Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği
Chapters
Summary November 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.
Transcript
Burada NETS ve immünofloresan görüntüleri ölçmek için tam otomatik bir yaklaşım olan NETQUANT'ı sıyoruz. Bu, araştırmacıların birden çok kullanıcı ve koşullar tarafından oluşturulan verilerden karşılaştırılabilir görüntü analizi yapmalarında yardımcı olacaktır. Bu tekniğin avantajları kullanım kolaylığı, tek hücreli veri analizi, NET oluşumunu değerlendirmek için birden fazla kriter ve birden fazla görüntünün tarafsız analizidir.
Analiz yazılımını yükleyin ve açın. Zenodo GitHub arşivinde veya Nordonfelt Lab web sitesinde güncel bir sürüm bulunabilir. Kurulum sekmesinde, kaynak menüsündeki yol al seçeneğini tıklatarak çözümleme için bir kaynak klasör seçin.
Çözümlenecek görüntü dizilerini içeren klasörü seçin. Yine, hedef menüdeki yol al seçeneğini tıklatın ve görüntü çözümlemesi sonrasında verileri kaydetmek için hedef klasörü seçin. Daha sonra, ayrı kanal görüntüleri kullanırken, KANAL klasörlerini DNA kanalının nükleer DNA lekesi ile karşılık gelecek şekilde adlandırın ve NET kanalı görüntülerdeki nötrofil elastaz lekesini tasvir eder.
Ayrıca, denetim görüntü dosyalarını içeren klasörü denetim olarak adlandırın. Ardından, resim bilgilerini yükle düğmesini tıklatın ve görüntü meta verilerini yazılıma yükleyin. Ardından kanal siparişi alt menüsünde, görüntülerde yer alan doğru kanal sırasını seçin.
Bu, kazara eşleşmeleri önlemeye yardımcı olur. Şimdi ham verilerden birincil görüntü özellikleri elde etmek ve görüntüleri dönüştürmek için veri hazırla düğmesine tıklayın. Dönüştürülen görüntüler daha sonra örnek türleri alt menüsünde görünür.
Örnek türü menüsüne tıklayın, alt menüden bir resim seçin ve sırasıyla DNA ve Nötrofil Ekstrasellüler Kapanı veya NET kanalına bölünmüş görüntüleri görüntülemek için görüntü verilerine tıklayın. Hücreleri kendi kanallarına segmente etmek için segmentasyon yöntemi sekmesini seçin ve hem DNA hem de NET kanalları için yöntem alt menüsünde bir yöntem seçin. Varsayılan segmentasyon yöntemi uyarlamalı olarak ayarlanır ve önerilen ayardır.
Diğer seçenekler küresel kenar ve chanverse dahil olmak üzere yazılım mevcuttur. Yakın yere yerleştirilen hücreler veya NT'ler arasında ayrım yapmaya yardımcı olmak için bir havza seçeneği de eklenmiştir. Ayrıca segmentasyon sekmesinde, segment denetimi örnekleri seçeneğini tıklatın.
Ardından örnek tür alt menüsünden PMA'yı seçin ve veri kümesinde yer alan tüm görüntülerin bölümletilmeye başlamak için toplu iş seçeneğini tıklayın. Ardından, örnek türü menüsündeki görüntüleri seçin ve segmentasyon sonrası oluşturulan DNA ve NET maskeleri için ikili görüntü maskelerini görselleştirmek ve doğrulamak için görüntü görüntü veri düğmesini tıklatın. Şimdi, analiz sekmesinde, denetim örneklerini analiz etmek için eşik belirleme düğmesini tıklatın.
Daha sonra, sağ tarafta, örnek türünü PMA olarak değiştirin ve uyarılmış örneklerin analizini tamamlamak için hücre özelliklerini al düğmesini tıklatın. Ardından, örnek türü alt menüsünden bir resim seçin ve bindirmeyi ve görüntüdeki hücre sayısını ve NET oluşturan hücreleri görüntülemek için görüntü veri düğmesini tıklatın. Örnek türü alt menüsünden örneği seçerek başlayın.
Tek tek görüntüler analiz için örnek türü alt menüsünden seçilebilir veya tüm toplu görüntü toplu seçeneğini seçerek analiz edilebilir. Seçildikten sonra, analizi tamamlamak için analiz NETs düğmesine tıklayın. Belirli bir örnek için en iyi sonuçları elde etmek için NET ölçütlerini el ile ayarlayın.
Tanımlama kalitesini değerlendirmek için tanımlanan NET'leri orijinal görüntülerle karşılaştırın. Bu adım tamamlandıktan sonra, NET ölçütleri veri kümesindeki tüm görüntülere uygulanabilir. NET kriterlerinde yapılan tüm değişiklikler aynı anda tüm kontrol örneklerine de uygulanır.
Görüntü sayısının, görüntü başına hücre sayısının ve görüntü başına NET'lerin yüzdesinin görüntülendiği hücre veri alt menüsündeki veri özetini inceleyin. Sonuç çıktılarını seçmek ve görüntülemek için çıktı sekmesini girin. Çıktının biçimini seçerek ve çıktı sonuçları düğmesine tıklayarak kontrol ve PMA tarafından işlenmiş örneklerin analizinden elde edilen çeşitli veri çıktılarını keşfedin ve karşılaştırın.
Ardından, tek hücreli verileri keşfetmek için sonuç veri tablosu CSV dosyasını başlatın ve örneklerdeki NET alan dağılımını ve DNA'yı NET oranına görselleştirmek için sonuçlar PDF dosyalarını tıklayın. Kırmızı çizgi grafiklerdeki eşik değerini gösterir. Son olarak, NET alanını DNA'nın şekline göre belirlemek için sonuçlar bivariate dağıtım dosyasına tıklayın.
Burada, kontrol nötrofillerinin 15 görüntüsü ve PMA uyarılmış nötrofillerin 15 görüntüsü 10 dakikanın altında analiz edildi. Toplam hücre sayısı sayıldı ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklı hücrelerin yüzdesi bu makalede açıklanan otomatik niceleme yöntemi kullanılarak belirlendi. Bu sonuçlar, PMA uyarılmış nötrofillerin kontrol örneklerinden daha geniş bir alana, nükleer deformasyonda artışa ve NET'e daha yüksek DNA oranına sahip olduğunu göstermektedir.
Bir 3B grafikte birleştirildiğinde, PMA uyarılmış örnekler, kontrol örneklerinden daha sıkı gruplandırma alanlarını gösterme eğilimindedir. Yordamı denerken, iş akışı birden çok donör kullanılarak sınanmış olsa da, kullanıcının yazılım parametrelerine tek tek veri kümesine göre uygun şekilde karar vermesi önerilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
