle mikrotubulusmorfologien i NMJ.
- Efter inkubation af det primære antistof vaskes larverne med 0,2% PBST i 10 min. Gentag 5x.
- Inkuber larverne med 200 μL sekundært antistof (f.eks. Gede-anti-Mus-488, 1:1000) fortyndet med 0,2% PBST ved stuetemperatur i 1,5 timer i mørke.
- Derefter tilsættes et nukleært farvestof, såsom TO-PRO(R) 3-iodid (T3605) i en koncentration på 1:1000 i inkubationsrøret i 30 minutter, når mikrotubuli farves i mørke20,22.
- Skyl det sekundære antistof og det nukleare farvestof af med 0,2% PBST i 10 min. Gentag 5x i mørke.
4. Montering
- Placer larvekroppen i 0,2% PBST på et glasglas og juster det under stereomikroskopet. Sørg for, at larvekroppens indre overflade vender opad, og at alle larvekroppe er arrangeret som ønsket.
- Absorber overskydende PBST-opløsning med en aftørring og tilsæt forsigtigt en dråbe antifade monteringsmedium.
- Placer en dæksel på diaset for at dække de dissekerede larver langsomt og forsigtigt for at undgå bobler.
- Påfør neglelak omkring dæksedlen. Placer diaset i det mørke rum for at reducere fluorescerende dæmpning.
5. Optagelse af billeder
- For at erhverve billederne skal du bruge et laserscanningskonfokalmikroskop, vælge 60x olienedsænkningsmålet (numerisk blænde 1,42) eller lignende og justere lasereffekten og bølgelængden baseret på eksperimentet.
- For at identificere NMJ skal du tage billeder i muskel 4 i segment A3 (som vist på placeringen i figur 1F). Vælg en 488 nm laser for at aktivere α-tubulin eller Futsch og 543 nm for at aktivere HRP-billedsporet. Juster parametrene til en billedstørrelse på 800 pixel x 800 pixel, en digital zoom på 2,0 og et billedinterval på 0,8 μm i NMJ'er (figur 2).
- For at identificere mikrotubuli i muskler skal du tage billeder af muskel 2 i segment A3-A5 (som vist på placeringen i figur 1G), da den har færre trakeale grene. Vælg en 488 nm laser til aktivering af α-tubulin og en 635 nm laser til aktivering af T3605-billedsporet. Juster parametrene til en rammestørrelse på 1024 pixels x 1024 pixels, en digital zoom på 3,0 og et billeddannelsesinterval på 0,4 μm i muskelceller (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrerede en trin-for-trin procedure til visualisering af mikrotubulusnetværket i både neuromuskulære kryds (NMJ'er) og muskelceller. Efter dissektion i henhold til det skematiske diagram (figur 1A-E) udføres immunfarvning, og billeder observeres efterfølgende og indsamles under et laserkonfokalmikroskop eller et stereoskopisk fluorescensmikroskop (figur 1F, G).
Både præ- og postsynaptisk mikrotubulusorganisering af NMJ kunne mærkes med anti-α-tubulin, og ved at vælge lagtykkelsen af laserscanningskonfokalmikroskopet ville mikrotubulusmorfologien for forskellige skiver blive vist (figur 2A-C). Futsch er også blevet brugt til neural sporing ved at afsløre mikrotubulusorganisationen i neuronernes axoner. Anti-HRP bruges til at mærke neuronmembranen 10,23,24. Co-farvning med anti-Futsch og anti-HRP antistoffer udføres for at detektere mikrotubulus status i axoner af neuroner. Futsch-farvning kan afspejle overflod af stabile mikrotubuli i de præsynaptiske neuroner i NMJ9. Tubulin-specifik chaperon E (TBCE) spiller en afgørende rolle i udviklingen af MT-cytoskelettet. Når TBCE slås ned i præsynaptiske neuroner, bliver signalet om anti-Futsch svagere og tyndere, og farvningen i de terminale boutons er enten uindlysende eller fraværende23. Tau er et mikrotubulusassocieret protein, der har en vigtig rolle i mikrotubulussamling og stabilisering25,26. I Drosophila med ektopisk ekspression af humant vildtype- og mutant humant Tau-protein afsløres et fald i intensiteten af Futsch-signalet ved NMJ-terminalerne20. Ifølge resultaterne af Futsch-farvning var farvningsintensiteten af axonstammen stærkere end grenenes (figur 2D-F). Mikrotubuli i slutningen af grene er mindre stabile og mere tilbøjelige til morfologiske ændringer, så dynamikken i mikrotubuli kan afspejles ved farvning af de terminale mikrotubuli.
