Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generation af 3D hud Organoid fra ledningen blod-afledte induceret pluripotente stamceller
Chapters
Summary April 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi foreslår en protokol, der viser hvordan du differentiere inducerede pluripotente stamceller-afledt keratinocytter og fibroblaster og generere en 3D hud organoid, ved hjælp af disse keratinocytter og fibroblaster. Denne protokol indeholder en yderligere skridt til at generere en humaniseret mus model. Teknikken præsenteret her vil forbedre dermatologiske forskning.
Transcript
Navlestrengsblod mononukleare celler, eller CBMC, har vist sig som en potentiel celle kilde til regenerativ medicin, fordi human leukocyt antigen skrive er afgørende for celle banksystem. CBMC-inducerede pluripotente stamceller, eller CMBC-iPSCs, kan differentieres i keratinocytter og fibroblaster. For at generere 3D hud organoid, vi bruger dermatologisk forskning.
Begynd med at dyrke CBMC-iPSC på vitronectin-belagt 100-milliliter plader ved 37 grader Celsius og 10% kuldioxid. Når cellerne har nået 80% sammenløb, vaskes kulturerne med PBS, og behandle dem med en milliliter 1-millimolar EDTA pr. plade i to minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Når cellerne er taget af, skal reaktionen stoppes med tre milliliter E8-medium pr. plade, og cellerne indsamles ved centrifugering.
Pellets skal pellets igen i fem milliliter E8-medium til tælling, og overfør en gang-10-til-den sjette celler til et 15-milliliter konisk rør til centrifugering. Re-suspendere de overførte celler med 2,5-milliliter embryonale organ dannelse medium, suppleret med 10-mikromolar rho-associeret kinase, eller ROCK-hæmmer. Brug en pipette til at overføre 125-mikroliter dråber celler på et ubestrøget kulturpladelåg.
Når alle dråberne er placeret, skal du vende skålen, så dråberne kan hænge fra låget i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste dag vaskes låget med frisk E8-medium, og embryonale kropsopløsninger overføres til et 50-milliliter konisk rør. Lad embryonale organer til at nøjes med et minut ved stuetemperatur, før indsugning supernatant og re-suspension af embryonale organer med frisk E8 medium for deres kultur i en 90-millimeter petriskål ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, indtil deres differentiering.
For CBMC-iPSC keratinocytdifferentiering erstattes E8-mediet fra embryonale legemestation med frisk E8-medium suppleret med et nanogram pr. milliliter knoglemorfogenetisk protein 4 for en 24-timers inkubation ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid. Den næste dag, høste embryonale organer i en 50-milliliter konisk rør som påvist, og lad kroppene til at nøjes med et minut ved stuetemperatur. Dernæst erstatte supernatant med seks milliliter keratinocyt differentiering medium 1, eller KDM1, suppleret med 10 mikromolar ROCK-hæmmer, og overføre embryonale organer til en Type IV Kollagen-belagt 100-millimeter skål.
På dags nul gennem otte af kultur, erstatte mediet hver anden dag med frisk KDM1, suppleret med tre-mikromolar retinsyre og 25 nanogram per milliliter hver af knogle morfogenetiske protein 4 og epidermal vækstfaktor. Mellem dag ni til 12 erstattes mediet hver anden dag med KDM2 suppleret med tre mikromolarretinsyre, 25 nanogram pr. milliliter knoglemorfogenetisk protein 4 og 20 nanogram pr. milliliter epidermal vækstfaktor. Mellem dag 13 til 30, ændre mediet hver anden dag til KDM3, suppleret med 10 nanogram pr. milliliter knoglemorfogenetisk protein 4, og 20 nanogram pr. milliliter epidermal vækstfaktor.
For CBMC-iPSC fibroblast differentiering, re-suspendere embryonale kropskultur i seks milliliter fibroblast differentiering medium 1, suppleret med 10-mikromolar ROCK-hæmmer, og overføre embryonale organ suspension til en kælder membran matrix-belagt 100-millimeter skål. Efter tre dages inkubation behandles kulturen med 0,5-nanomolar knoglemorfoogenetiske protein 4 i fire dage, før mediet til fibroblastdifferentieringsmediet 2 ændres. På dag syv af kultur, ændre mediet til FDM2 hver anden dag i en uge.
