Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

O protocolo que apresentamos aqui será útil para entendermos como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune do sistema nervoso central. Com este método, linfócitos no cérebro podem ser estudados em uma célula por célula. Este protocolo também pode ser aplicado a outros modelos e doenças do sistema nervoso central que precisavam analisar as características e funções das células imunes.

Neste vídeo, o protocolo pode facilmente demonstrar como induzir modelo e isolar células únicas no cérebro. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, use uma seringa de um mililitro para injetar subcutâneamente camundongos C57BL/6 anestesiados com 100 microgramas de MOG 35-55 em 100 microlitres de completojuvante de Freund em dois locais diferentes da parte de trás perto do pescoço. No mesmo dia e no segundo dia pós-imunização, injete intraperitoneally os camundongos com 200 microliters de um nanograma por solução de trabalho de toxina de coqueluche microliter.

Após a segunda injeção, transfira os ratos de volta para sua gaiola com uma almofada de aquecimento e monitoramento até a recumbência total. No dia seguinte e ao longo da doença, examine e acerde todos os camundongos de forma cega para os sinais neurológicos descritos na tabela e para quaisquer alterações de peso. No ponto final experimental apropriado, corte o crânio cuidadosamente do nariz para o pescoço e transfira o cérebro de cada animal da caixa craniana para tubos individuais de 50 mililitros contendo 10 mililitros de meio RPMI.

Misture bem os tubos para remover os glóbulos vermelhos aderentes e remova o meio por aspiração. Adicione 10 mililitros de meio fresco a cada tubo e transfira os cérebros em pratos individuais de 100 milímetros. Finalmente corte cada cérebro com uma navalha e use uma pipeta de plástico para transferir o máximo de tecido de um prato de cada vez e seis mililitros de meio em um homogeneizador de vidro centrado em sete mililitros.

Triture o cérebro usando o êmbolo solto do pilão antes de usar o êmbolo apertado para trazer o tecido até que a suspensão seja homogênea. Em seguida, despeje o chorume de tecido resultante em um tubo cônico pré-refrigerado de 15 mililitros no gelo. Quando todas as amostras tiverem sido homogeneizadas, ajuste o volume em cada tubo para sete mililitros com meio fresco, antes de adicionar cada suspensão tecidual a um novo tubo refrigerado de 15 mililitros contendo três mililitros de matriz de membrana 100% por tubo.

Misture por inversão algumas vezes e use uma pipeta de três mililitros para adicionar cuidadosamente e lentamente um mililitro de solução de gradiente de densidade de 70% sob cada amostra de solução de tecido. Separe as células por centrifugação gradiente de densidade e remova quase toda a camada superior, tomando o cuidado de remover completamente toda a mielina. Transfira a interface para um novo tubo de 15 mililitros e ajuste o volume para 10 mililitros com meio fresco.

Em seguida, centrifufique as amostras novamente e remova o supernascer antes de reutilizar as pelotas em cerca de 100 microliters de médio por tubo. Para análise citométrica de fluxo das células cerebrais colhidas, aloque aproximadamente duas vezes 10 para as seis células em 100 microliters de médio em poços individuais de uma placa de 96 poços. Quando todas as células tiverem sido banhadas, adicione 100 microliters de coquetel de estimulação celular 500X mais inibidores de transporte de proteínas aos poços e coloque a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas.

No final da incubação, as células na parte inferior dos poços por centrifugação e resuspensam as pelotas em 100 microliters de tampão de citometria de fluxo por poço. Pré-incubar as células com três microliters de Bloco Anti-Mouse CD16/CD32 Fc por 10 minutos a quatro graus Celsius antes de coloração. Para bloquear quaisquer interações não específicas mediadas por Fc.

No final da incubação, adicione o coquetel de anticorpos de interesse a cada poço e coloque o prato a quatro graus Celsius protegido da luz. Após 30 minutos, lave os poços com 100 microliters de tampão de citometria de fluxo por poço e sedimente as células por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, adicione 200 microliters de buffer de fixação intracelular a cada poço.

Após uma incubação de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente, colete as amostras por centrifugação e resuspenja as pelotas em 200 microliters de 1X tampão de permeabilidade por poço. Centrifugar as amostras novamente, e depois de descartar o supernascer, resuspenque as pelotas em 100 microliters com tampão de permeabilização fresco. Em seguida, adicione os anticorpos apropriados para a detecção de quaisquer antígenos intracelulares de interesse para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius, protegidos da luz.

No final da incubação, adicione 100 microlitadores de 1X tampão de permeabilização a cada poço e gire as amostras por centrifugação. Em seguida, resuspende as células de coloração em 200 microliters de tampão de coloração de citometria de fluxo e analise as células por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão. Um curso clínico típico da EAE deve resultar em uma curva da doença e mudança no peso corporal como ilustrado.

Os camundongos C57BL/6 imunizados com MOG 35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença por volta do dia 10 a 12 e atingem o pico da doença por volta do dia 15 a 21. Antes do surgimento da doença, o peso corporal dos camundongos imunizados aumenta gradualmente antes de diminuir em correlação com os sintomas crescentes da doença Os camundongos demonstram o menor peso corporal no pico da EAE, com os pesos corporais se recuperando ligeiramente à medida que os sintomas clínicos diminuem. Os camundongos geralmente não se recuperam totalmente no entanto e normalmente passam a desenvolver uma patologia de doença crônica monofásica.

Como ilustra esta análise representativa de fluxo, as células Th1 e Th17 produtoras de interferon gama são significativamente aumentadas em camundongos EAE. O passo mais importante é o 3.10. O operador deve transferir a camada média e a luz, sendo cuidadosamente, tomar o menor número possível de camadas.

Seguindo estes protocolos, podemos mais linfócitos T para análise de transcrição adicional para estudar