This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source
Chapters
Summary February 26th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterar en omfattande guide till förberedelse av fasta målprover, datainsamling och databehandling för seriell synkrotronkristallografi vid Diamond beamline I24.
Transcript
Seriell synkrotronkristallografi, eller SSX, är ett relativt nytt och snabbt utvecklande område i MX.Det är mycket väl lämpat för experiment med låg dos och rumstemperatur, men kanske viktigast av allt, det är verkligen väl lämpat för att följa dynamiken. Detta gör det möjligt att göra stop motion-filmer av proteiner i aktion. På I24 är flera lägen för SSX tillgängliga.
Detta protokoll fokuserar på SSX med fast mål, vilket möjliggör ett brett utbud av seriella experiment med begränsade mängder prov. Silikonchipsen kan skadas vid lastning och rengöring av dem, om du inte känner till dem. Chipjusteringsprotokollet är också helt nytt för många kristallografer, och databehandlingen skiljer sig något från dina vanliga rotationsdata.
För att förbereda en spånhållare, skär två ark polyesterfolie i cirka 6 av 6 centimeter kvadrater och placera arken över de två basplattorna. Använd metalltätningsringar, fixera arken på plats och dra sedan försiktigt på överskottsfolien för att ta bort eventuella veck. Välj sedan ett kiselchip med öppningar i lämplig storlek i förhållande till storleken på kristallerna som ska analyseras.
Glow ladda ur chipet i 25 sekunder vid 0,39 millibar, med en 15 milliampere ström. Använd pincett för att placera kiselchipet på spånbelastningssteget, med de upphöjda stängerna vända nedåt. Applicera sedan 200 mikroliter av mikrokristallslammet på den plana sidan av chipet med hjälp av en pipett och sprid slammet för att täcka alla stadsblock i chipet.
Om chipet är skadat, täck eventuella hål med en liten bit polyesterfolie för att säkerställa att ett jämnt vakuum kan appliceras. Applicera sedan ett mjukt vakuum för att aspirera all överskottsvätska genom chipet. Ta bort spånet från spånbelastningssteget och fläcka försiktigt undersidan av chipet med filterpapper för att avlägsna överflödig vätska.
Placera det laddade chipet på den större halvan av spånhållaren mellan styrmärkena, platt sida nedåt. Placera den lilla halvan av spånhållaren på chipet för att försegla det. De två halvorna av spånhållaren ska snäppa på plats.
Sedan, med hjälp av hexbultar, fixera chipet ordentligt på plats. För att justera chipet, håll spånhållaren i 30 graders vinkel medan du närmar dig fästet. Använd sedan de kinematiska fästena för att placera det laddade chipet på XYZ-scenen vid strållinjen.
När magneterna kommer i kontakt, låt spånhållaren rotera parallellt med flödet och klicka på plats. När chipet har placerats, använd strållinjens visningssystem på axeln och det grafiska användargränssnittet för chipjustering för att hitta chipets övre vänstra fidukial. Om du vill centrera på fiducial 0 i X, Y och Z, flytta in och ut ur fokus för att justera Z, upp och ner för att justera Y, och vänster och höger för att justera X.Sedan klicka på Ställ in fidukiell 0"Efter justering av fiducial 1 och 2 med röntgenstrålen på samma sätt klickar du på Gör koordinatsystem"för att generera en koordinatmatris.
Klicka sedan på Blockera kontroll"för att flytta XYZ-scenen till den första brunnen i varje stadsblock. Om röntgenkorset ligger i linje med bländarna är chipet justerat. I den här grafiska representationen av spotsökningsresultat från DIALS kan en uppdatering av träfffrekvensdiagram observeras.
Om du klickar på en träff visas motsvarande diffraktionsbild i bildvisaren RATTAR. I den här tabellen kan aktuella indexerings- och integrationshastigheter som uppdateras i realtid när data samlas in under besöket visualiseras. Visualisering av enhetscellparametrarna kan avslöja polymorfer.
Tvådimensionella tomter med användbara parametrar kan också produceras för att avslöja variationer som uppstår på grund av belastning eller uttorkningseffekter. Stereografiska projektioner kan avslöja närvaron eller frånvaron av föredragna orienteringar som kan matas tillbaka till laddningsprotokollet. Till exempel i denna projektion kan effekterna av överbelastning av ett chip med lysozzymkristaller observeras.
Vid lastning av chipet, pipettera långsamt och använd fingret för att vila pipetten ovanför chipet. Detta förhindrar att du vidrör chipet och oavsiktligt hugger hål i kiseln. När du bearbetar data bör du använda de automatiserade pipelines som är tillgängliga.
Detta ger dig en bra uppfattning om hur ditt experiment fortskrider och om du behöver variera något. Denna metod kan tillämpas på alla proteinsystem som kan kristalliseras i betydande mängder. Och reaktionen kan utlösas av ljusröntgen eller snabb blandning.
Dynamiska studier på en serie strukturer kan ge insikt i hur proteiner fungerar.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
