Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Protokollen vi presenterer her vil være nyttig for oss å forstå hvordan lymfocytter er involvert i utviklingen av sentralnervesystemet autoimmun sykdom. Med denne metoden kan lymfocytter i hjernen studeres på cellebasis. Denne protokollen kan også brukes på andre modeller og sentralnervesystemet sykdom som trengs for å analysere egenskapene og funksjonene til immunceller.

I denne videoen kan protokollen enkelt demonstrere hvordan man induserer modell og isolerer enkeltceller i hjernen. Etter å ha bekreftet mangel på respons på pedalrefleks, bruk en en milliliter sprøyte til subkutant injisere bedøvet C57BL/6 mus med 100 mikrogram emulgert MOG 35-55 i 100 mikroliter av komplett Freund adjuvant i to forskjellige steder av ryggen nær nakken. På samme dag og på dag to postimmunisering injiserer intraperitoneally musene med 200 mikroliter av ett nanogram per mikroliter kikhostetoksin arbeidsløsning.

Etter den andre injeksjonen, overfør musene tilbake til deres hjem bur med en oppvarming pad og overvåking til full recumbency. Neste dag og gjennom hele sykdomsforløpet, undersøk og vurder alle musene på en blindet måte for nevrologiske tegn som er skissert i bordet og for eventuelle endringer i vekt. Ved riktig eksperimentelt endepunkt, kutt kraniet forsiktig fra nesen til nakken og overfør hjernen til hvert dyr fra kranieboksen til individuelle 50 milliliter rør som inneholder 10 milliliter RPMI-medium.

Bland rørene godt for å fjerne de tiltalende røde blodlegemene og fjern mediet ved aspirasjon. Tilsett 10 milliliter friskt medium til hvert rør og overfør hjernen til individuelle 100 millimeter retter. Til slutt hogge hver hjerne med en barberhøvel og bruke en plastpipette for å overføre så mye vev fra en tallerken om gangen og seks milliliter medium inn i en iskuld syv milliliter sentrert glass homogenisator.

Grind hjernen ved hjelp av det løse stempelet av pestle før du bruker det stramme stempelet for å bringe vevet til suspensjonen er homogen. Hell deretter den resulterende vevsslamen i et forkjølt 15 milliliter konisk rør på is. Når alle prøvene er homogenisert, juster volumet i hvert rør til syv milliliter med friskt medium, før du legger hver vevssuspensjon til et nytt kjølt 15 milliliter rør som inneholder tre milliliter på 100% kjellermembranmatrise per rør.

Bland ved inversjon et par ganger og bruk en tre milliliter pipette for å forsiktig og sakte legge til en milliliter 70 prosent tetthet gradient løsning under hver vev løsning prøve. Skill cellene etter tetthetsgradering sentrifugering og fjern nesten alle de øverste lagene, og ta vare på å fjerne all myelin helt. Overfør grensesnittet til et nytt 15 milliliter rør og juster volumet til 10 milliliter med friskt medium.

Sentrifuger deretter prøvene igjen og fjern supernatanten før du gjenbruker pellets i ca 100 mikroliter medium per rør. For strømningscytokometrisk analyse av de høstede hjernecellene, alloker omtrent to ganger 10 til de seks cellene i 100 mikroliter medium til individuelle brønner av en 96-brønnsplate. Når alle cellene er belagt, tilsett 100 mikroliter med 500X cellestimuleringscocktail pluss proteintransporthemmere til brønnene og legg platen i cellekulturinkubatoren i fire timer.

På slutten av inkubasjonsbassenget har cellene på bunnen av brønnene ved sentrifugering og gjenoppuspend pellets i 100 mikroliter av strømningscytometribuffer per brønn. Forhåndsinkuber cellene med tre mikroliter antimus CD16/CD32 Fc Block i 10 minutter ved fire grader Celsius før farging. For å blokkere eventuelle uspesifikke Fc-medierte interaksjoner.

På slutten av inkubasjonen, legg til antistoffcocktailen av interesse for hver brønn og legg platen på fire grader Celsius beskyttet mot lys. Etter 30 minutter vasker du brønnene med 100 mikroliter av strømningscytometribuffer per brønn og sedimenter cellene ved sentrifugering. Etter å ha kastet supernativa, legg til 200 mikroliter intracellulær fikseringsbuffer til hver brønn.

Etter en 30 til 60 minutters inkubasjon ved romtemperatur, samle prøvene ved sentrifugering og gjenbruk pellets i 200 mikroliter av 1X permeabilitet buffer per brønn. Sentrifuge prøvene igjen, og etter å ha kastet supernatanten, resuspend pellets i 100 mikroliter med fersk permeabiliseringbuffer. Deretter legger du til de riktige antistoffene for påvisning av intracellulære antigener av interesse for en 30 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius, beskyttet mot lys.

På slutten av inkubasjonen legger du til 100 mikroliter 1X permeabiliseringsbuffer til hver brønn og spinner ned prøvene ved sentrifugering. Deretter gjenbruker flekkcellene i 200 mikroliter av strømningscytometrifargingsbuffer og analyser cellene ved strømningscytometri i henhold til standardprotokoller. Et typisk klinisk kurs i EAE bør resultere i en sykdomskurve og endring i kroppsvekt som illustrert.

C57BL/6 mus immunisert med MOG 35-55 begynner vanligvis å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10 til 12 og oppnå toppen av sykdommen rundt dag 15 til 21. Før sykdomsutbruddet øker kroppsvekten til immuniserte mus gradvis før den avtar i sammenheng med de økende sykdomssymptomene Musene viser den laveste kroppsvekten på toppen av EAE, med kroppsvekter som gjenoppretter litt etter hvert som de kliniske symptomene reduseres. Musene gjenoppretter vanligvis ikke helt, og fortsetter vanligvis å utvikle en monofasisk kronisk sykdomspatologi.

Som denne representative flytanalysen illustrerer, økes interferon gammaproduserende Th1- og IL17-produserende Th17-celler betydelig i EAE-mus. Det viktigste trinnet er 3,10. Operatøren skal overføre mellomlaget og lyset, være forsiktig, ta så få andre lag som mulig.

Etter denne protokollen kan vi ytterligere T-lymfocytter for videre transkripsjonsanalyse for å studere