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Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

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代谢学样本制备:为代谢物分析准备细胞样本的方法

 
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代谢学样本制备:为代谢物分析准备细胞样本的方法

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代谢学是识别和量化细胞内存在的代谢物的研究。要准备样本,首先在标有测试和控制的两个板中播种乳腺癌细胞以及生长介质。在37摄氏度下孵化三天。现在,取出介质,在测试板中加入带雌二醇的新鲜介质,在控制板中加入普通介质。

雌二醇与乳腺癌细胞中的雌激素受体α结合,诱导某些表达,导致代谢物成分发生变化。在所需的持续时间内孵化板。用冰冷磷酸盐缓冲盐水或PBS代替介质,清洗细胞,然后加入冰冷丙酮。冰冷试剂停止蛋白酶的作用,从而防止蛋白质降解。

现在使用刮刀将细胞从板中分离,并在移液器的帮助下将其转移到管子中。将这个细胞悬浮的20微升到血细胞仪上,并计算细胞的数量。将样品储存在零下80摄氏度,直到用于进一步分析。在下列协议中,我们准备了来自MCF-7细胞的气相色谱和质谱学样本。

使用根据文本协议培养的 MCF-7 细胞,在板中加入 5 毫升冰冷 1 倍 PBS。然后在取出 PBS 之前将板倾斜几次。上次洗涤后,再重复两次删除尽可能多的 PBS。在每个盘子中加入750微升的预制王牌,然后刮伤细胞,然后将两个板的细胞组合成冰上的两毫升管。

要计算细胞正常化,每次治疗,使用两个额外的板进行细胞定量。然后从板中分离细胞添加2毫升的 HE 缓冲器,孵育五分钟。通过在 HE 缓冲器中管道彻底混合细胞。

然后在血细胞仪中使用 20 微升的细胞溶液在显微镜下计算细胞数量。在使用气相色谱质谱分析识别和量化代谢物之前,将样品储存在负80摄氏度。根据文本协议进行综合分析。

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