Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

- Begin met het plaatsen van een opnamekamer met een monster in een badoplossing, waarvan de samenstelling overeenkomt met de fysiologische extracellulaire omgeving of het cytoplasma, op een microscoopstadium. Breng de opnamemicropipet, een pipet met een zilveren elektrode die baadt in een elektrolytoplossing, die de intracellulaire omstandigheden nabootst, naar het neuron door positieve druk uit te oefenen, en maak contact met het celmembraan.

Schakel voorzichtig over van positieve naar negatieve druk om een strakke afdichting te vormen tussen het membraan en de pipet. Stel een houdpotentiaal in op de versterker om de cel op een constante spanning te houden. Breek vervolgens het celmembraan in de micropipet door afzuiging aan te brengen.

Zodra het celmembraan scheurt, veroorzaakt het houdpotentieel de stroom van ionen door spanningsge gated ionenkanalen, waardoor een membraanpotentiaal ontstaat, dat wordt geregistreerd door de opname-elektrode. Noteer onmiddellijk het membraanpotentieel. De opname-elektrode verzendt het signaal naar de feedbackversterker, die het membraanpotentieel aftrekt van het houdpotentieel- een oscilloscoop, die een visuele weergave van het membraanpotentieel presenteert, en een computer.

- Om u voor te bereiden op patchklemmen, begint u met het trekken van enkele patchklempipetten met dunwandig borosilicaatglas in een horizontale trekker. Pipetpuntdiameters zijn ongeveer 0,2 tot 0,4 micrometer na het polijsten van de brand tot een gladde rand en de schacht taps is ongeveer 4 millimeter lang.

Vul de pipettip met intracellulaire oplossing door de tip in de intracellulaire vloeistof te dompelen. Steek vervolgens een spuitnaald in de pipet en verwijder voorzichtig de intracellulaire oplossing uit de spuit om de pipet te vullen. Bevestig de pipet aan de versterkerkoptrap in de elektrofysiologische opstelling. Het is belangrijk om het hoofdstadium in een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van de horizontale as te houden, omdat dit zorgt voor een ingangshoek voor de pipet die geschikt is voor de vorming van hoge weerstandsafdichtingen met de Mauthner-opstelling.

Vlak voordat de pipet in de badoplossing zakt, oefent u een kleine hoeveelheid positieve druk uit op de pipet om de kans op het blokkeren van de punt te verminderen. Blijf de M-cel benaderen met een kleine hoeveelheid positieve druk in de pipet. De positieve druk duwt de cel voorzichtig van links naar rechts en vormt, wanneer deze onmiddellijk over de cel wordt geplaatst, een klein kuiltje op het celmembraan.

Laat de pipet nu een paar seconden op zijn plaats om het celoppervlak voorzichtig schoon te maken, zodat een sterke afdichting tussen de pipet en het membraan kan worden gevormd. Laat vervolgens de positieve druk in de pipet los om de afdichting te starten. Een kleine hoeveelheid negatieve druk, in combinatie met een negatief pipetpotentieel, resulteert in giga-ohm-afdichtingen die zich binnen een paar seconden vormen.

Verander vervolgens het houdpotentieel in de versterker in min 60 millivolt. Breek het celmembraan met een reeks korte zuigpulsen. Noteer vervolgens onmiddellijk membraanpotentiaal en minimaliseer capaciteitsartefacten. Compenseer de celvermogen en toegangsweerstand met 70% tot 85%.

De toegangsweerstand moet elke 30 seconden tot een minuut worden gecontroleerd en als er een verandering van 20% of meer is, moet u het experiment afbreken. Zodra het experiment is beëindigd en er voldoende gegevens zijn verkregen, offert u het embryo op door de achterwervels te verwijderen met een tang.