Automatiserad bildbaserad kvantifiering av neutrofila extracellulära fällor med NETQUANT

Här presenterar vi NETQUANT, en helt automatiserad metod för att kvantifiera NETS och immunofluorescens bilder. Detta kommer att hjälpa forskare att göra jämförbara bildanalys från data som genereras av flera användare och villkor. Fördelarna med denna teknik är användarvänligheten, encellig dataanalys, flera kriterier för att utvärdera NET-formation och en förutsättningsfri analys av flera bilder.

Installera och öppna analysprogramvaran. En aktuell version finns på Zenodo GitHub-arkivet, eller Nordonfelt Labs webbplats. Välj en källmapp för analys på fliken Konfigurera inställningar genom att klicka på alternativet hämta sökvägen i källmenyn.

Välj den mapp som innehåller de bildsekvenser som ska analyseras. Igen, klicka på alternativet hämta sökväg i målmenyn, och välj målmappen för att spara data följande bildanalys. Därefter, när du använder separata kanalbilder, namnge kanalmapparna så att DNA-kanalen motsvarar den nukleära DNA-fläcken, och NET-kanalen skildrar neutrofilatasfläcken i bilderna.

Namnge också mappen som innehåller kontrollbildfilerna som kontroll. Klicka därefter på knappen för information om inläsningsbilden och läs in bildmetadatan i programvaran. Välj sedan i undermenyn kanalordning rätt kanalordning som finns i bilderna.

Detta bidrar till att förhindra oavsiktliga missmatchningar. Klicka nu på knappen förbered data för att skaffa primära bildegenskaper från rådata och konvertera bilderna. De konverterade bilderna visas då i undermenyn för exempeltyper.

Klicka på provtypmenyn, välj en bild från undermenyn och klicka på visa bilddata för att visa bilderna uppdelade i DNA och Neutrophil Extracellular Trap, respektive NET kanal. Om du vill segmentera cellerna i respektive kanal väljer du fliken segmenteringsmetod och väljer en metod i metodens undermeny för både DNA- och NET-kanalerna. Standardmetoden för segmentering är inställd på adaptiv och är den rekommenderade inställningen.

Andra alternativ finns i programvaran inklusive global edge och chanverse. Ett vattendelare alternativ har också inkluderats för att skilja mellan nära placerade celler eller NETs. Även i segmentering fliken, klicka på alternativet segmentkontrollprover.

Välj sedan PMA från exempel typ sub-menyn och klicka på batch-alternativet för att börja segmentering av alla bilder som ingår i datamängden. Därefter väljer du bilderna i menyn provtyp och klickar på knappen visa bilddata för att visualisera och validera den binära bild masker för både DNA och NET masker genererade efter segmentering. Nu, i analys fliken, klicka på knappen bestämma tröskelvärdet för att analysera kontrollproverna.

Sedan, på höger sida, ändra provtyp till PMA och klicka på knappen hämta cellegenskaper för att slutföra analys av de stimulerade proverna. Därefter väljer du en bild från undermenyn provtyp och klickar på knappen visningsbilddata för att visa överlägget och antalet celler och NET-formande celler i bilden. Börja med att välja provet från delmenyn för provtyp.

Enskilda bilder kan väljas från den exempeltyp undermenyn för analys eller hela partiet av bilder kan analyseras genom att välja batch alternativet. När du har valt, klicka på knappen analysera NETs för att slutföra analysen. Justera NET-villkor manuellt för att ge optimala resultat för ett givet prov.

Jämför identifierade neots med de ursprungliga bilderna för att bedöma identifieringens kvalitet. När det här steget har slutförts kan NET-villkoren tillämpas över alla bilder i datauppsättningen. Alla ändringar som görs i NET-kriterierna tillämpas också samtidigt på alla kontrollprover.

Inspektera datasammanfattningen i celldataundermenyn, där antalet bilder, cellantal per bild och procentuell andel av DET per bild visas. Ange fliken utdata för att välja och visa resultatet utgångar. Utforska och jämför de olika datautgångarna som genereras från analysen av kontroll- och PMA-behandlade prover genom att välja formen för utdata och klicka på knappen för utgångsresultat.

Därefter lanserar resultaten datatabellEN CSV fil för att utforska encellsdata och klicka på resultaten PDF-filer för att visualisera NET områdesfördelning och DNA till NET förhållandet i proverna. Den röda linjen anger tröskelvärdets värde i graferna. Slutligen, klicka på resultaten bivariat distributionsfil för att bestämma NET området kontra formen av DNA.

Här analyserades 15 bilder av kontroll neutrofiler och 15 bilder av PMA-stimulerade neutrofiler på under tio minuter. Det totala antalet celler räknades och andelen celler med Neutrofil Extracellulära fällor bestämdes med hjälp av den automatiserade kvantifieringsmetoden som beskrivs i den här artikeln. Dessa resultat visar att PMA-stimulerade neutrofiler har ett större område, en ökning av kärndeformation och ett högre DNA-förhållande till NET än kontrollprover.

När de kombineras till en 3D-graf tenderar de PMA-stimulerade proverna att visa områden med åtdragande gruppföringar än kontrollproverna. Medan du försöker proceduren är det viktigt att komma ihåg att även om arbetsflödet testades med hjälp av flera givare, rekommenderas att användaren bör besluta om programvaran parametrar på lämpligt sätt baserat på den enskilda datamängden.