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Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

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Preparação da amostra para metabolômica

 
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Preparação da amostra para metabolômica: um método para preparar amostras celulares para perfil metabólito

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Metabolômica é o estudo para identificar e quantificar metabólitos presentes dentro das células. Para preparar a amostra, comece por semear células cancerígenas de mama, juntamente com o meio de crescimento em duas placas rotuladas como teste e controle. Incubar por três dias a 37 graus Celsius. Agora, retire o meio e adicione meio fresco com estradiol na placa de teste e meio liso na placa de controle.

O estradiol se liga ao receptor de estrogênio alfa em células cancerosas de mama para induzir certas expressões, causando uma mudança na composição metabólito. Incubar as placas para a duração desejada. Substitua o meio por salina tamponada de fosfato gelado ou PBS para lavar as células e, em seguida, adicione acetona gelada. Os reagentes gelados param a ação de proteases e, assim, previnem a degradação da proteína.

Agora use um raspador para separar as células das placas, e transferi-las para tubos com a ajuda de uma pipeta. Leve 20 microliters desta suspensão celular para um hemótmetro e conte o número de células. Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que seja usada para análise suplementar. No protocolo a seguir, preparamos amostras de células MCF-7 para cromatografia a gás e espectrometria de massa.

Usando células MCF-7 cultivadas de acordo com o protocolo de texto, adicione cinco mililitros de 1x PBS gelado à placa. Em seguida, incline a placa várias vezes antes de remover o PBS. Repita mais duas vezes removendo o máximo de PBS possível após a última lavagem. Adicione 750 microliters de acetona pré-límpera a cada placa e raspe as células, em seguida, combine as células de duas placas em um tubo de dois mililitros no gelo.

Para contar as células para normalização, para cada tratamento, use duas placas extras para quantificação celular. Em seguida, para separar as células das placas adicione 2 mililitros de tampão HE e incubar por cinco minutos. Misture bem as células por pipetação no buffer HE.

Em seguida, use 20 microlitros da solução celular em um hemótmetro para contar o número da célula sob um microscópio. Armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos antes de usar a análise de espectrometria de massa da cromatografia gasosa para identificar e quantificar os metabólitos. Realizar análises integrativas de acordo com o protocolo de texto.

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