Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Metabolomics הוא המחקר לזהות ולכמת מטבוליטים הנמצאים בתוך התאים. כדי להכין את המדגם, להתחיל על ידי זריעת תאים סרטניים בשד יחד עם מדיום צמיחה בשתי צלחות שכותרתו בדיקה ובקרה. דגירה במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. עכשיו, להסיר את המדיום ולהוסיף מדיום טרי עם אסטרדיול בצלחת הבדיקה ובינוני רגיל בצלחת הבקרה.
אסטרדיול נקשר אלפא קולטן אסטרוגן בתאי סרטן השד כדי לגרום ביטויים מסוימים, גרימת שינוי בהרכב חילוף החומרים. דגירה הצלחות למשך הרצוי. החלף את המדיום עם מלוחים אגירה פוספט קר כקרח או PBS לשטוף את התאים ולאחר מכן להוסיף אצטון קר כקרח. ריאגנטים קר כקרח לעצור את הפעולה של פרוטאזות ובכך למנוע השפלה חלבון.
עכשיו להשתמש מגרד כדי לנתק את התאים מן הצלחות, ולהעביר אותם לצינורות בעזרת פיפטה. קח 20 מיקרוליטרים של השעיית תא זה על hemocytometer ולספור את מספר התאים. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש לניתוח נוסף. בפרוטוקול הבא, אנו מכינים דגימות מתאי MCF-7 לכרומטוגרפיה של גז וספקטרומטריית מסה.
באמצעות תאי MCF-7 בתרבית על פי פרוטוקול הטקסט, להוסיף חמישה מיליליטר של קר כקרח 1x PBS לצלחת. לאחר מכן הטה את הלוח מספר פעמים לפני הסרת PBS. חזור פעמיים נוספות הסרת PBS ככל האפשר לאחר הכביסה האחרונה. מוסיפים 750 מיקרוליטרים של אצטון מיובש לכל צלחת ומגרדים את התאים, ואז משלבים את התאים משתי צלחות לצינור של שני מיליליטר על קרח.
כדי לספור את התאים לנורמליזציה, עבור כל טיפול, השתמש בשתי צלחות נוספות לכימות תאים. לאחר מכן לנתק את התאים מן הצלחות להוסיף 2 מיליליטר של חיץ HE דגירה במשך חמש דקות. מערבבים את התאים ביסודיות על ידי pipetting במאגר HE.
לאחר מכן השתמש 20 microliters של פתרון התא ב hemocytometer לספור את מספר התא תחת מיקרוסקופ. לאחסן את הדגימות ב שלילי 80 מעלות צלזיוס לפני השימוש ניתוח ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז כדי לזהות ולכמת את המטבוליטים. בצע ניתוח אינטגרטיבי בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