På kulturens dag 14 skal cellerne løsnes med en millimolar EDTA som påvist, og cellerne opsamres i tre milliliter fibroblastdifferentieringsmedium 2 til centrifugering. Re-suspendere cellerne i fem milliliter fibroblast differentiering medium 1 til optælling, og overføre to gange-10-til-den-sjette celler til en ikke-belagt fad. På kulturens dag overføres to gange-10-til-den sjette celler fra kulturen til en Type I Collagen-belagt 100-millimeter skål i frisk fibroblastdifferentieringsmedium 1.
På kulturens dag 28 overføres to gange-10-til-seks af de iPSC-afledte fibroblaster til en ny ikke-belagt skål. For tre-dimensionelle hud organoid generation, høste iPSC-afledte fibroblaster fra kultur, og overføre to gange-10-til-femte celler til en 15-milliliter konisk rør til centrifugering. Re-suspendere fibroblast pellet i 1,5 milliliter fibroblast differentiering medium 1, og 1,5 milliliter neutraliseret Type I Kollagen opløsning.
Inkuber cellerne på en indsats i en seks-brønd mikroplade i 30 minutter ved stuetemperatur. Når opløsningen er størknet, tilsættes to milliliter medium til toppen af indsatsen og tre milliliter til bunden af brønden. Derefter placere fibroblast matrix i inkubatoren i fem til syv dage, indtil geleringen er færdig, og matrixen ikke længere kontrakter.
Ved inkubationens afslutning høstes de iPSC-afledte keratinocytter, og der overføres en gang-10-til-sjette celler til et konisk rør med 15 milliliter til centrifugering. Re-suspendere pellet i 50 til 100 mikroliter af lav calcium epitel medium 1, og erstatte medium over fibroblast matrix med keratinocyt celleopløsning. Efter 15 minutter ved 37 grader Celsius, erstatte mediet i toppen af indsatsen med to milliliter epitel medium 1, og mediet i bunden godt med tre milliliter af samme, og returnere pladen til inkubatoren.
Efter to dage udskiftes mediet i indsatsen og brønden med normalt calciumpitelmed 2 i yderligere to kulturdage. På dag fire af kultur, fjerne alle de mellemstore, og tilsæt tre milliliter cornification medium til bunden godt kun, at generere en luft-væske interface. Derefter returneres pladen til inkubatoren i op til 14 dage, før 3D-hudorganoiden høstes til downstream-analyse.
CBMC-iPSC-afledte keratinocytter har morfologi svarende til primære keratinocytter, og ekspressionen af keratinocyt markører øges i disse celler. CBMC-iPSC-afledte fibroblaster har morfologi svarende til primære fibroblaster, og udtrykket af pluripotente stamcellemarkør Oct-4 er ned-reguleret, mens fibroblast markører er op-reguleret. Tykkelsen af 3D hud organoid stiger under 3D-kultur, bekræfter, at 3D hud organoid er genereret fra iPSC-afledte keratinocytter og fibroblaster.
Efter to uger, en transplanteret 3D hud organoid graft effektivt inkorporerer i en modtager mus hud, som bekræftet af HNE analyse. Endvidere er keratinocytmodning og epidermal differentieringsmarkører udtrykt i CBMC-iPSC-afledte 3D-hudorganoider, der viser en funktionel differentiering, effektiv podning og effektiv heling af museskinddefekter. Vi bruger tidligere med det høje calciummedium, der inducerer lagdelte lag af 3D-hud organoid til at efterligne nær huden.
analyse viser, at huden er stratificeret. CBMC-iPSCs er en potentiel cellekilde for hudtransplantationer, og CBMC-iPSC-afledte 3D-hudorganoider kan anvendes i undersøgelser relateret til dermatologi, kosmetisk screening og regenerativ medicin.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
