Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR
Chapters
Summary March 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.
Transcript
بروتوكول المختبر لدينا تمكن من الجمع بين تحرير الجينوم البشري مع العلاج بالخلايا CAR T. الإجراء المختبري هو النهج مع CRISPR-Cas9 في استهداف ما يصل إلى ثلاثة جينات بكفاءة عالية. وأخيرا، نهجنا قادر على أن يترجم إلى تجارب سريرية بشرية.
ويمكن تطبيق الأساليب الموصوفة على البنى الأخرى في جمهورية أفريقيا الوسطى والجينات المستهدفة. وأساس هذه التقنيات قوي بما يكفي لترجمتها إلى نطاق أوسع وإلى المتعاونين الأكاديميين والمتعاونين في الصناعة من أجل مواصلة التطوير. عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، حدد عدد المجموعات في شاشة RNA الدليل لتمكين أوقات الحضانة الدقيقة.
وقد ثبت أن الالتزام بظروف الثقافة وكثافة البذر كما هو موضح أمر بالغ الأهمية في تجربتنا. للبدء، والحصول على خلايا الدم المحيطي أحادية النوى، أو PBMCs، من المتبرعين المتطوعين الأصحاء وعزل CD4 و CD8 الخلايا التائية الإيجابية باستخدام CD4 و CD8 المتاحة تجاريا مجموعات الاختيار. الجمع بين CD4 إيجابية وCD8 الخلايا التائية الإيجابية في نسبة واحدة إلى واحدة واحتضان 3 ملايين خلية لكل ملليلتر في R10, تكملها مع 5 نانوغرام لكل ملليلتر من كل IL7 الإنسان وIL15 الإنسان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، عد الخلايا التائية والطرد المركزي 5 إلى 10 ملايين خلية في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل جميع supernatant وغسل بيليه الخلية في انخفاض وسائل الإعلام الأساسية المصل الحد الأدنى. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من محلول المودة النووية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
أثناء غسل الخلايا، قم بإعداد ريبونوكليوبروتين، أو مجمع RNP، عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نواة Cas9 مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي دليل واحد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تضمين تحكم وهمية دون RNA دليل واحد. الجمع بين الخلايا إعادة تعليقها مع مجمع RNP وإضافة 4.2 ميكرولتر من أربعة محسن الكهربائي ميكرومولار.
تخلط جيدا ونقلها إلى cuvettes الكهارل. Electroporate الخلايا باستخدام رمز النبض EH111، ثم احتضان 5 ملايين خلية لكل ملليلتر في R10، تكملها 5 نانوغرام لكل ملليلتر IL7 الإنسان وIL15 الإنسان في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 12 لوحات الآبار. بعد الحضانة، تابع تفعيل الخلايا التائية وتوسيعها.
تصميم التمهيديات التسلسل عن طريق إدخال تسلسل amplicon PCR في برنامج تصميم التمهيدي القياسية. سيقترح برنامج التصميم تسلسلات التمهيدي متعددة مناسبة لتسلسل سانجر. اختيار التمهيديات الأمامية وعكس التي تربط مع amplicon ما لا يقل عن 150 أزواج قاعدة المنبع أو المصب من موقع خفض الجيش الملكي النيبالي لضمان جودة تسلسل جيدة حول indels.
استخدم تحليل TIDE للكشف عن كفاءة خروج المغلوب على مستوى الجينوم. تقوم الخوارزمية بدقة بإعادة بناء طيف ال indels من آثار التسلسل وتحسب القيم المربعة R. بعد التنشيط، يتم توسيع الخلايا التائية في الثقافة و cryopreserved للدراسات المستقبلية.
خلال التوسع، يتم تتبع تضاعف عدد السكان وتغيرات الحجم في جميع أنحاء البروتوكول لكل من الخلايا التائية وهمية وتحريرها CAR. ولم تكتشف أي تغييرات هامة في الانتشار والتنشيط أثناء التوسع. مرة واحدة كانت cryopreserved الخلايا، تم تحديد مستويات التعبير CAR لمزيد من الدراسات الوظيفية لكل من الخلايا وهمية تحريرها خروج المغلوب CAR T.
ولم تلاحظ أي تغييرات هامة. يمكن تحديد كفاءة خروج المغلوب باستخدام تقنيات متعددة. في هذه المؤامرات قياس التدفق التمثيلي، تم استهداف PDCD1 وTRAC loci باستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد، مما يدل على كفاءة 90٪ لدليل PDCD1 واحد الجيش الملكي النيبالي و 98٪ لدليل واحد RNA TRAC عبر العديد من المتبرعين الأصحاء.
من المهم التأكد من أن نسب الضرس من Cas9 وتوجيه RNAs دقيقة. أثناء الإجراء ، يجب أن تبقى الخلايا دائما عند أربع درجات مئوية ولا تترك في محلول الكهربوفيروس لفترات طويلة من الزمن. بعد الحفاظ على CAR، يمكن استخدام خلايا CAR T المهندسة CRISPR لإجراء فحوصات وظيفية داخل المختبر وفي الجسم الحي، مثل المقايسات السمية الخلوية وإنتاج السيتوكين ونماذج الماوس السرطانية المتجانسة أو الزينوغرافية.
نهجنا باستخدام تكنولوجيا CRISPR Cas9 يتم تطبيقه الآن على التجارب السريرية. ويمكن استخدام هذا النهج لكل من السرطان، فضلا عن الاضطرابات الوراثية غير الخبيثة، مثل الهيموغلوبينوفاتات، التي تؤثر على الملايين من الأطفال والبالغين في جميع أنحاء العالم.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
