Drosophila Sen Pupa Indirekte Flight Muscle (IFM) Disseksjon: En metode for vevsinnsamling med høy gjennomstrømning

- I voksenfluen er de indirekte flymusklene, eller IFM-ene, fluens største muskler som spenner over hele thoraxen. IFM-ene orkestrerer de karakteristiske høyfrekvente vingebevegelsene i tovingede fluer, inkludert Drosophila. To motstridende muskelfibergrupper utgjør IFM-ene.

For det første ligger de dorsale langsgående musklene, eller DLM-ene, langs medianplanet til thoraxen over tarmen og spenner fra fremre til bakre. For det andre er dorsale ventrale muskler, eller DVMer, spenner fra toppen til bunnen av thoraxen og er flankert av TDT, eller hoppemuskelen. Begge muskelgruppene er festet til kutikulær.

Ved ca. 48 timer etter pupariumdannelse, eller APF, kan modning av IFM-er identifiseres visuelt med et enkelt disseksjonsmikroskop. I eksempelprotokollen samler vi inn IFMer fra pupper eldre enn 48 timer APF for analyse med høy gjennomstrømning.

- For IFM-disseksjon etter 48 timer APF, bruk en lett fuktet pensel for å overføre den iscenesatte puppen til en stripe med dobbeltsidig klebrig tape montert på et mikroskopsklie. Orienter puppene i en linje, ventral side ned og fremre mot bunnen av lysbildet. Når alle puppene er plassert, bruk tang til å erte fra hverandre og åpne det første puppetuiet over de fremre spirakler, og skyv forsiktig et par tang dorsally mot bakre, kutte pupal saken som tang beveger seg.

Frigjør puppen fra den åpne saken, og overfør umiddelbart puppen til en dråpe PBS på et annet mikroskopsklie. Når alle puppene er frigjort, bruk fin saks for å kutte magen på puppene bort fra thoraxen og skyv magene inn i en egen haug. Når alle thoraxene er fjernet, bruk et stykke vevpapir for å fjerne flertallet av PBS og haugen med mage.

Tilsett en dråpe fersk kjølt PBS til de resterende thoraxene før du bruker saksen til å kutte fra hodet langs langsgående kroppsakse i en enkelt bevegelse for å dele thoraxen i to. Når alle puppene er dissekert, bruk nummer fem tang for å velge en av hemiseksjonene og forsiktig sette inn spissene på en tang over og under midten av IFM-ene.

Hold det første paret med tang stille, bruk fin saks for å kutte den ene enden av IFM bort fra kutikalen og senene før du roterer puppen 180 grader slik at den andre enden av IFM kan kuttes fri fra kutikalen og senene. Bruk tang til å overføre IFM-bunten fra thoraxen til kanten av PBS-boblen ved hjelp av vannspenning for å holde bunten på plass.

Skyv deretter slaktkroppen til motsatt side av lysbildet og disseker resten av IFM-ene på samme måte. Når alle IFM-ene er samlet inn, bruk nummer fem tang for å fjerne eventuelle hoppmuskulatur- eller kutiklede fragmenter som kan ha funnet veien inn i prøvene. Bruk deretter vannspenningen til å fange opp de dissekerte IFM-ene forsiktig mellom et par tang og plasser IFM-ene i et mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter som inneholder 250 mikroliter kjølt PBS.