הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

בדיקה זו של vivo phagocytosis מאפשרת לחוקרים לבצע מסכים גנטיים וחוקרים של אסוציאציה כלל-גנומית כדי לזהות גנים חדשניים המווסתים phagocytosis בתאי דם בוגרים. ניסוי זה הוא כמותי, קל לביצוע, ו ניתן ליישם אותו על הקרנת בעלי חיים חיים עבור גורמים מארחים המשפיעים על זיהוי פתוגן, ספיגה וסיווג. לאחר משיכת נימי זכוכית דקים עם מושך מחט, השתמש במיקרומטר כדי להחזיק את המחט מתחת למיקרוסקופ, ולהשתמש פינצטה מספר חמש, נקודה עדין, נירוסטה כדי לשבור את הקצה לקוטר קצה 100 מיקרומטר.

כדי למדוד את נפח הנוזל כי יוזרק לתוך כל זבוב, לטעון מחט נימי עם 5% צבעי מזון סטרילי PBS, ולגרש את הנוזל על טיפת שמן מינרלי על מיקרומטר שלב 0.01 מילימטר. לוותר על 10 microliters של 1.6 מיליגרם לכל חלקיקים מיליליטר על ריבוע קטן של Parafilm, ולמשוך את הנוזל לתוך המחט. הר את המחט לתוך הזרבובית מזרק, ומרפדים את זבובים הרדמה לאורך האזור המיועד שלהם על כרית לטוס, צד הגחוני למעלה, עם הראשים מכוונים לכיוון החלק הקדמי של כרית.

מניחים את הבקבוקונים באזורים המתאימים על הספסל, ומזריקים את הזבובים בפינה העליונה של הבטן עם חמש, משאבות 100 אלפיות שנייה של נוזלים כדי לספק כ -10 ננוליטר של חלקיקים בסך הכל. להעביר כל זבוב לתוך הבקבוקון המתאים כפי שהוא מוזרק, ונוי על הזמן על הבקבוקון. לאחר מכן, לטעון מחט חדשה עם 0.4% פתרון טריפאן כחול, ולהגדיר את מזרק פנאומטי מגודר, כדי לאפשר זרימה מתמדת של אוויר לדחוף את הנוזל מתוך המחט.

30 דקות לאחר ההזרקה הראשונית, להזריק כל בטן זבוב עם טריפאן כחול עד הבטן מלאים ונומרד. הר את הזבובים על מגלשות מיקרוסקופ עם סרט חשמלי, צד גחוני למטה, דוחף את הכנפיים לצד הזבוב כדי לאבטח אותם לקלטת. לאחר מכן, בעדינות לדחוף את הראש לתוך הקלטת כדי להבטיח כי הזבוב לא יזוז.

מיד לאחר שכל הזבובים אובטחו, תדמיינו את החרקים, בזה אחר זה, בהגדלה של פי 25 או 32 במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המחובר למצלמה דיגיטלית ולמחשב, תוך התמקדות בכלי הגב של כל זבוב באמצעות תוכנת המחשב למצלמה הדיגיטלית. לאחר מכן, רשום את זמן החשיפה וההגדלה בין הניסויים. כדי לכמת את הפלואורסצנטיות, פתח תוכנית ניתוח הדמיה מתאימה ופתח תמונה אחת.

כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כלי הגב, צייר מצולע סביב כלי הגב, ובחר למדוד כדי לתעד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך המצולע. כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע, העתק את המצולע הראשון והזז אותו לאזור הסמוך לכלי הגב של כל זבוב. לאחר מכן, בחרו ‘מדידה’ והקליטו את עוצמת הפלואורסצנטיות של אזור הרקע.

כדי לנרמל את פלואורסצנטיות כלי הגב על ידי פלואורסצנטיות הרקע, לאחר מדידת עוצמות פלואורסצנטיות של שאר הזבובים, לחלק את פלואורסצנטיות כלי הגב על ידי פלואורסצנטיות הרקע, ולחשב את עוצמת פלואורסצנטיות כלי הגב מנורמל הממוצע של כל הזבובים בזן אחד. לאחר רכוב בצד הגחוני למטה על פיסת סרט חשמלי, שני החלקים הראשונים של הבטן, שבו כלי הגב ממוקם, גלויים בבירור. מקורות עיקריים של שגיאה ניסיונית מתעוררים בשלבי ההזרקה וההדמיה של ההליך.

שימוש באותה מחט כדי להזריק זבובים מרובים עלול לגרום לו להיות סתום עם רקמת זבוב או חלקיקים. זבובים שלא מקבלים מספיק פלואורסצנטיות כחולה טריפאן בבהירות לאורך כל הבטן שלהם, אשר יכול להפחית את היחס של כלי הגב אל פלואורסצנטיות הרקע, ובכך להקטין את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות האמיתי של החיה. זבובים צריכים להצטלם בעודם משותקים על ידי פחמן דו חמצני, כיוון שזבובים נעים באופן פעיל מייצרים תמונות מטושטשות שלא ניתן לכמת.

קו מוטנטים מאוסף צוקר של זבובים שטופלו באתיל מתנסולפונט אינם מסוגלים לפגוציטוז חיידקים גרם שליליים וגרם חיוביים ומציג כמעט שום פלואורסצנטיות של כלי הגב בהסתע in vivo phagocytosis, יחד עם זן צוקר הרקע היזוגניים ועוד זן בקרת מעבדה נפוץ. עקוב אחר הזמן והסדר שבו מוזרקים זבובים כדי להבטיח שזבובים נמצאים בשלבים דומים של זיהוי פתוגן וקליטה בעת הדמיה. ניתן לקבוע את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פגמים פאגוציטים על ידי לימוד המוציטים בודדים עם מיקרוסקופיה קונפוקרטית או לאחר מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או על ידי בידוד חרוזים מגנטי של המוציטים בוגרים.