זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

הפרוטוקול שאנו מציגים כאן יעזור לנו להבין כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות המחלה האוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית. בשיטה זו, לימפוציטים במוח ניתן ללמוד על בסיס תא אחר תא. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על מודלים אחרים ומחלות מערכת העצבים המרכזית כי צריך לנתח את המאפיינים והתפקודים של תאים חיסוניים.

בסרטון זה, הפרוטוקול יכול בקלות להדגים כיצד לגרום למודל ולבודד תאים בודדים במוח. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה, להשתמש מזרק אחד מיליליטר להזריק תת עורית C57BL/6 עכברים עם 100 מיקרוגרם של MOG אמולסיה 35-55 ב 100 microliters של הישבן המלא של פרוינד לשני אתרים שונים של הגב ליד הצוואר. באותו יום וביום השני לאחר החיסון, להזריק תוך-אפית את העכברים עם 200 microliters של ננוגרם אחד לכל פתרון רעלן שעלת microliter.

לאחר הזריקה השנייה, מעבירים את העכברים בחזרה לכלוב הביתי שלהם עם כרית חימום וניטור עד לחזרה מלאה. למחרת ולאורך כל המחלה, בדקו ודרגו את כל העכברים בצורה עיוורת לסימנים הנוירולוגיים המתוארים בטבלה ולשינויים במשקל. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, חותכים את הגולגולת בזהירות מהאף לצוואר ומעבירים את המוח של כל חיה מתיבת הגולגולת לצינורות בודדים של 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של מדיום RPMI.

מערבבים היטב את הצינורות כדי להסיר את תאי הדם האדומים החסידים ולהסיר את המדיום על ידי שאיפה. מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום טרי לכל צינור ומעבירים את המוח למנות בודדות של 100 מילימטר. לבסוף קוצצים כל מוח עם סכין גילוח ולהשתמש פיפטה פלסטיק להעביר כמה שיותר רקמה מנה אחת בכל פעם ושישה מיליליטר של מדיום לתוך homogenizer זכוכית ממורכזת 7 מיליליטר.

טוחנים את המוח באמצעות הבוכנה הרופפות של העלי לפני השימוש בבוכנה ההדוקה כדי להביא את הרקמה עד ההשעיה היא הומוגנית. לאחר מכן, יוצקים את תרחיף הרקמה וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר מקורר מראש על קרח. כאשר כל הדגימות כבר homogenized, להתאים את עוצמת הקול בכל צינור לשבעה מיליליטר עם מדיום טרי, לפני הוספת כל השעיית רקמה לצינור חדש מקורר 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של 100% מטריצת קרום מרתף לכל צינור.

מערבבים על ידי היפוך כמה פעמים ולהשתמש פיפטה שלושה מיליליטר בזהירות ולאט לאט להוסיף מיליליטר אחד של 70 אחוז צפיפות פתרון הדרגתי תחת כל מדגם פתרון רקמה. להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ולהסיר כמעט את כל השכבה העליונה, דואג להסיר לחלוטין את כל המירילין. העבר את הממשק לתוך צינור חדש 15 מיליליטר ולהתאים את עוצמת הקול ל 10 מיליליטר עם מדיום טרי.

ואז צנטריפוגה הדגימות שוב ולהסיר את supernatant לפני resuspending כדורי בערך 100 microliters של בינוני לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של תאי המוח שנקטפו, להקצות בערך פעמיים 10 לשישה תאים ב 100 microliters של בינוני לתוך בארות בודדות של צלחת 96 באר. כאשר כל התאים כבר מצופים, להוסיף 100 microliters של קוקטייל גירוי תא 500X בתוספת מעכבי הובלת חלבון ל הבאר ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך ארבע שעות.

בסוף מאגר הדגירה התאים בתחתית בארות על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי ב 100 microliters של חיץ ציטומטריה זרימה לכל באר. מקדים את התאים עם שלושה מיקרוליטרים של בלוק CD16/CD32 נגד עכברים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני הכתמה. כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות של Fc..

בסוף הדגירה, מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המעניין כל באר ומ מניחים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס המוגנות מפני אור. לאחר 30 דקות, לשטוף את בארות עם 100 microliters של חיץ cytometry זרימה לכל גם ומציעים את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת העל-טבעיים, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר קיבוע תאי לכל באר.

לאחר דגירה של 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 200 microliters של חיץ חנוניות 1X ל הבאר. צנטריפוגה הדגימות שוב, ולאחר השלכת supernatant, resuspend כדורי ב 100 microliters עם חיץ permeabilization טרי. לאחר מכן, להוסיף את הנוגדנים המתאימים לגילוי של כל אנטיגנים תאיים של עניין עבור דגירה 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של חיץ 1X permeabilization לכל באר ולסובב את הדגימות על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, בצע שימוש חוזר בתאי הכתם ב- 200 מיקרוליטרים של מאגר הכתמים של ציטומטריית זרימה ונתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. קורס קליני טיפוסי של EAE צריך לגרום עקומת מחלה ושינוי במשקל הגוף כפי שמודגם.

C57BL/6 עכברים מחוסנים עם MOG 35-55 בדרך כלל מתחילים לפתח תסמיני מחלה סביב היום 10 עד 12 ולהשיג את שיא המחלה סביב היום 15 עד 21. לפני הופעת המחלה, משקל הגוף של עכברים מחוסנים עולה בהדרגה לפני ירידה בקורלציה עם תסמיני המחלה הגוברת העכברים מדגימים את משקל הגוף הנמוך ביותר בשיא EAE, כאשר משקולות הגוף מתאוששות מעט ככל שהתסמינים הקליניים יורדים. העכברים בדרך כלל לא להתאושש באופן מלא עם זאת ובדרך כלל להמשיך לפתח פתולוגיה מחלה כרונית מונופאסיקית.

כפי שממחיש ניתוח זרימה מייצג זה, תאי Th1 ו- Th17 המייצרים אינטרפרון גמא ו- IL17 גדלים באופן משמעותי בעכברי EAE. הצעד החשוב ביותר הוא 3.10. המפעיל צריך להעביר את השכבה האמצעית ואת האור, להיות בזהירות, לקחת כמה שכבות אחרות ככל האפשר.

בעקבות פרוטוקולים אלה, אנו יכולים לקדם לימפוציטים T לניתוח שעתוק נוסף ללמוד