Please note that all translations are automatically generated.
Her presenterer vi en protokoll for generering av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) og drift av NETQUANT, et helautomatisk programvare alternativ for kvantifisering av NETs i immunofluorescence bilder.
Her presenterer vi NETQUANT, en helautomatisk tilnærming for å kvantifisere NETS- og immunofluorescence-bilder. Dette vil hjelpe forskere med å lage sammenlignbare bildeanalyser fra data generert av flere brukere og forhold. Fordelene med denne teknikken er brukervennligheten, encellede dataanalyse, flere kriterier for å evaluere NET-formasjon og en objektiv analyse av flere bilder.
Installer og åpne analyseprogramvaren. En oppdatert versjon finner du på Zenodo GitHub-arkivet, eller Nordonfelt Labs nettsted. I kategorien oppsett velger du en kildemappe for analyse ved å klikke alternativet hent bane på kildemenyen.
Velg mappen som inneholder bildesekvensene som skal analyseres. Igjen, klikk på hent bane alternativet i målmenyen, og velg målmappen for lagring av dataene etter bildeanalyse. Deretter, når du bruker separate kanalbilder, navngi kanalmappene slik at DNA-kanalen samsvarer med kjernefysisk DNA-flekk, og NET-kanalen viser nøytrofil elaastaseflekken i bildene.
Gi også navnet på mappen som inneholder kontrollbildefilene som kontroll. Deretter klikker du knappen last inn bildeinformasjon og laster inn bildemetadataene i programvaren. Deretter velger du riktig kanalrekkefølge i bildene i undermenyen i kanalrekkefølgen.
Dette bidrar til å forhindre utilsiktede uoverensstemmelser. Klikk nå på klargjør data-knappen for å hente primære bildeegenskaper fra rådata og konvertere bildene. De konverterte bildene vises deretter i undermenyen eksempeltyper.
Klikk på eksempeltypemenyen, velg et bilde fra undermenyen og klikk på vis bildedata for å vise bildene delt inn i henholdsvis DNA og Neutrophil Extracellular Trap, eller NET-kanal. Hvis du vil segmentere cellene i de respektive kanalene, velger du segmenteringsmetoden og velger en metode i metodeundermenyen for både DNA- og NET-kanalene. Standardformatode for segmentering er satt til adaptiv og er den anbefalte innstillingen.
Andre alternativer er tilgjengelige i programvaren, inkludert global kant og chanverse. Et vannskillealternativ er også inkludert for å bidra til å skille mellom tett plasserte celler eller NETs. Også i segmenteringsfanen klikker du på alternativet segmentkontrolleksempler.
Velg deretter PMA fra undermenyen eksempeltype og klikk på batchalternativet for å starte segmentering av alle bildene som er inkludert i datasettet. Deretter velger du bildene i eksempeltypemenyen og klikker på knappen for visning av bildedata for å visualisere og validere de binære bildemaskene for både DNA- og NET-maskene som genereres etter segmentering. Nå, i analysefanen, klikker du på bestemme terskelknappen for å analysere kontrolleksemplene.
Deretter, på høyre side, endre prøvetypen til PMA og klikk på få celleegenskaper knappen for å fullføre analysen av de stimulerte prøvene. Deretter velger du et bilde fra undermenyen eksempeltype og klikker på vis bildedata-knappen for å vise overlegget og antall celler og NET-formingsceller i bildet. Begynn med å velge eksemplet fra undermenyen av eksempeltype.
Individuelle bilder kan velges fra undermenyen for eksempeltype for analyse, eller hele bildegruppen kan analyseres ved å velge alternativet for satsvis. Når du er valgt, klikker du på analyser NETs-knappen for å fullføre analysen. Juster NET-kriteriene manuelt for å gi optimale resultater for et gitt utvalg.
Sammenlign identifiserte NETs med de opprinnelige bildene for å vurdere kvaliteten på identifikasjonen. Når dette trinnet er fullført, kan NET-kriteriene brukes på tvers av alle bildene i datasettet. Eventuelle endringer i NET-kriteriene brukes også samtidig på alle kontrolleksempler.
Inspiser datasammendraget i undermenyen for celledata, der antall bilder, celleantall per bilde og prosentandel av NETs per bilde vises. Angi utdatafanen for å velge og vise resultatutdataene. Utforsk og sammenlign de ulike datautdataene som genereres fra analysen av kontroll- og PMA-behandlede prøver ved å velge utdataformen og klikke på utdataresultatknappen.
Deretter starter du CSV-filen for resultatdatatabellen for å utforske encellede data og klikker på resultatene PDF-filer for å visualisere NET-områdedistribusjonen og DNA til NET-forholdet i prøvene. Den røde linjen angir terskelverdien i diagrammene. Til slutt klikker du på resultatene bivariate distribusjonsfilen for å bestemme NET-området versus formen på DNA.
Her ble 15 bilder av kontroll nøytrofiler og 15 bilder av PMA-stimulerte nøytrofiler analysert på under ti minutter. Det totale antallet celler ble talt og prosentandelen av celler med Neutrophil Extracellular Traps ble bestemt ved hjelp av den automatiserte kvantifiseringsmetoden som er beskrevet i denne artikkelen. Disse resultatene viser at PMA-stimulerte nøytrofiler har et større område, en økning i kjernefysisk deformasjon og et høyere DNA til NET-forhold enn kontrollprøver.
Når de kombineres i en 3D-graf, har DE PMA-stimulerte prøvene en tendens til å vise områder med strammegrupperinger enn kontrollprøvene. Mens du prøver prosedyren, er det viktig å huske at selv om arbeidsflyten ble testet ved hjelp av flere givere, anbefales det at brukeren skal bestemme programvareparameterne på riktig måte basert på det enkelte datasettet.
