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여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
여기에서 우리는 NETS 및 면역 불경심 심상을 정량화하기 위한 완전 자동화된 접근 방식인 NETQUANT를 제시합니다. 이렇게 하면 연구원이 여러 사용자와 조건에 의해 생성된 데이터에서 유사한 이미지 분석을 만드는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 장점은 사용의 용이성, 단일 셀 데이터 분석, NET 형성을 평가하는 여러 기준 및 여러 이미지의 편견없는 분석입니다.
분석 소프트웨어를 설치하고 엽니다. 최신 버전은 제노도 GitHub 아카이브 또는 Nordonfelt Lab 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 설정 탭에서 원본 메뉴에서 경로 경로 경로를 클릭하여 분석을 위한 원본 폴더를 선택합니다.
분석할 이미지 시퀀스를 포함하는 폴더를 선택합니다. 다시 대상 메뉴에서 get 경로 옵션을 클릭하고 이미지 분석 다음 데이터를 저장하기 위한 대상 폴더를 선택합니다. 다음으로, 별도의 채널 이미지를 사용하는 경우, DNA 채널이 핵 DNA 얼룩에 대응할 수 있도록 채널 폴더의 이름을 지정하고, NET 채널은 이미지에서 호중구 엘라스타제 얼룩을 묘사한다.
또한 컨트롤 이미지 파일을 포함하는 폴더의 이름을 컨트롤로 지정합니다. 그런 다음 로드 이미지 정보 버튼을 클릭하고 이미지 메타데이터를 소프트웨어에 로드합니다. 그런 다음 채널 순서 하위 메뉴에서 이미지에 포함된 올바른 채널 순서를 선택합니다.
이렇게 하면 우발적인 불일치를 방지할 수 있습니다. 이제 준비 된 데이터 버튼을 클릭하여 원시 데이터에서 기본 이미지 속성을 얻고 이미지를 변환합니다. 그런 다음 변환된 이미지가 샘플 유형 하위 메뉴에 나타납니다.
샘플 유형 메뉴를 클릭하고 하위 메뉴에서 이미지를 선택하고 디스플레이 이미지 데이터를 클릭하여 DNA 및 호중구 세포 외 트랩 또는 NET 채널로 분할된 이미지를 각각 표시합니다. 세포를 각각의 채널로 분할하려면 분할 방법 탭을 선택하고 DNA 및 NET 채널 모두에 대한 메서드 하위 메뉴에서 메서드를 선택합니다. 분할의 기본 방법은 적응으로 설정되며 권장되는 설정입니다.
다른 옵션은 글로벌 에지 및 chanverse를 포함한 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 밀접하게 배치 된 세포 또는 NET를 구별하는 데 도움이되는 분수령 옵션도 포함되어 있습니다. 또한 세분화 탭에서 세그먼트 제어 샘플 옵션을 클릭합니다.
그런 다음 샘플 유형 하위 메뉴에서 PMA를 선택하고 배치 옵션을 클릭하여 데이터 집합에 포함된 모든 이미지의 세분화를 시작합니다. 다음으로, 샘플 유형 메뉴에서 이미지를 선택하고 디스플레이 이미지 데이터 버튼을 클릭하여 DNA 및 NET 마스크가 생성된 후 세분화에 대한 바이너리 이미지 마스크를 시각화하고 검증합니다. 이제 분석 탭에서 결정 임계값 버튼을 클릭하여 제어 샘플을 분석합니다.
그런 다음, 오른쪽에, PMA로 샘플 유형을 변경하고 자극 된 샘플의 분석을 완료하기 위해 세포 속성 얻기 버튼을 클릭합니다. 다음으로, 샘플 유형 하위 메뉴에서 이미지를 선택하고 디스플레이 이미지 데이터 버튼을 클릭하여 오버레이 및 셀 수 및 NET 형성 셀을 이미지에 표시합니다. 먼저 샘플 유형 하위 메뉴에서 샘플을 선택합니다.
개별 이미지는 분석을 위해 샘플 유형 하위 메뉴에서 선택하거나 배치 옵션을 선택하여 이미지의 전체 배치를 분석할 수 있습니다. 선택한 경우 분석 NETs 버튼을 클릭하여 분석을 완료합니다. NET 기준을 수동으로 조정하여 지정된 샘플에 대해 최적의 결과를 얻을 수 있습니다.
식별된 NET를 원본 이미지와 비교하여 식별 품질을 평가합니다. 이 단계가 완료되면 데이터 집합의 모든 이미지에 NET 기준을 적용할 수 있습니다. NET 기준에 대한 모든 변경 사항은 모든 제어 샘플에도 동시에 적용됩니다.
이미지 수, 이미지당 셀 수 및 이미지당 NET의 백분율이 표시되는 셀 데이터 하위 메뉴의 데이터 요약을 검사합니다. 출력 탭을 입력하여 결과 출력을 선택하고 봅니다. 출력 의 형태를 선택하고 출력 결과 버튼을 클릭하여 제어 및 PMA 처리 샘플 분석에서 생성된 다양한 데이터 출력을 탐색하고 비교합니다.
다음으로 결과 데이터 테이블 CSV 파일을 실행하여 단일 셀 데이터를 탐색하고 결과 PDF 파일을 클릭하여 샘플에서 NET 영역 분포 및 DNA 대 NET 비율을 시각화합니다. 빨간색 선은 그래프의 임계값을 나타냅니다. 마지막으로 결과를 클릭하여 분포 파일을 이동하여 DNA의 순 영역 과 모양을 결정합니다.
여기서, 제어 호중구의 15개의 심상 및 PMA 자극호성 호중구의 15개의 심상이 10분 이내에 분석되었다. 세포의 총 수는 계산되었고, 호중구 세포 외 트랩을 가진 세포의 백분율은 이 문서에서 설명된 자동화된 정량화 방법을 사용하여 결정되었다. 이러한 결과는 PMA 자극호중구가 더 큰 면적, 핵 변형의 증가, 대조군 샘플보다 더 높은 DNA 대 순 비율을 가지고 있음을 보여줍니다.
3D 그래프로 결합하면 PMA 자극 샘플은 제어 샘플보다 조임 그룹화 영역을 표시하는 경향이 있습니다. 절차를 시도하는 동안 워크플로우가 여러 기부자를 사용하여 테스트되었지만 사용자가 개별 데이터 집합에 따라 소프트웨어 매개 변수를 적절하게 결정하는 것이 좋습니다.
