果蝇、果蝇细胞免疫应答的评估

这种体内吞噬分析使研究人员能够进行基因筛选和全基因组关联研究，以确定调节成人血细胞中吞噬的新基因。该实验是定量的，易于执行，可用于活的动物的宿主因素的筛选，影响病原体识别、吸收和清除。用拔针器拉薄壁玻璃毛细管后，使用千分尺将针头放在显微镜下，并使用五号细点不锈钢钳子将尖端断裂到100微米的尖端直径。

要测量将注入到每只苍蝇中的液体体积，在 PBS 中装载带无菌 5% 食品色素的毛细管针，并将液体排出到 0.01 毫米级微米的矿物油滴上。将每毫升颗粒10微升1.6毫克的颗粒分配到小方的 Parafilm 上，然后将液体拉入针头。将针头安装到喷油器喷嘴中，沿着飞垫上指定的区域将麻醉苍蝇线，腹侧朝上，头部朝向喷油器前部。

将小瓶放在长凳上的相应区域，用五、百毫秒的液体泵将苍蝇注射到腹部的上角，总共提供约 10 纳米升的颗粒。在注射时将每只苍蝇转移到适当的小瓶中，注意小瓶上的时间。接下来，用0.4%的 Trypan Blue 溶液装载新针头，将气动喷油器设置为门控，使空气源不断流动，将液体从针头中推出。

初始注射后30分钟，用 Trypan Blue 注射每个苍蝇腹部，直到腹部充满和扩张。用电胶带将苍蝇安装在显微镜幻灯片上，腹侧向下，将机翼推到苍蝇的一侧，将它们固定到磁带上。然后，轻轻地将头部推入磁带，以确保苍蝇不会移动。

在所有的苍蝇都安全后，立即在数码相机和计算机的倒置荧光显微镜上以25或32倍的放大倍率对昆虫进行图像，并使用数码相机的计算机软件聚焦在每只苍蝇的后侧容器上。然后，记录实验之间的曝光时间和放大倍率。要量化荧光，请打开适当的成像分析程序，然后打开一个图像。

要测量后体容器的荧光强度，请在后体周围绘制一个多边形，然后选择”测量”以记录多边形内的荧光强度。要确定背景荧光强度，请复制第一个多边形，然后将其移动到每个苍蝇的后轮相邻的区域。然后，选择”测量”，并记录背景区域的荧光强度。

为了通过背景荧光使后体荧光正常化，在测量其余苍蝇的荧光强度后，将后体荧光除以背景荧光，并计算一种菌株中所有苍蝇的平均归化后体荧光强度。将腹侧安装在一块电胶带上后，腹部的后侧容器位于的腹部前两段清晰可见。实验误差的主要来源出现在手术的注射和成像步骤上。

使用相同的针头注射多只苍蝇可能会导致它被苍蝇组织或颗粒堵塞。苍蝇在整个腹部未获得足够的 Trypan 蓝色荧光，可降低背部容器与背景荧光的比率，从而降低动物真正的荧光强度比。苍蝇应在被二氧化碳固定时拍摄，因为主动移动的苍蝇会产生无法量化的模糊图像。

Zuker收集的乙基甲烷硫化物处理苍蝇的突变线无法产生吞咽克阴性细菌和克阳性细菌，在体内噬菌体测定中几乎没有显示后体荧光，与等源背景Zuker菌株和另一种常见的实验室控制菌株配对。跟踪苍蝇注射的时间和顺序，以确保苍蝇在成像时处于病原体识别和吸收的可比阶段。通过研究单血细胞与共生显微镜或荧光激活细胞分选后或通过成人血细胞的磁珠分离，可以确定噬菌体缺陷的分子机制。