Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling
Chapters
Summary May 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.
Transcript
Dit protocol is met name relevant omdat het de detectie en selectie van enkele cellen uit een pool van gemengde cellen mogelijk maakt voor latere downstream-analyse met een resolutie van één cel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het potentieel om individuele circulerende tumorcellen, of CTC's, te scheiden van bloedcellen voor een reeks analyses die een hoge zuiverheid vereisen. Begin met het opstarten van de micromanipulatorsoftware en het inschakelen van de micromanipulator.
Sluit de micromanipulator aan op de computer en klik op Verbinding maken en initialiseren apparaat om de robotarm in de microscoopfase te initialiseren. Reinig de externe en interne oppervlakken van de beschermkast met ethanol en sluit de beschermkast na elke manipulatie van de machine om het apparaat door de computer te kunnen manoeuvreren. Installeer een nieuwe 20 tot 30 micrometer glazen capillaire op de robotarm en spoel systeemolie door het systeem om eventuele bellen in de slang te verwijderen.
Vul sterilisatie tank een met 70%ethanol, sterilisatie tank twee met steriel nuclease-vrij water, en de buffer tank met steriele Dulbecco's PBS. Steriliseer de capillaire twee keer met 70%-ethanol en vervang sterilisatietank één door sterilisatietank twee om de sterilisatiefunctie te gebruiken om de capillaire in water minstens drie keer te wassen. Start in de software voor micromanipulator een nieuw experiment en selecteer het type plukexperiment in de automatische en handmatige selectiemodi.
Configureer de deklade om de posities van de sterilisatietank, buffertank en deponerende lade op te geven en stel de temperatuur van de vloeistoftanks in de geselecteerde deponerende lade in op vier graden Celsius. Plaats een ultralaage bevestigingsplaat met de vrijgekomen CTC-oplossing onder de micromicromanipulatorkast. Haal het deksel van de plaat en sluit de kast.
Centrifuge een 384-well plaat met 20 microliters van CTC cultuur medium per goed om ervoor te zorgen dat het medium wordt afgezonderd aan de onderkant van elke put en plaats de plaat in het doel een positie van de vier graden Celsius geselecteerde deponerend lade. Selecteer handmatig de microscoopdoelstelling voor het plukken en de belichtingstijd van alle benodigde kanalen. Selecteer Well Navigator weergeven om het type ophaalplaat te visualiseren en te selecteren.
Kalibreer vervolgens een ophaalpositie in het midden van de put met de CTC-oplossing zonder cellen in het midden van het gezichtsveld. Gebruik de sensor om de onderkant van de plaat voorzichtig aan te raken met een capillair en de ophaalpositie op 0,05 millimeter boven de bodem van de plaat in te stellen. Laat de robotarm voorzichtig met 10 micrometer per keer zakken om beschadiging van de capillaire te voorkomen.
Selecteer het celtype en de pickparameters. Selecteer de handmatige modus voor het kiezen van één cel. Gebruik de joystick om de glazen capillaire navigeren in de put en plaats de capillaire op de top van een enkele cel van belang ten minste een millimeter van de put grens.
Voeg vervolgens handmatig deeltjes toe en selecteer Geactiveerde deeltjes kiezen om het plukken te starten. Wanneer alle cellen zijn geplukt, centrifugeren de plaat om sediment de cellen op de bodem van elke put. Bio-amino kleuring met anti-epitheelcelheemcuuleenlichaam antilichaam maakt de visualisatie van kankercellen in de suspensie met een nauwkeurig onderscheid van CD45 positieve gebeurtenissen.
Nauwkeurige CTC isolatie wordt gekenmerkt door de aspiratie van alleen het gewenste doel zonder de omringende verontreinigingscellen. Zoals vermoed, CTC clusters tonen een toename van de overleving in vergelijking met enkele CTC's, waardoor de aanleiding voor celkolonies binnen 56 dagen na in-vitro cultuur. Met name CTC clusters vertonen ook een hogere proliferatie snelheid en dus bereiken hogere uiteindelijke celnummers, wat aangeeft dat het directe contact met andere tumorcellen heeft een impact op zowel de levensvatbaarheid van tumorcellen en proliferatie tarief.
Single-cell RNA sequencing van CTC's direct geïsoleerd van borstkanker patiënten onthult een T-gedistribueerde stochastische buurman inbedding van single-cellen afgeleid van enkele CTC's, CTC clusters, of CTC witte bloedcellen clusters. Vergeet niet om de glazen capillaire te installeren om luchtbellen te verwijderen in het fluidic systeem van de micromanipulator en om de pick-up positie te kalibreren om een efficiënte single-cell picking te garanderen. De single-cells kunnen worden gezaaid of verder verwerkt voor de volgende generatie sequencing om ex-vivo analyse en CTC karakterisering mogelijk te maken op een single-cell resolutie om het gemetastaseerde proces te onderzoeken.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
