प्रायोगिक ऑटोइम्यून एंसेफेलोयलाइटिस के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में लिम्फोसाइट घुसपैठ का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण

हम यहां जो प्रोटोकॉल पेश करते हैं, वह हमारे लिए यह समझने में मददगार होगा कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ऑटोइम्यून रोग के विकास में लिम्फोसाइट्स कैसे शामिल हैं। इस विधि के साथ, मस्तिष्क में लिम्फोसाइट्स का अध्ययन कोशिका आधार द्वारा कोशिका पर किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य मॉडलों और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग पर भी लागू किया जा सकता है जिन्हें प्रतिरक्षा कोशिकाओं की विशेषताओं और कार्यों का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।

इस वीडियो में, प्रोटोकॉल आसानी से प्रदर्शित कर सकता है कि मॉडल को कैसे प्रेरित किया जाए और मस्तिष्क में एकल कोशिकाओं को अलग किया जाए। पेडल पलटा के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के बाद, एक मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए चमड़े का ढंग से एनेस्थेटाइज्ड C57BL/6 चूहों के साथ पायसिफाइड MOG 35-55 के १०० माइक्रोलीटर में गर्दन के पास पीठ के दो अलग साइटों में पूर्ण Freund के adjuvant । एक ही दिन और दो पोस्टइम्यूनाइजेशन पर, इंट्रापेरिटोनेली चूहों को एक नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर पर्टुसिस टॉक्सिन वर्किंग सॉल्यूशन के 200 माइक्रोलीटर के साथ इंजेक्ट करता है।

दूसरे इंजेक्शन के बाद, चूहों को एक वार्मिंग पैड और पूर्ण recumbency तक निगरानी के साथ अपने घर पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें। अगले दिन और रोग के दौरान, मेज में उल्लिखित न्यूरोलॉजिकल संकेतों के लिए और वजन में किसी भी परिवर्तन के लिए अंधा तरीके से चूहों की जांच और ग्रेड। उपयुक्त प्रायोगिक अंत बिंदु पर, नाक से गर्दन तक सावधानी से कपाल काटें और प्रत्येक जानवर के मस्तिष्क को कपाल बॉक्स से अलग-अलग 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें आरपीएमआई माध्यम के 10 मिलीलीटर होते हैं।

ट्यूबों को अच्छी तरह से मिलाएं ताकि अनुयायी लाल रक्त कोशिकाओं को हटाया जा सके और आकांक्षा द्वारा माध्यम को हटा दिया जा सके। प्रत्येक ट्यूब में ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और व्यक्तिगत 100 मिलीमीटर व्यंजनों में दिमाग स्थानांतरित करें। अंत में एक रेजर के साथ प्रत्येक मस्तिष्क काट और एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करने के लिए एक समय में एक डिश से ज्यादा ऊतक के रूप में हस्तांतरण और एक आइसकोल्ड सात मिलीलीटर केंद्रित ग्लास समरूप में मध्यम के छह मिलीलीटर ।

जब तक निलंबन सजातीय है ऊतक लाने के लिए तंग प्लंजर का उपयोग करने से पहले मूसल के ढीले प्लंजर का उपयोग कर मस्तिष्क पीसें। फिर, परिणामस्वरूप ऊतक घोल को बर्फ पर पूर्व-ठंडा 15 मिलीलीटर शंकु नली में डालें। जब सभी नमूनों को समरूप किया गया है, ताजा माध्यम के साथ सात मिलीलीटर के लिए प्रत्येक ट्यूब में मात्रा समायोजित, एक नया ठंडा 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए प्रत्येक ऊतक निलंबन जोड़ने से पहले ट्यूब प्रति ट्यूब १००% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के तीन मिलीलीटर युक्त ।

कई बार उलटा करके मिलाएं और ध्यान से तीन मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें और धीरे-धीरे प्रत्येक ऊतक समाधान नमूने के तहत 70 प्रतिशत घनत्व ढाल समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें। घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को अलग करें और लगभग सभी शीर्ष परत को हटा दें, ध्यान रखें कि सभी माइलिन को पूरी तरह से हटा दें। इंटरफ़ेस को एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और ताजा माध्यम के साथ वॉल्यूम को 10 मिलीलीटर में समायोजित करें।

