Électrophysiologie de pince de correction de cellules entières : une méthode pour étudier des propriétés électriques des neurones

- Commencez par placer une chambre d’enregistrement contenant un échantillon dans une solution de bain, dont la composition correspond à l’environnement extracellulaire physiologique ou au cytoplasme, sur une scène de microscope. Avancez la micropipette d’enregistrement, une pipette contenant une électrode argentée baignée dans une solution d’électrolyte, qui imite les conditions intracellulaires, vers le neurone en appliquant une pression positive, et entrez en contact avec la membrane cellulaire.

Passez doucement d’une pression positive à une pression négative pour former un joint serré entre la membrane et la pipette. Placez un potentiel de maintien sur l’amplificateur pour maintenir la cellule à une tension constante. Puis rompez la membrane cellulaire dans la micropipette en appliquant l’aspiration.

Une fois que la membrane cellulaire se rompt, le potentiel de détention provoque le flux d’ions par des canaux iions à portail de tension, créer un potentiel membranaire, qui est enregistré par l’électrode d’enregistrement. Enregistrez immédiatement le potentiel membranaire. L’électrode d’enregistrement transmet le signal à l’amplificateur de rétroaction, ce qui soustrait le potentiel membranaire du potentiel de détention - un oscilloscope, qui présente un affichage visuel du potentiel membranaire, et un ordinateur. Dans le protocole suivant, nous effectuerons une mesure de pince à patch sur la cellule Mauthner dans un embryon de poisson zèbre.

- Pour se préparer à la serrage de patch, commencez par tirer quelques pipettes de pince de correction avec le verre de borosilicate à parois minces dans un puller horizontal. Diamètres de pointe de pipette sont environ 0.2 à 0.4 micromètres après polissage de feu à un bord lisse, et le cône de tige est environ 4 millimètres de long.

Remplissez la pointe pipette d’une solution intracellulaire en plongeant la pointe dans le liquide intracellulaire. Insérez ensuite une aiguille de seringue dans la pipette et expulsez doucement la solution intracellulaire de la seringue pour finir de remplir la pipette. Attachez la pipette à l’étage principal de l’amplificateur dans la configuration de l’électrophysiologie. Il est important de maintenir l’étage principal à un angle d’environ 45 degrés à l’axe horizontal, car cela assure un angle d’entrée pour la pipette qui convient à la formation de joints de haute résistance avec la cellule de Mauthner.

Juste avant que la pipette ne s’abaisse dans la solution du bain, appliquez une petite quantité de pression positive sur la pipette pour réduire le risque de blocage de la pointe. Continuez à vous approcher de la cellule M avec une petite quantité de pression positive dans la pipette. La pression positive pousse doucement la cellule d’un côté à l’autre, et lorsqu’elle est positionnée immédiatement au-dessus de la cellule, forme une petite fossette sur la membrane cellulaire.

Maintenant, laissez la pipette en place pendant quelques secondes pour nettoyer doucement la surface de la cellule afin qu’un joint solide entre la pipette et la membrane puisse être formé. Puis relâchez la pression positive dans la pipette pour lancer le joint. Une petite quantité de pression négative, couplée avec un potentiel de pipette négatif, entraîne la formation de joints giga-ohm en quelques secondes.

Par la suite, changer le potentiel de détention de l’amplificateur à moins 60 millivolts. Rompre la membrane cellulaire avec une série d’impulsions courtes d’aspiration. Puis enregistrer immédiatement les potentiels membranaires et minimiser les artefacts de capacitance. Compenser la capacité cellulaire et la résistance à l’accès de 70 % à 85 %.

La résistance à l’accès doit être surveillée toutes les 30 secondes à une minute, et s’il y a un changement de 20 % ou plus, avorter l’expérience. Une fois l’expérience terminée et que suffisamment de données ont été acquises, sacrifiez l’embryon en enlevant l’arrière-pensée avec une paire de forceps.