Elettrofisiologia del morsetto patch a cellule intere: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

- Iniziare posizionando una camera di registrazione contenente un campione in una soluzione da bagno, la cui composizione corrisponde all'ambiente extracellulare fisiologico o al citoplasma, su uno stadio di microscopio. Avanzare la micropipetta di registrazione, una pipetta contenente un elettrodo d'argento immerso in una soluzione elettrolitica, che imita le condizioni intracellulari, verso il neurone applicando pressione positiva e prendere contatto con la membrana cellulare.

Passare delicatamente da pressione positiva a pressione negativa per formare una tenuta stretta tra la membrana e la pipetta. Impostare un potenziale di mantenimento sull'amplificatore per mantenere la cella a una tensione costante. Quindi rompono la membrana cellulare all'interno della micropipetta applicando l'aspirazione.

Una volta che la membrana cellulare si rompe, il potenziale di tenuta causa il flusso di ioni attraverso canali ionici gated di tensione, creando un potenziale di membrana, che viene registrato dall'elettrodo di registrazione. Registrare immediatamente il potenziale della membrana. L'elettrodo di registrazione trasmette il segnale all'amplificatore di retroazione, che sottrae il potenziale di membrana dal potenziale di detenzione, un oscilloscopio, che presenta una visualizzazione visiva del potenziale della membrana, e un computer. Nel protocollo seguente, eseguiremo una misurazione del morsetto patch sulla cella mauthner in un embrione zebrafish.

- Per prepararsi al bloccaggio del cerotto, iniziare tirando alcune pipette patch clamp con vetro borosilicato a parete sottile in un estrattore orizzontale. I diametri della punta della pipetta sono di circa 0,2-0,4 micrometri dopo la lucidatura del fuoco su un bordo liscio e il cono del gambo è lungo circa 4 millimetri.

Riempire la punta della pipetta con soluzione intracellulare immergere la punta nel fluido intracellulare. Quindi inserire un ago di siringa nella pipetta ed espellere delicatamente la soluzione intracellulare dalla siringa per completare il riempimento della pipetta. Attaccare la pipetta allo stadio di testa dell&lificatore nella configurazione di elettrofisiologia. È importante mantenere lo stadio della testa ad un angolo di circa 45 gradi rispetto all'asse orizzontale, in quanto ciò garantisce un angolo di ingresso per la pipetta adatto alla formazione di guarnizioni ad alta resistenza con la cella Mauthner.

Poco prima che la pipetta si riduca nella soluzione del bagno, applicare una piccola quantità di pressione positiva sulla pipetta per ridurre la possibilità che la punta si blocchi. Continuare ad avvicinarsi alla cella M con una piccola quantità di pressione positiva nella pipetta. La pressione positiva spinge delicatamente la cella da un lato all'altro e, se posizionata immediatamente sopra la cella, forma una piccola fossetta sulla membrana cellulare.

Ora, lasciate la pipetta in posizione per alcuni secondi per pulire delicatamente la superficie cellulare in modo che si possa formare una forte tenuta tra la pipetta e la membrana. Quindi rilasciare la pressione positiva nella pipetta per avviare la guarnizione. Una piccola quantità di pressione negativa, unita al potenziale negativo della pipetta, si traduce in guarnizioni giga-ohm che si formano entro pochi secondi.

Successivamente, modificate il potenziale di tenuta nell'amplificatore a meno 60 millivolt. Rompete la membrana cellulare con una serie di brevi impulsi di aspirazione. Quindi registrare immediatamente i potenziali della membrana e ridurre al minimo gli artefatti di capacità. Compensare la capacità cellulare e la resistenza all'accesso dal 70% all'85%.

La resistenza all'accesso deve essere monitorata ogni 30 secondi a un minuto e, se c'è un cambiamento del 20% o più, interrompere l'esperimento. Una volta terminato l'esperimento e acquisiti dati sufficienti, sacrificare l'embrione rimuovendo il freno posteriore con un paio di forcep.