Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit
Chapters
Summary November 17th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta manuskript presenterar ett protokoll för att inducera aktiva experimentella autoimmuna encefalomyelit (EAE) i möss. En metod för isolering och karakterisering av de infiltrerade lymfocyterna i centrala nervsystemet (CNS) presenteras också för att visa hur lymfocyter är involverade i utvecklingen av CNS autoimmun sjukdom.
Transcript
Det protokoll vi presenterar här kommer att vara till hjälp för oss att förstå hur lymfocyter är inblandade i utvecklingen av det centrala nervsystemet autoimmun sjukdom. Med denna metod kan lymfocyter i hjärnan studeras studeras på en cell för cell basis. Detta protokoll kan också tillämpas på andra modeller och centrala nervsystemet sjukdom som behövs för att analysera egenskaper och funktioner hos immunceller.
I den här videon kan protokollet enkelt visa hur man inducerar modell och isolerar enstaka celler i hjärnan. Efter att ha bekräftat en brist på svar på pedal reflex, använd en en milliliter spruta för att subkutant injicera sövda C57BL/6 möss med 100 mikrogram emulgerade MOG 35-55 i 100 mikroliter av komplett Freunds adjuvant i två olika platser i ryggen nära halsen. Samma dag och dag två postimmunisering injicerar intraperitoneally mössen med 200 mikroliter av ett nanogram per mikroliter per pertussis toxin arbetslösning.
Efter den andra injektionen, överför mössen tillbaka till deras hem bur med en uppvärmning pad och övervakning tills full recumbency. Nästa dag och under hela sjukdomsredningen, undersöka och gradera alla möss på ett förblindat sätt för de neurologiska tecken som beskrivs i tabellen och för eventuella förändringar i vikt. Vid lämplig experimentell endpoint skär man kraniet försiktigt från näsan till halsen och överför hjärnan hos varje djur från kraniallådan till individuella 50 milliliterrör som innehåller 10 milliliter RPMI-medium.
Blanda rören väl för att ta bort de vidhäftande röda blodkropparna och ta bort mediet genom aspiration. Tillsätt 10 milliliter färskt medium till varje rör och överföra hjärnorna till enskilda 100 millimeters rätter. Slutligen hugga varje hjärna med en rakhyvel och använda en plastpipett för att överföra så mycket vävnad från en maträtt i taget och sex milliliter medium till en iskallt sju milliliter centrerad glas homogenisator.
Mala hjärnan med hjälp av den lösa kolven i mortelstöten innan du använder den snäva kolven för att få vävnaden tills suspensionen är homogen. Häll sedan den resulterande vävnadsslamman i en förkyld 15 milliliter konisk röret på is. När alla proverna har homogeniserats, justera volymen i varje rör till sju milliliter med färskt medium, innan du lägger varje vävnad suspension till en ny kyld 15 milliliter rör som innehåller tre milliliter av 100%källaren membranmatris per rör.
Blanda genom inversion några gånger och använd en tre milliliter pipetter för att noggrant och långsamt lägga till en milliliter av 70 procent densitet gradient lösning under varje vävnad lösning prov. Separera cellerna genom densitet gradient centrifugation och ta bort nästan alla av det översta lagret, var noga med att helt ta bort alla myelin. Överför gränssnittet till ett nytt 15 milliliterrör och justera volymen till 10 milliliter med färskt medium.
Sedan centrifugerna proverna igen och ta bort supernatanten innan de återsänder pelletsen i cirka 100 mikroliter medium per rör. För flödescytometrisk analys av de skördade hjärncellerna, fördela ungefär två gånger 10 till de sex cellerna i 100 mikroliter av medium i enskilda brunnar av en 96-brunnsplatta. När alla celler har pläterats, tillsätt 100 mikroliter av 500X cell stimulering cocktail plus proteintransport hämmare till brunnarna och placera plattan i cellkulturen inkubatorn i fyra timmar.
I slutet av inkubationen poolen cellerna i botten av brunnarna genom centrifugering och resuspend pellets i 100 mikroliter av flödescytometri buffert per brunn. Förinkubera cellerna med tre mikroliter av Anti-Mouse CD16/CD32 Fc Block i 10 minuter vid fyra grader Celsius före färgning. Att blockera alla ospecifika Fc-medierade interaktioner.
I slutet av inkubationen, tillsätt antikroppscocktail av intresse till varje brunn och placera plattan vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. Efter 30 minuter, tvätta brunnarna med 100 mikroliter av flödescytometribuffert per brunn och sediment cellerna genom centrifugering. Efter att du har kastat supernatanterna, tillsätt 200 mikroliter av intracellulär fixeringsbuffert till varje brunn.
Efter en inkubering på 30 till 60 minuter vid rumstemperatur, samla in proverna genom centrifugering och återanvända pelletsen i 200 mikroliter av 1X permeabilitetsbuffert per brunn. Centrifugera proverna igen, och efter att ha kasserat supernatanten, resuspend pellets i 100 mikroliter med färsk permeabilisering buffert. Därefter lägger till lämpliga antikroppar för detektion av eventuella intracellulära antigener av intresse för en 30 minuters inkubation vid fyra grader Celsius, skyddad från ljus.
I slutet av inkubationen, tillsätt 100 mikroliter av 1X permeabiliseringsbuffert till varje brunn och snurra ner proverna genom centrifugation. Sedan, resuspend fläcken celler i 200 mikroliter av flödescytometri färgning buffert och analysera cellerna genom flödescytometri enligt standardprotokoll. En typisk klinisk kurs av EAE bör resultera i en sjukdom kurva och förändring i kroppsvikt som illustreras.
C57BL/6 möss immuniserade med MOG 35-55 brukar börja utveckla sjukdomssymtom runt dag 10 till 12 och uppnå toppen av sjukdom runt dag 15 till 21. Före sjukdomsuppgången ökar kroppsvikten hos immuniserade möss gradvis innan de minskar i samband med de ökande sjukdomssymtomen Mössen visar den lägsta kroppsvikten på toppen av EAE, med kroppsvikter som återhämtar sig något när de kliniska symtomen minskar. Mössen brukar inte återhämta sig helt dock och brukar vanligtvis fortsätta att utveckla en monofasisk kronisk sjukdom patologi.
Som denna representativa flödesanalys illustrerar, är interferon gammaproducerande Th1- och IL17-producerande Th17-celler signifikant ökade hos EAE-möss. Det viktigaste steget är 3.10. Operatören bör överföra mellanlager och ljuset, är noga, ta så få andra lager som möjligt.
Efter dessa protokoll kan vi ytterligare T-lymfocyter för ytterligare transkriptionsanalys för att studera
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
