Пример подготовки к метаболомике: метод подготовки образцов клеток для профилирования метаболита

Метаболомика является исследование для выявления и количественной оценки метаболитов, присутствующих в клетках. Чтобы подготовить образец, начните с посева раковых клеток молочной железы вместе со средой роста в двух пластинах, помеченных как тест и контроль. Инкубировать в течение трех дней при 37 градусах по Цельсию. Теперь удалите среду и добавьте свежую среду с эстрадиолом в тестовую пластину и простой среды в контрольной пластине.

Эстрадиол связывается с рецептором эстрогена альфа в клетках рака молочной железы, чтобы вызвать определенные выражения, вызывая изменение состава метаболита. Инкубировать пластины на нужную продолжительность. Замените среду ледяным фосфатом буферного солевого раствора или PBS для мытья клеток, а затем добавить ледяной ацетон. Ледяные реагенты останавливают действие протеаз и тем самым предотвращают деградацию белка.

Теперь используйте скребок, чтобы отделить клетки от пластин, и передать их в трубки с помощью пипетки. Возьмите 20 микролитров этой клеточной подвески на гемоцитометр и подсчитайте количество клеток. Храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до тех пор, пока они не будут использованы для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы готовим образцы клеток MCF-7 для газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

Используя клетки MCF-7, выученные в соответствии с текстовым протоколом, добавьте к пластине пять миллилитров ледяного 1x PBS. Затем наклоните пластину несколько раз, прежде чем удалить PBS. Повторите еще два раза удаления столько PBS, как это возможно после последней стирки. Добавьте 750 микролитров предварительно облеченного ацетона к каждой пластине и соскреблите клетки, а затем объедините клетки из двух пластин в двухми миллилитровую трубку на льду.

Для подсчета клеток для нормализации, для каждого лечения, использовать две дополнительные пластины для количественной оценки клеток. Затем, чтобы отделить клетки от пластин добавить 2 миллилитров буфера HE и инкубировать в течение пяти минут. Смешайте клетки тщательно путем трубопроводов в буфере HE.

Затем используйте 20 микролитров клеточного раствора в гемоцитометре, чтобы подсчитать номер клетки под микроскопом. Храните образцы при отрицательных 80 градусах Цельсия, прежде чем использовать анализ масс-спектрометрии газовой хроматографии для выявления и количественной оценки метаболитов. Выполните интегративный анализ в соответствии с текстовым протоколом.