Drosophila (olika betydelser) Kvantifiering av neuromuskulär korsning (NMJ): En metod för att bedöma synaptisk morfologi och funktion

- För det första, immunostain Drosophila larver med markörer som belyser olika aspekter av NMJs eller neuromuskulära korsningar.

Axonen avslutas i flera grenar som bildar utbuktningar som kallas boutons. Signalsubstanser frigörs från boutons och orsakar muskelkontraktion. Områden av neurotransmittorfrisättning kallas aktiva zoner. Här är en markör specifik för ett synaptiskt protein som beskriver NMJ, och den andra markören är för ett protein som finns i aktiva zoner.

Förvärva sedan NMJ-bilder med hjälp av mikroskopi och kvantitativt utvärdera deras morfologi med halvautomatisk bildanalysprogramvara. Tillämpa en förinställningsserie av programvarukommandon på bilderna.

I följande exempel analyserar vi morfologin hos Drosophila NMJs färgade med DLG1, en postsynaptisk markör, och BRP, en aktiv zonmarkör.

- För detta protokoll, generera bildstaplar av NMJs och spara dem som enskilda TIFF filer där kanal 1 visar DLG1 färgning eller liknande markör och kanal 2 visar BRP färgning. Att börja, skapa Z projektioner och hyperstacks av NMJ bildfiler. Öppna plugin-alternativen och välj Drosophila NMJ morphometrics.

Identifiera nu den unika filsträngen som mikroskopet har tilldelat bildserien när de lagras som TIFF. Detta kommer att vara i slutet av bildnamnet. Kopiera och klistra in strängen som ges till det lägsta plan- och kanalnumret i det unika filstränginställningsfönstret.

För varje bildfil görs två nya filer med standardnamnstacken och den platta stacken, följt av det ursprungliga bildnamnet.

När den första projektionen öppnas väljer du verktyget frihandsval och använder sedan musen för att definiera en region som innehåller en komplett NMJ-terminal av intresse.

För att kvantifiera NMJ-funktionerna gå först till Drosophila NMJ morphometrics-gränssnittet och ställ in skalan. Om till exempel en pixel i bilden motsvarar 0,72 mikron, ställ in skalpixlar på 1 och skala avståndet till 0,072. Välj sedan submakroanalysen, och om det finns två kanalbilder, växla också Vänta. Tryck på OK och välj sedan bildfilkatalogen.

Efter analysen lagras nya bildfiler för varje analyserad synaps i föräldramappen och de kvantitativa mätningarna finns i resultatet.txt fil.

Delar av den synaptiska terminalen kanske till exempel inte ingår i den gula konturen. Delar av bakgrunden kan ingå i synaptisk terminal.