फिर नमूनों को फिर से अपकेंद्री करें और प्रति ट्यूब मध्यम के लगभग 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करने से पहले सुपरनेट को हटा दें। काटा मस्तिष्क कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए, एक ९६-अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में मध्यम के १०० माइक्रोलीटर में छह कोशिकाओं के लिए लगभग दो बार 10 आवंटित । जब सभी कोशिकाओं को चढ़ाया गया है, तो 500X सेल उत्तेजना कॉकटेल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और कुओं में प्रोटीन परिवहन अवरोधक और प्लेट को चार घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।

इनक्यूबेशन पूल के अंत में अपकेंद्रित्र द्वारा कुओं के तल पर कोशिकाओं और प्रवाह साइटोमेट्री बफर प्रति अच्छी तरह से १०० माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च । एंटी-माउस सीडी16/सीडी32 एफसी ब्लॉक के तीन माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को धुंधला होने से पहले चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूर्व-इनक्यूबेट करें । किसी भी गैर-विशिष्ट एफसी-मध्यस्थता बातचीत को अवरुद्ध करने के लिए।

इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से ब्याज की एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें और प्रकाश से संरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर प्लेट रखें। 30 मिनट के बाद, कुओं को प्रवाह साइटोमेट्री बफर के 100 माइक्रोलीटर के साथ अच्छी तरह से धोएं और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को तलछट दें। सुपरनेटेंट को त्यागने के बाद, प्रत्येक कुएं में इंट्रासेलुलर फिक्सेशन बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।

कमरे के तापमान पर 30 से 60 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, अपकेंद्रित्र द्वारा नमूनों को इकट्ठा करें और 1X पारगम्यता बफर प्रति अच्छी तरह से 200 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें। नमूनों को फिर से अपकेंद्री करें, और सुपरनेट को त्यागने के बाद, ताजा परमीबिलाइजेशन बफर के साथ 100 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें। इसके बाद, प्रकाश से सुरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेशन के लिए ब्याज के किसी भी इंट्रासेलुलर एंटीजन का पता लगाने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें।

इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं में 1X पारमेबिलाइजेशन बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और अपकेंद्रित्र द्वारा नमूनों को स्पिन करें। फिर, फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग बफर के 200 माइक्रोलीटर में दाग कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें। EAE के एक ठेठ नैदानिक पाठ्यक्रम के परिणामस्वरूप रोग वक्र और शरीर के वजन में परिवर्तन होना चाहिए जैसा कि सचित्र है।

C57BL/6 चूहों MOG 35-55 के साथ प्रतिरक्षित आमतौर पर 10 से 12 दिन के आसपास रोग के लक्षण विकसित करने के लिए और 15 से 21 दिन के आसपास रोग के शिखर को प्राप्त करने के लिए शुरू करते हैं । रोग की शुरुआत से पहले, प्रतिरक्षित चूहों के शरीर का वजन धीरे-धीरे बढ़ती बीमारी के लक्षणों के साथ संबंध में कम होने से पहले बढ़ता है चूहों EAE के चरम पर सबसे कम शरीर के वजन का प्रदर्शन, शरीर के वजन के साथ थोड़ा ठीक होने के साथ नैदानिक लक्षण कम हो जाते हैं । चूहे आमतौर पर पूरी तरह से ठीक नहीं होते हैं और आमतौर पर मोनोफेसिक क्रोनिक डिजीज पैथोलॉजी विकसित करने के लिए जाते हैं।

जैसा कि यह प्रतिनिधि प्रवाह विश्लेषण दिखाता है, इंटरफेरॉन गामा-उत्पादन Th1 और IL17-उत्पादक Th17 कोशिकाओं को EAE चूहों में काफी वृद्धि हुई है। सबसे महत्वपूर्ण कदम 3.10 है। ऑपरेटर को मध्य परत और प्रकाश को स्थानांतरित करना चाहिए, ध्यान से, कुछ अन्य परतों के रूप में संभव के रूप में लेना चाहिए।

इन प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हम अध्ययन करने के लिए आगे ट्रांसक्रिप्शन विश्लेषण के लिए टी लिम्फोसाइट्स को आगे कर सकते हैं