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Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.
Nous présentons ici NETQUANT, une approche entièrement automatisée pour quantifier les images de NETS et d’immunofluorescence. Cela aidera les chercheurs à faire une analyse d’image comparable à partir des données générées par plusieurs utilisateurs et conditions. Les avantages de cette technique sont la facilité d’utilisation, l’analyse des données unicell cellules, de multiples critères pour évaluer la formation de NET, et une analyse impartiale de plusieurs images.
Installez et ouvrez le logiciel d’analyse. Une version à jour se trouve sur les archives Zenodo GitHub ou sur le site Web de Nordonfelt Lab. Dans l’onglet configuration, choisissez un dossier source pour analyse en cliquant sur l’option obtenir le chemin dans le menu source.
Sélectionnez le dossier contenant les séquences d’images à analyser. Encore une fois, cliquez sur l’option obtenir le chemin dans le menu cible, et sélectionnez le dossier cible pour enregistrer les données suivant l’analyse d’image. Ensuite, lors de l’utilisation d’images de canaux distincts, nommez les dossiers du canal de sorte que le canal d’ADN corresponde à la tache d’ADN nucléaire, et le canal NET représente la tache d’élasstase neutrophile dans les images.
En outre, nommez le dossier contenant les fichiers d’image de contrôle comme contrôle. Ensuite, cliquez sur le bouton d’information sur l’image de charge et chargez les métadonnées d’image dans le logiciel. Ensuite, dans le sous-menu de commande de canal, sélectionnez l’ordre de canal correct contenu dans les images.
Cela permet de prévenir les inadéquations accidentelles. Cliquez maintenant sur le bouton préparer les données pour acquérir des propriétés d’image primaires à partir des données brutes et convertir les images. Les images converties apparaîtront ensuite dans le sous-menu des types d’échantillons.
Cliquez sur le menu de type échantillon, sélectionnez une image dans le sous-menu et cliquez sur les données d’image d’affichage pour afficher les images divisées en piège extracellulaire de l’ADN et du neutrophile, ou canal NET, respectivement. Pour segmenter les cellules dans leurs canaux respectifs, sélectionnez l’onglet méthode de segmentation et sélectionnez une méthode dans le sous-menu de la méthode pour les canaux ADN et NET. La méthode par défaut de segmentation est définie comme adaptative et est le paramètre recommandé.
D’autres options sont disponibles dans le logiciel, y compris l’avantage global et chanverse. Une option de bassin versant a également été incluse pour aider à distinguer entre les cellules étroitement placées ou les NETs. Toujours dans l’onglet segmentation, cliquez sur l’option échantillons de contrôle du segment.
Sélectionnez ensuite PMA à partir du sous-menu type d’échantillon et cliquez sur l’option lot pour commencer la segmentation de toutes les images incluses dans l’ensemble de données. Ensuite, sélectionnez les images dans le menu de type échantillon et cliquez sur le bouton de données d’image d’affichage pour visualiser et valider les masques d’image binaires pour les masques ADN et NET générés après segmentation. Maintenant, dans l’onglet analyse, cliquez sur le bouton seuil de déterminer pour analyser les échantillons de contrôle.
Ensuite, sur le côté droit, changer le type d’échantillon en PMA et cliquez sur le bouton obtenir des propriétés cellulaires pour compléter l’analyse des échantillons stimulés. Ensuite, sélectionnez une image dans le sous-menu de type échantillon et cliquez sur le bouton de données d’image d’affichage pour afficher la superposition et le nombre de cellules et de cellules formant net dans l’image. Commencez par sélectionner l’échantillon dans le sous-menu de type échantillon.
Les images individuelles peuvent être sélectionnées à partir du sous-menu de type échantillon pour analyse ou l’ensemble du lot d’images peut être analysé en sélectionnant l’option de lot. Une fois sélectionné, cliquez sur le bouton NETs analyser pour compléter l’analyse. Ajustez manuellement les critères NET pour obtenir des résultats optimaux pour un échantillon donné.
Comparez les NET identifiés avec les images originales pour évaluer la qualité de l’identification. Une fois cette étape terminée, les critères NET peuvent être appliqués sur toutes les images de l’ensemble de données. Toutes les modifications apportées aux critères NET sont également appliquées simultanément à tous les échantillons de contrôle.
Inspectez le résumé des données dans le sous-menu des données cellulaires, où le nombre d’images, le nombre de cellules par image et le pourcentage de NET par image sont affichés. Entrez l’onglet sortie pour sélectionner et afficher les sorties des résultats. Explorez et comparez les différentes sorties de données générées par l’analyse des échantillons traités par le contrôle et la PMA en sélectionnant la forme de la sortie et en cliquant sur le bouton résultats de sortie.
Ensuite, lancez le fichier CSV du tableau des résultats pour explorer les données unicell cellules et cliquez sur les résultats des fichiers PDF pour visualiser la distribution de la zone NET et le rapport ADN/NET dans les échantillons. La ligne rouge indique la valeur seuil dans les graphiques. Enfin, cliquez sur le fichier de distribution bivarié des résultats pour déterminer la zone NET par rapport à la forme de l’ADN.
Ici, 15 images de neutrophiles de contrôle et 15 images de neutrophiles stimulés par la PMA ont été analysées en moins de dix minutes. Le nombre total de cellules a été compté et le pourcentage de cellules avec des pièges extracellulaires neutrophiles a été déterminé en utilisant la méthode automatisée de quantification décrite dans cet article. Ces résultats montrent que les neutrophiles stimulés par la PMA ont une plus grande superficie, une augmentation de la déformation nucléaire et un rapport ADN/NET plus élevé que les échantillons de contrôle.
Lorsqu’ils sont combinés dans un graphique 3D, les échantillons stimulés par la PMA ont tendance à montrer des zones de regroupements de resserrement que les échantillons de contrôle. Tout en essayant la procédure, il est important de se rappeler que bien que le flux de travail ait été testé à l’aide de plusieurs donateurs, il est recommandé que l’utilisateur décide des paramètres logiciels de manière appropriée en fonction de l’ensemble de données individuel.
