Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- تبدأ بالبويضات الناضجة من المبيضين الثابتين في محلول ملحي.
لإزالة غشاء الكوريون والفيتيلين ميكانيكيا، ضع البويضات بين الأجزاء المتجمدة من شريحتين تم معالجتهما مسبقا.
الآن، حرك الشريحة العلوية بزاوية طفيفة للف البويضات في اتجاه آخر.
سوف تظهر البويضات بدون المشيمات طويلة ورقيقة، وأولئك الذين ليس لديهم أغشية فيتيلين سيكون لديهم نهايات مدببة.
في هذا البروتوكول، سنقوم بإزالة أغشية الكوريون والفيتيلين من البويضات الدروزهرية الناضجة.
- لفصل البويضات في مرحلة متأخرة، أولا، إضافة 1 ملليلتر من PBSBTx إلى طبق تشريح الضحلة.
عندما يتم فصل البويضات في مرحلة متأخرة بما فيه الكفاية، نقل جميع الأنسجة إلى أنبوب microfuge 500 ميكرولتر. إزالة السائل الزائد مع ماصة باستور سحبت، وترك حوالي 150 إلى 200 ميكرولتر في الأنبوب.
للتحضير للبويضة المتداول، قبل الرطب طبق عميق جيدا مع 200 ميكرولتر من PBSBTx. تغطية الطبق ووضعها جانبا.
الحصول على ثلاث شرائح زجاجية متجمدة وتعيين الشريحة ثلاثة جانبا. شطف لهم في الماء deionized لإزالة أي شظايا الزجاج والجافة مع مسح المتاح. معطف المناطق المتجمدة من الشرائح واحد واثنين مع PBSBTx عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من PBSBTx إلى شريحة واحدة وفرك هذه المنطقة مع الشريحة الأخرى. إزالة السائل مع مسح المتاح ووضع الشرائح تحت المجهر تشريح.
للفة البويضات، أولا، قبل الرطب تلميح ماصة P200 في PBSBTx وتفريق البويضات في أنبوب microfuge عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل 50 ميكرولتر من السائل الذي يحتوي على البويضات إلى وسط الجزء الزجاجي المتجمد من الشريحة الأولى.
انخفاض ببطء الشريحة الثانية حتى التوتر السطحي للسائل يخلق ختم بين المنطقتين الزجاج متجمد.
أداء تحت المجهر لسهولة تصور حركات البويضات والتقدم. بعد بضع حركات في الاتجاه الأفقي، تغيير طفيف في زاوية الحركة.
- عند المتداول البويضات، تأكد من أن اتجاه المتداول هو دائما في خط مستقيم وأبدا حركة دائرية.
- كرر المتداول حوالي 7 إلى 10 مرات حتى يصبح الحل غائما بعض الشيء.
رفع بلطف الشريحة العلوية اثنين، وسحب واحدة من زواياها إلى وسط المنطقة المتجمدة في الشريحة السفلية واحدة بحيث تتراكم البويضات المدرفلة في وسط المنطقة المتجمدة.
الشرائح النظيفة واحد واثنين مع المياه فائقة النبع. الجافة مع مسح المتاح وإعادة تعيين. كرر هذه الخطوات حتى تم تدحرجت جميع البويضات من نفس النمط الجيني.
لإزالة الحطام بعد التدحرج، إضافة 1 ملليلتر PBSBTx إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. دوامة السائل لمعطف جانبي الأنبوب. باستخدام تلميح P1000 ماصة PBSBTx المغلفة، نقل البويضات المدرفلة من طبق عميق البئر إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 1 ملليلتر من PBSBTx. إضافة 2 ملليلتر إضافية من PBSBTx إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على البويضات.
عقد أنبوب مخروطي على خلفية داكنة لرؤية البويضات مبهمة لأنها تغرق. بعد السماح للبويضات تسوية إلى أسفل, استخدام P1000 لإزالة أعلى 2 ملليلتر من الحل الذي يحتوي على الحطام وتجاهل.
بعد تكرار الخطوة لما مجموعه ثلاث جولات من إزالة الحطام ، استخدم تلميح P1000 ماصة مغلفة ب PBSBTx لنقل البويضات مرة أخرى إلى أنبوب الميكروفوغ الأصلي 500 ميكرولتر.
