Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Aantonen van een lineaire relatie tussen vasculaire endotheliale groei factor en luteïniserend hormoon in nier schors extracten
Chapters
Summary January 22nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier gepresenteerd is een protocol voor het gebruik van een corticale nier extract voorbereiding en totale eiwit normalisatie om de correlatie tussen vasculaire endotheliale groeifactor en luteïniserend hormoon in de nier van zoogdieren demonstreren.
Transcript
Ons protocol merkt op dat het gebruik van nierextracten van koeien en varkens een uitstekende en economische hulpbron is voor de studie van nierfysiologie, met name het onderzoeken van de correlatie tussen vasculaire endotheelgroeifactor en andere analyten. Het is altijd een uitdaging geweest om VEGF, een essentiële groeifactor in orgaan angiogenese, te correleren met andere eiwitten. Deze techniek stelt ons in staat om de associatie tussen VEGF en analyten zoals hormonen te onderzoeken.
Dit zal zeker onze kennisbasis ten aanzien van deze belangrijke groeifactor bevorderen. Deze methode kan nuttig zijn voor het correleren van andere analyten in niercorticale extracten naast de in deze video genoemde. Visuele demonstratie zal anderen helpen om reproduceerbare resultaten te verkrijgen zonder enige steekproef fouten.
Het gebruik van vers weefsel is essentieel voor het succes van deze techniek. Het is belangrijk om direct na het slachten verse hele nieren van een dier te verkrijgen. Breng het weefsel altijd over naar het laboratorium op ijs.
Gebruik steriele schaar, tangen, een mes, en petrischaaltjes om nieren te ontleden en accijns het vereiste weefselgedeelte. Snijd de nier voorzichtig doormidden langs het sagittale vlak en snijd een stuk weefsel uit het cortexgebied in het midden van de nier. Hak het weefsel in kleine stukjes met het mes en breng het in een microfuge buis met een milliliter ijskoude 1X RIPA lyse extractie buffer.
Label de buis met specifieke monsterdetails en leg deze op ijs. Gebruik een handheld homogenisator met een steriele sonde om het weefsel gedurende één tot twee minuten te homogeniseren totdat er geen brokken zichtbaar zijn, en hydrateer de buis onmiddellijk op 9, 600 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Bereid na centrifugatie afzonderlijke aliquots van het monster voor ELISA en totale eiwitanalyse om meervoudige vries-/dooicycli te voorkomen.
Voordat u met de test begint, brengt u alle reagentia en de testplaat op kamertemperatuur om de overtollige putten te verwijderen en ze bij vier graden Celsius op te slaan tot verder gebruik. Verdun de 20X wasbuffer tot 300 milliliter met dubbel gedestilleerd water en zet de lege putten zonder enige oplossing. Voeg 50 microliter standaard of monster en nog eens 50 microliters mierikswortel peroxidase conjugaat toe aan elke put, voeg dan onmiddellijk 50 microliters antilichaamoplossing toe aan elke put en verzegel de plaat.
Meng de plaat en broed het op 37 graden Celsius gedurende een uur. Na de incubatie, was elke put met 200 microliters van wasbuffer. Voeg 50 microliter substraat A en substraat B toe aan elke put, meng de plaat voorzichtig door op de zijkant te tikken en sluit het vervolgens 15 minuten af in het donker bij 37 graden Celsius.
Voeg 50 microliter stopoplossing toe aan elke put. Tik voorzichtig op de plaat en lees de absorptie op 450 nanometer met een spectrofotometer. Bereid de reagentia en was buffer zoals eerder beschreven, voeg dan 100 microliter van standaard of monster aan elke put, verzegel de plaat, meng goed, en uitbroed het gedurende twee uur op 37 graden Celsius.
Verwijder de vloeistof in elke put en voeg 100 microliter van detectie reagens A.Seal de plaat en uitbroed het voor nog een uur. Vervolgens was je elke put met 400 microliters wasbuffer, voeg dan 90 microliter substraatoplossing toe aan elke put, tik voorzichtig op de plaat en broed het nog een uur uit bij 37 graden Celsius. Voeg na de laatste incubatie 50 microliter stopoplossing toe aan elke put, tik voorzichtig op de plaat en lees de absorptie op 450 nanometer met een spectrofotometer.
Schat het totale eiwit van de runder- en varkensnierextracten met een standaard BSA-test en gebruik deze schatting om de LH- en VEGF-A-ELISA-resultaten te normaliseren. De gemiddelde en mediane niveaus van LH en VEGF werden berekend voor zowel dieren als geslachten. Na het verifiëren van de normaliteit van gegevens werden lineaire regressiemodellen gebruikt om de relatie tussen LH en VEGF te onderzoeken.
LH bleek een sterke en significante voorspeller van VEGF te zijn in zowel runder- als varkensnieren. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om identieke gebieden in elk weefsel monster. Een soortgelijke procedure kan worden gebruikt om elk type weefsel te extraheren.
Vergeet niet om analyten te normaliseren door het totale eiwitextract van welk weefsel je ook gebruikt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
