Mikroinjeksjon av levende drosophila embryoer: Tidlig levering av reagenser til det utviklende embryoet

- Samle levende Drosophila embryoer og fjern deres ikke-gjennomsiktige chorions. Deretter, på en glassdekslelip, påfør en linje med heptanlim, som er tape lim oppløst i flytende heptane. For å kunne håndtere de nå avkorionerte embryoene, juster prøvene forsiktig på rad på limet.

Overfør dekslene til et dehydreringskammer for delvis å desiccate embryoene. Dette vil forhindre cytoplasmisk lekkasje under eller etter injeksjoner. Deretter fjerner du dekslene og dekker embryoene med halokarbonolje for å forhindre ytterligere dehydrering, samtidig som oksygen kan spre seg inn i embryoene.

For å utføre mikroinjeksjonen, bruk et mikroinjeksjonssystem på et kompatibelt mikroskop. Ved å se gjennom øynene, identifiser både embryoene og nålen forhåndslastet med injeksjonsoppløsning. Bryt opp nålen og sørg for at den produserer konsistente og passende store væskedråper. Deretter tar du nålen inn i embryoet og injiserer riktig volum.

I eksempelprotokollen vil vi se en demonstrasjon av Drosophila embryomikroinjeksjon for levende avbildningsstudier av celledeling.

- Før du setter opp dekslene, gjør heptane lim ved å rulle ut dobbelt klebrig tape, og legg den i en 100 milliliter flaske. Tilsett ca 50 milliliter heptan, forsegle flasken og rock den i flere dager.

Før du forbereder embryoene, lag et dehydreringskammer som embryoene skal plasseres i før injeksjon. For å gjøre dette, legg en del av en 35 millimeter tallerken inne i en 100 millimeter Petri-tallerken for å lage et "bord". Legg til Drierite, som er vannfri kalsiumsulfat, rundt det slik at drierittens høyde ikke er høyere enn "bordet", og dekk.

For å begynne å forberede embryoene, samle dem først fra layburet ved å endre druejuiceplaten med gjær hver time. Embryoene skal avbildes omtrent to timer etter starten av samlingen. For å forberede dekslene, plasser den på den ene siden av et mikroskopsklie og tape de fire hjørnene ned, slik at den ikke beveger seg.

Bruk en bomullsspisset applikator, legg ett lag heptanlim i en linje på dekslene. Limet skal ikke være viskøs og bør tørke om noen sekunder. Hvis det er for tykt, legg til mer heptane.

Til slutt legger du et stykke dobbelt klebrig tape på lysbildet ved siden av dekslene. Med en fuktet børste, plukk forsiktig opp embryoene fra druejuiceplaten og legg dem på dobbelt klebrig tape på lysbildet.

Deretter bruker du halvparten av en pinsett til å rulle embryoene over det dobbelt sticky tape til koreksjonen bryter opp. Plukk opp embryoet ved å rulle det forsiktig over koreksjonen, slik at det stikker til pinsett, og legg det på heptanlimet på dekslene med den lange siden av embryoet parallelt med langsiden av dekslene.

Plasser 10 til 20 embryoer på en rad. Fjern dekslene og legg det i dehydreringskammeret i tre til åtte minutter. Tiden avhenger av den lokale luftfuktigheten og mengden som skal injiseres. Deretter plasserer du dekslene på et metallkammer med vakuumfett. Til slutt dekker embryoene med halokarbonolje for å unngå ytterligere dehydrering. Embryoene er nå klare til injeksjon.

Finn først embryoene under et 16X mål. Flytt embryoene bort, og finn nålen uten å flytte fokusplanet.

For å åpne nålen, legg kanten av dekslene i synsfeltet, men ikke hvor en nål vil være, og senk nålen til samme brennplan. Svært forsiktig, flytt dekslene til den treffer nålen og forsiktig bryter den opp. Flytt nålen opp.

Ta nå embryoene i syne. Senk nålen inn i oljen, og sørg for å få fine væskedråper fra nålen. Flytt embryoet jevnt inn i nålen, injiser en dråpe i embryoet, og flytt deretter embryoet bort. Etter at alle embryoene er injisert, er de klare til observasjon på et konfokalt mikroskop med et 60 eller et 100X mål.