Morfologiske ændringer af mikrotubuli kan også let visualiseres22. Microtubule loops kan farves med anti-Futsch og anti-α-tubulin. Desuden kan formen på en enkelt sløjfe tydeligt vises, hvilket letter kvantitativ analyse. For eksempel er Katanin et mikrotubulus-skærende protein, der spiller en vigtig rolle i reguleringen af mikrotubulusdynamikken. Den katalytiske underenhed Katanin 60 er rapporteret at have en effekt på morfologien af mikrotubuli22. Mao har konstrueret Katanin 60-mutant ved P-element-medieret excision og uas-Katanin 60 ved at indsætte pUAST-attB-Katanin 60 i det andet kromosom ved 51D. Stigningen i mikrotubulussløjfer forårsaget af Katanin 6017A-mutationer blev tydeligt demonstreret (figur 2A, B, D, E). Derudover kunne korte MT-fragmenter i overekspressionen af Katanin 60 også observeres signifikant inden for terminalboutonerne (figur 2C).
Mikrotubulusnetværket kan observeres ved farvning med α-tubulinantistoffer i muskelceller. Et netværk af mikrotubuli, der strakte sig rundt om kernen, var tydeligt synligt (figur 3A). Det mikrotubulusafskærende protein Katanin regulerer fordelingen af mikrotubulusnetværket22. I Katanin 6017A-mutant havde muskelceller en signifikant øget perinuklear MT-intensitet og udviste stærkere bundter sammenlignet med vildtypen (figur 3B). Fragmentering af mikrotubulære fibre forårsaget af overekspression af Katanin 60 var repræsenteret (figur 3C). Således muliggør protokollen mikrotubulusnetværksvisualisering i både neuroner og muskelceller.
Figur 1. Dorsal dissektion procedure af Drosophila larve. (A-E) Fremgangsmåden til fremstilling af larvekroppe (ændret fra21). (A) Indsæt to stifter hver i mundkrogene og halen på en larve. (B) Brug dissekeringssaksen til at lave et lille tværgående snit tæt på den bageste ende. (C) Skær langs den ventrale midterlinje mod den forreste ende. (D) Indsæt fire insektstifter på larvens fire hjørner. (E) Brug tang til at fjerne indre organer og justere stifternes position for at placere larven i en passende position til fotografering. (F) Phalloidin bruges til at mærke cytoskelettet for at visualisere musklen, og HRP bruges til at mærke cellemembranen i neuroner. Det observerede område af NMJ er begrænset til muskel 4 i segment A3, co-farvet med anti-HRP (grøn) og phalloidin (magenta). Det højre panel viser en skematisk repræsentation af den lokale muskelstruktur. Billedstørrelsen på 1024 pixels x 1024 pixels, digital zoom på 0,6 og et billedinterval på ca. 4 μm ved hjælp af et 10x objektivobjektiv (numerisk blænde 0,45). (G) Det observerede område af muskelcellerne er begrænset til muskel 2 i segmenterne A3 til A5, farvet med phalloidin (magenta). Den enkelte sektion er fanget af et stereoskopisk fluorescensmikroskop. Vægtstang: 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Konfokale billeder af mikrotubuli i NMJ ved anti-α-tubulin eller anti-Futsch. NMJ-terminaler med w1118-kontrol (A), Katanin 60 17A-mutant (B) og neuronal overekspression af Katanin 60 (C), co-farvet med anti-HRP (rød) og anti-α-tubulin (grøn) vises i venstre kolonne. Billederne er projektioner fra komplette z-stakke gennem hele muskel 4 NMJ i abdominalsegmentet A3. Den midterste kolonne viser et klarere billede af mikrotubuli i NMJ-terminalerne ved at fjerne mikrotubuli fra musklen. Den højre kolonne viser morfologien af mikrotubuli i synaptiske boutoner ved hjælp af analysesoftwaren. Skalabjælke: 1 μm. NMJ-terminaler af forskellige genotyper co-farvet med anti-HRP (rød) og anti-Futsch (grøn) (D-F). MT-sløjfer blev angivet med pile. Skalabjælke: 5 μm. Dette tal er blevet tilpasset fra22. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Perinukleær mikrotubulus netværk farvning i Drosophila larve muskelceller. (A-C) Larvemuskler er co-farvet med anti-α-tubulin (grøn) for at vise mikrotubulusnetværket og T3605 (blå) for at vise kernen for w1118 kontrol (A), Katanin 60 17A mutant (B) og Katanin 60 overekspression i muskelsystemet (C). Billederne er fremskrivninger fra komplette z-stakke fra udseendet af mikrotubuli til midten af atomet. Skalabjælke: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en protokol til dissektion og immunfarvning af Drosophila-larve , neuromuskulære krydsninger og muskelceller. Der er flere vigtige punkter at overveje. For det første er det afgørende at undgå skade på de observerede muskler under dissektionsprocessen. Det kan være værd at fastgøre fileten, før du fjerner indre organer for at forhindre direkte kontakt mellem tang og muskler. For at undgå muskelskader eller adskillelse fra larveepidermis er det vigtigt at sikre, at rysterens hastighed ikke overstiger 15 o / min under vask og inkubation. Derudover er præcis kontrol over hudforlængelse nødvendig for at sikre klar og komplet fotografering af NMJ-morfologi. Det anbefales at gennemføre indledende forsøg for at optimere antistofkoncentrationen, fikseringen, blokeringen og inkubationstiderne. Den faste varighed er begrænset til ca. 40 min. For kort eller for lang er ikke befordrende for immunfarvning af mikrotubulusnetværket.
Mikrotubuli i neuroner er tæt pakket og udfordrende at blive visualiseret tydeligt ved hjælp af konventionel mikroskopi. Sammenlignet med neuroner er muskelcellerne i Drosophila især store, hvor muskel 2 i segment A3 måler op til 40 μm x 150 μm, hvilket gør det muligt at billeddannelse i høj opløsning. Derfor er brug af Drosophila-muskelceller til undersøgelse af reguleringen af mikrotubulusnetværksassocierede proteiner en intuitiv og klar tilgang, der har betydelig værdi i validering af NMJ-fænotyper20,22,23. Sammenlignet med den tidligere metode27 har vi ændret dissektionsretningen fra dorsal til maven for at opnå en uhindret genstand. Elueringsbufferen i musklen med 0,2% PBST er relativt skånsom og hjælper med at bevare muskelintegriteten.
Der er stadig nogle begrænsninger for denne tilgang. Som et mikrotubulusbindende protein udtrykkes Futsch udelukkende i neuroner og kan indirekte repræsentere polymeriserede mikrotubuli. Men hvis kun Futsch bruges til at visualisere mikrotubulusnetværket under interaktionsscreening, kan nogle kandidatproteiner blive overset. α-tubulin eller β-tubulin kan direkte repræsentere mikrotubulusnetværket, men disse to proteiner præsenterer både præsynaptisk og postsynaptisk, og det er undertiden vanskeligt at skelne. Desuden fordeles et stort antal α/β-tubulinheterodimerer i cytoplasmaet, hvilket betyder, at mærkning af enten α-tubulin eller β-tubulin muligvis ikke er egnet til levende billeddannelse, da både polymeriseret og ikke-polymeriseret tubulin kan observeres på samme tid.
Observation af mikrotubuli fra motorneuroner til muskelceller kan give en omfattende forståelse af bevægelsesmekanismerne ud fra neurale kredsløb, hvilket letter undersøgelsen af neuroudviklingsprocesser og patogenesen af neurologiske sygdomme. Visualisering af mikrotubulusnetværket i forskellige modelsystemer er gavnligt for at verificere genfunktionen fra flere perspektiver ved hjælp af denne protokol. Denne metode kan også bruges til at observere NMJ's postsynaptiske receptorer, hvilket er gavnligt for undersøgelsen af kommunikation mellem synapser og synaptisk plasticitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ying Xiong for diskussioner og kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde er støttet af en bevilling fra National Science Foundation of China (NSFC) til CM (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
